专利名称：一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物药物制剂领域，涉及高密度脂蛋白类似物纳米粒，具体涉及一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途。
背景技术：
靶向给药是目前药剂学领域的研究热点之一，但多年来转化为产品的研究成果极为少见，其中关键问题之一就是遭遇的药物载体材料的研究瓶颈。因此研究开发新型给药系统载体材料显得尤为重要，其中，脂蛋白由于自身的结构及生理特性成为目前载体材料的研究热点。
现有技术公开了脂蛋白是内源性物质，可彻底生物降解，不引起免疫反应，也不被网状内皮系统快速清除，因此其作为药物载体有诸多优势1)内源性主动靶向，通过受体介导被细胞吸收与内吞；2)是天然成分并具有相对较长的半衰期；3)颗粒体积小，直径在纳米级范围，易从血管内扩散到血管外；4)大容量脂核可作为疏水性药物储存的场所，避免所在药物与血衆中成分相互作用而分解破坏。其中由于高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein HDL)的特殊功能,有望成为新型祀向载体材料。高密度脂蛋白作为肝革巴向载体,高密度脂蛋白(high-density lipoprotein HDL)是血浆中的重要脂蛋白，其生理作用是摄取肝外细胞多余胆固醇并转变成胆固醇酯(CE)贮存于脂核，通过血液运送到肝脏，这个过程称为“胆固醇逆向转运”。该途径是通过肝细胞膜上的特异性受体完成的，Krieger等发现的B族I型清道夫受体(scavenger receptorclass B type I, SR-BI)是目前已阐明一级结构的脂蛋白受体中唯一能真正介导细胞与HDL的受体。HDL颗粒通过肝受体途径内吞入肝细胞内，载脂蛋白与核心胆固醇酯分离，胆固醇酯被肝细胞选择性摄取留在胞内，载脂蛋白通过逆向胞饮分泌到胞外。可见HDL胆固醇(酯)吸收的途径是非溶酶体途径，这样可防止被包裹的药物受到溶酶体酶破坏。有关研究表明，HDL组成成分为载脂蛋白AI(apoA-I，约占70%)，且HDL “胆固醇逆向转运”功能主要是载脂蛋白与肝细胞膜上受体作用，使肝细胞选择性摄取HDL中胆固醇酯来完成的，对HDL特异性受体SR-BI进一步研究表明SR-BI与HDL2，HDL3, apoA/phospholiod圆盘状颗粒和无脂载脂蛋白有相同结合力，说明SR-BI是和载脂蛋白结合而不是与HDL中的脂质结合，那么理论上说载脂蛋白可作为肝靶向载体材料。以载脂蛋白作为载体，除了具有脂蛋白作为载体的优势外，还具备其独特的优势载脂蛋白受体主要存在于肝细胞膜上，主动靶向性更明确；载脂蛋白本身为血液中成分，生物相容性好；载药系统被内吞至肝细胞内而不是经溶酶体途径，避免了药物被溶酶体破坏；在肝细胞内载脂蛋白与药物分离，药物被肝细胞选择性摄取留在胞内，载脂蛋白通过逆向胞饮分泌到胞外，参与胆固醇代谢，降低心血管疾病风险。因此载脂蛋白作为肝靶向载体将对肝脏疾病的靶向治疗提供有力武器。但目前从人血浆中获得HDL还存在以下主要问题I)血浆来源困难及血液污染问题；2)超速离心分离HDL成本高。以载脂蛋白作为载体，其来源同样面临HDL来源及血缘污染问题的困扰。
发明内容
本发明的目的是提供一种高密度脂蛋白类似物纳米粒，尤其涉及一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途。本发明的高密度脂蛋白类似物纳米粒能提高药物在肝组织的浓度，降低药物对其他组织的损伤，延长药物半衰期，降低用药量或延长给药间隔。本发明采用基因工程技术利用毕赤酵母表达的重组人源载脂蛋白作为靶向载体，模拟体内HDL组成及形成过程，与药物、卵磷脂利用硫酸铵梯度法制备成高密度脂蛋白(HDL)类似物纳米粒。所述的纳米粒是以人源载脂蛋白为靶向载体的肝靶向纳米粒。本发明进一步将毕赤酵母表达的人源载脂蛋白分离纯化后，与抗肿瘤药物/抗乙肝药物、卵磷脂制备成类似HDL的复合物。
具体而言，本发明的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，由重组人源载脂蛋白与卵磷脂、药物按flO 10 :1飞质量比组成肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其中，所述的重组人源载脂蛋白为靶向载体，纳米粒中不含胆固醇。所述的高密度脂蛋白类似物纳米粒粒径为20-150nm。本发明中，所述的重组人源载脂蛋白包括apoAI、apoAII及apoE(选自本领域技术人员知悉的重组人源载脂蛋白)；所述的药物为水溶性、脂溶性且具有抗肝癌、肝炎、肝纤维化的药物。本发明的高密度脂蛋白(HDL)类似物纳米粒复合物可加入保护剂，冷冻干燥制成干粉制剂。本发明的高密度脂蛋白(HDL)类似物纳米粒复合物可进一步制备肝靶向治疗药物。所述的冻干保护剂包括蔗糖、甘露醇；所述的纳米粒与冻干保护剂的质量比为100 :1 20%。本发明的高密度脂蛋白(HDL)类似物纳米粒通过下述方法制备将卵磷脂溶于有机溶剂中，37°C旋转蒸发成膜后，加入硫酸铵溶液，孵育，超声，将所得混悬液过葡聚糖G-50柱，用磷酸盐缓冲液(pH=7. 4)溶液洗脱，收集白色部分，将溶解的药物溶液缓缓加入，保持30min后取出。室温下加入载脂蛋白A- I，混合均匀，恒温水浴孵育，探头超声。透析过夜；加入蔗糖溶液，-70°C预冻过夜，冷冻真空干燥机冻干，得冻干的肝靶向纳米粒。用粒径分析仪测其粒径，平均密度径为lOOnm，平均数目径20nm左右，透射电镜照射显示与数目径显示大小相符。本发明方法中，采用模拟体内HDL形成过程，经硫酸铵梯度法将卵磷脂薄膜分散，然后将药物注入，最后再加入载脂蛋白孵育，利用载脂蛋白盘状的螺旋结构将所述复合物包裹。本发明方法中，所述的有机溶剂为氯仿或二氯乙烷、甲醇的混合物，其比例为
