专利名称：和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂和新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域领域，涉及和厚朴酚或其药学上可接受的盐的新用途，以及含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，新用途具体为制备治疗角化性皮肤病、自身免疫性疾病的药物中的用途。
背景技术：
和厚朴酌·，英文名为Honokiol,化学名为3’，5_ 二 _2_丙稀基-1，I’ _联苯-2，4’-二酌·。它是从厚朴Magnolia officinalis Rehd. et ffils.的皮中提取分离出来的一种具有广泛生物活性的小分子化合物，其主要生物活性包括抗微生物、抗氧化、抗焦虑、抗抑郁和抗血栓。近年来，新的研究显示和厚朴酚具有很强的抗肿瘤活性，其中抗肿瘤
作用的机制之一在于抑制血管生成。发明人经过实验研究发现了新的作用，即可用于治疗角化性皮肤病、自身免疫性疾病，而上述两种作用也没有被现有文献报道，属于和厚朴酚的新应用。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题是提供和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备治疗角质化过度的药物中的新用途。进一步的，利用该新用途，提供和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备治疗角化性皮肤病的药物中的新用途。发明人通过K14-VEGF转基因牛皮癣小鼠动物模型(购自美国杰克逊实验室，后由四川大学生物治疗国家重点实验室配种、传代与饲养)代表角化性皮肤病模型研究发现，和厚朴酚或其药学上可接受的盐可明显减轻模型小鼠耳朵表皮浮肿、促进表皮变薄、减弱角质化不全等现象。发明人还通过心得安豚鼠模型代表角化性皮肤病模型研究发现，和厚朴酚或其药学上可接受的盐和阳性药物均可明显使豚鼠其耳背红肿减轻、角质层显著变薄、角质化过度变轻、颗粒层连续成行分布、棘层显著比模型组变薄、基底细胞表皮突也变得平坦且真皮乳头上升成杆状现象较少。和厚朴酚或其药学上可接受的盐治疗的豚鼠耳朵皮肤恢复效果比阳性药物好。可应用的角化性皮肤病为鱼鳞病、打泡性表皮松懈症、牛皮癣、着色性干皮症、毛囊角化病、汗孔角化症、掌跖角化症、进行性对称性红斑角皮症、绝经期角皮症、剥脱性角质松懈症、蟾皮症、硬皮病中的任意一种。本发明所解决的第二个技术问题是提供和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备具有免疫抑制作用的药物中的新用途。发明人同样通过K14-VEGF转基因牛皮癣小鼠动物模型代表自身免疫性疾病模型研究发现，和厚朴酚或其药学上可接受的盐可以降低动物血清中IFN-Y、TNF-α分泌水平，而对IL-2、IL-4和IL-IO几乎无影响。进一步对小鼠耳朵组织中IFN- y、TNF- α基因表达水平进行研究，结果也显示和厚朴酚或其药学上可接受的盐可以抑制IFN-Y、TNF-a的mRNA表达水平。对和厚朴酚或其药学上可接受的盐免疫抑制的靶细胞研究结果显示和厚朴酚或其药学上可接受的盐是通过下调淋巴细胞中⑶3+Τ细胞、⑶4+Τ细胞的表达，进一步下调Thl细胞的表达来发挥免疫抑制作用，尤其是可用于治疗牛皮癣。而且在研究和厚朴酚或其药学上可接受的盐具有药理作用的过程中发现，以和厚朴酚为主要活性成分或唯一活性成分，制成外用制剂时可实现治疗角化性皮肤病和自身免疫性疾病的目的。本发明所解决的第三个技术问题是利用和厚朴酚或其药学上可接受的盐的新的药用用途，制成以和厚朴酚或其药学上可接受的盐为主要活性成分或唯一活性成分，加入药剂学常用辅料制成的外用制剂。本发明外用制剂中，含有下述重量百分比的组分和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10%高效皮肤渗透促进剂0.1% 10%。其中，所述的高效皮肤渗透促进剂为水溶性氮酮、丙二醇、薄荷脑中的一种或其混合物。本发明外用制剂中，还含有重量百分比为O. OOP/o-O. 05%防腐剂，即和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10%高效皮肤渗透促进剂0.1% 10%防腐剂O. 001%-0· 05%。和厚朴酚药学上可接受的盐可采用和厚朴酚二钠盐、和厚朴酚二甲盐等。外用制剂中还可加入外用制剂常用的、常规用量的辅料。制成如乳膏、涂剂、搽剂、洗剂等外用制剂。利用上述和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂可以实现以透皮给药的途径治疗角化性皮肤病和自身免疫性疾病的目的，而且透皮作用明显，治疗鱼鳞病、打泡性表皮松懈症、牛皮癣、着色性干皮症、毛囊角化病、汗孔角化症、掌跖角化症、进行性对称性红斑角皮症、绝经期角皮症、剥脱性角质松懈症、蟾皮症、硬皮病的效果显著，为临床治疗提供了一种全新的选择。