I 1-3。本发明的方法中，硫酸铵的浓度为100_300mM，加药方式为水溶液。本发明方法中，所述的药物与卵磷脂孵育温度为25_37°C，孵育时间为6-18小时。本发明制得的高密度脂蛋白类似物纳米粒，具有肝靶向性，与现有技术比较，具有如下特点其药物复合物包封率为80. 5%，载药率为2. 8%，其药物释放明显低于游离药物和无载脂蛋白的药物卵磷脂复合物，该纳米粒可提高药物在肝组织的浓度，降低药物对其他组织的损伤，延长药物半衰期，降低用药量或延长给药间隔。较好的克服了 HDL来源困难及血液污染问题。
图I显示了本发明中磷脂与apoAI比例对粒径的影响。图2为本发明的透射电镜图。图3显示了本发明中的体外释放率。图4显示了本发明中的血浆稳定性。
图5显示了本发明中载脂蛋白Al对巨噬细胞的影响。图6显示了本发明中组织分布情况。
具体实施例方式实施例IHDL类似物的制备I. I空白复合物的制备将卵磷脂40mg置于圆底烧瓶中，用二氯乙烷与甲醇5ml(V V=I I)溶解，37°C旋转蒸发成膜后，加入2ml 250mmol硫酸铵溶液,水溶超声IOmin,再于28°C孵育Ih,探头超声lOmin。最后将混悬液过葡聚糖G-50柱，洗脱液为50mM pH=7. 4的PBS溶液，收集白色部分得空白HDL复合物。I. 2药物复合物的制备将4mg盐酸阿霉素溶于Iml去离子水中，在50°C水浴温度下缓缓加入空白复合物中，保持30min后取出。室温下加入溶有2mg载脂蛋白A- I的2ml PBS，混合均匀，37 °C孵育12h后，水浴与探头超声各lOmin，即得。I. 3药物复合物冷冻干燥将药物复合物置于PBS中透析过夜后，向加入质量分数为5%的蔗糖，-70°C预冻过夜，冷冻真空干燥机冻干，即得冻干药物复合物，为橘红色粉末。实施例2HDL类似物表征2. IHDL类似物粒径及形态考察。用粒径分析仪测其粒径，结果如图I和图2所示，平均密度径为lOOnm，平均数目径20nm左右，透射电镜照射显示与数目径显示大小相符。2. 2HDL类似物的包封率考察取500ul实例2. I的粒子溶液于IOml容量瓶中，加入IOOul TritonX-100，定容，然后于紫外分光光度计480nm波长下以同样方法处理实例2. 2制备的空白HDL复合物作为对照测其吸收值。包封率和载药率以公式(I)和(2)计算
权利要求
1.一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，由重组人源载脂蛋白与卵磷月旨、被载药物按I 10 10 1 5质量比组成肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其中，所述的重组人源载脂蛋白为靶向载体。
2.按权利要求I所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒粒径为50-150nm。
3.按权利要求I所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，所述的重组人源载脂蛋白选自apoAI、apoAII或apoE。
4.按权利要求I所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，所述的被载药物为水溶性、脂溶性的抗肝癌、肝炎或肝纤维化药物。
5.制备权利要求I所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒的方法，其特征在于，其包括步骤 将卵磷脂溶于有机溶剂中，37°C旋转蒸发成膜后，加入硫酸铵溶液，孵育，超声，将所得混悬液过葡聚糖G-50柱，用磷酸盐缓冲液pH=7. 4溶液洗脱，收集白色部分，将溶解的药物溶液缓缓加入，保持30min后取出，室温下加入载脂蛋白A- I，混合均匀，恒温水浴孵育，探头超声，透析过夜，加入冻干保护剂，-70°C预冻过夜，冷冻真空干燥机冻干，得肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒。
6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的冻干保护剂制选自蔗糖或甘露醇，与所述的类似物纳米粒的质量比例为1_20%。
7.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为氯仿/二氯乙烷、甲醇的混合物，其比例为I : 1-3。
8.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的药物与卵磷脂孵育温度为25-37°C，孵育时间为6-18小时。
9.权利要求I的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒在制备肝靶向治疗药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物药物制剂领域，涉及高密度脂蛋白类似物纳米粒，具体涉及一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法。本发明以重组人源载脂蛋白为靶向载体，与被载药物按1～10∶10∶1～5质量比制成肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，制得的类似物纳米粒，具有肝靶向性，与现有技术比较，其药物复合物包封率为80.5%，载药率为2.8%，其药物释放明显低于游离药物和无载脂蛋白的药物卵磷脂复合物，本发明的类似物纳米粒可进一步制备肝靶向治疗药物。该纳米粒可提高药物在肝组织的浓度，降低药物对其他组织的损伤，延长药物半衰期，降低用药量或延长给药间隔。较好的克服了HDL来源困难及血液污染问题。
文档编号A61P1/16GK102846551SQ20121020416
公开日2013年1月2日 申请日期2012年6月19日 优先权日2011年6月28日
发明者冯美卿, 袁媛, 王维娜, 叶丽, 周佩 申请人:复旦大学