图I治疗4周后K14-VEGE转基因小鼠耳部成像图2治疗2周后小鼠耳朵(H&E，X 200)图3治疗4周后小鼠耳朵(H&E，X 200)图4治疗6周后小鼠耳朵(H&E，X 200)图5治疗12天后豚鼠耳朵染色(H&E，X200)图6 清 IFN- Y 水平(*，ρ < O. 05vs 模型；**，ρ < O. Olvs 模型)图7 清 TNF- α 水平(*，ρ < O. 05vs 模型；**，ρ < O. Olvs 模型)图8 清 IL-2 水平(*，ρ < O. 05vs 模型；林，ρ < O. Olvs 模型)图9 清 IL-4 水平(*，ρ < O. 05vs 模型；林，ρ < O. Olvs 模型)图10RT-PCR检测K14-VEGF转基因小鼠耳部IFN- Y和TNF- a mRNA的表达图11治疗4周后小鼠耳朵中E-selectin (选择素-E)的表达(X200)图12治疗4周后小鼠耳朵中ICAM-I的表达(X 200)图13治疗4周后小鼠耳朵中VCAM-I的表达(X 200)
图14治疗4周后小鼠耳朵中VEGFR-2的表达(X 200)图15治疗4周后小鼠耳朵中VEGFR-2的磷酸化水平(X 200)图16治疗4周后小鼠耳朵中AKT的磷酸化水平(X 200)图17治疗4周后 小鼠耳朵中ERK1/2的磷酸化水平(X 200)图18治疗4周后小鼠耳朵中p38的磷酸化水平(X 200)其中，FVB/N代表的是正常老鼠组。
具体实施例方式以下通过对本发明具体实施方式
的描述说明但不限制本发明。为了利用本发明的新用途，即和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备治疗角化性皮肤病和自身免疫性疾病的药物中的用途，以和厚朴酚或其药学上可接受的盐为活性成分制成外用制剂。该外用制剂的关键在于将厚朴酚或其药学上可接受的盐与高效皮肤渗透促进剂配合使用，达到快速渗透、吸收、发挥药效的目的。本发明外用制剂中含有下述重量百分比的组分和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10%高效皮肤渗透促进剂O. 1% 10%。其中，高效皮肤渗透促进剂为水溶性氮酮、丙二醇、薄荷脑中的一种或其混合物。上述外用制剂中还可以加入重量百分比为O. 001-0. 05%的防腐剂。外用制剂中还含有外用制剂常用的、常规用量的辅料，常见的剂型有乳膏、涂剂、搽剂、洗剂等外用制剂。“和厚朴酚或其药学上可接受的盐”中“药学上可接受的盐”也可以称为“药用盐”。而从使用的便利性、储存的方便性，发明人决定以乳膏作为典型剂型，实现和厚朴酚或其药学上可接受的盐外用治疗角化性皮肤病和自身免疫性疾病的目的。本发明乳膏的处方及制备方法如下处方
和厚朴酚或其药学上可接受的盐(优选和厚朴酚)0.01% 10%
单硬脂酸甘油酯5% 10%
硬脂酸8% 12%
白凡士林10% 14%
液体石蜡10% 14%
甘油10% 16%
SDS1%
防腐剂0.02%
水36% 48%
高效皮肤渗透促进剂0.1% 10%所述的高效皮肤渗透促进剂选自水溶性氮酮、丙二醇、薄荷脑等，或它们的混合物；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸丙酯等。
制法按处方精密称取油相基质单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液体石蜡，共置于干燥烧杯中，水浴加热至90°C，使其全熔并搅拌均匀即得油相；再按处方准确量取甘油和水共置于另一干燥烧杯中，水浴加热至85°C，再加入SDS、高效皮肤渗透促进剂和防腐剂，使其全溶并搅拌均匀即得水相；将油相缓缓加入水相，边加边搅拌，直至冷却，即得空白乳剂型基质；将和厚朴酚研成细粉，称取适量，溶于少量的二甲基亚砜中(确保最终加入基质中二甲基亚砜的浓度为O. 1%)，然后加入在空白乳剂基质中，搅匀即得和厚朴酚乳膏。发明人通过试验发现，和厚朴酚乳膏的粒度未检出大于50 μ m的粒子，符合中国药典规定的乳膏不得检出大于180 μ m的粒子的要求。其含量测定未超过标示量的909^110%。稳定性考察显示在4V _8°C条件下放置6周稠度和细腻度均适中，粒度也未发现大于50 μ m的粒子，其含量维持在标示量的90%-110%。稳定性考察也显示在30°C ±2°C的条件下放置6周稠度和细腻度均适中，粒度也未发现大于50 μ m的粒子，其含量维持在标示
量的 90%-110%。体外透皮试验结果显示了和厚朴酚乳膏在前6h以较快速率透皮，之后透皮速率减慢，可能是由于透过的和厚朴酚在接受液中处于一种饱和状态。另外此结果也暗示和厚朴酚可以适当地透过皮肤进入血液发挥全身循环作用，剩余大部分较长时间滞留于皮肤外层或者表皮层和真皮层发挥局部治疗作用。该和厚朴酚乳膏在12h内和厚朴酚的透皮吸收率到达20°/Γ30%，而直接采用O. 5%吐温80溶解的游离和厚朴酚在相同条件下12h内和厚朴酚的透皮吸收率不足10%，这显示本发明的和厚朴酚乳膏提高了和厚朴酚的皮肤透皮吸收率，有利于药物发挥更好的治疗作用。实施例I和厚朴酚乳膏的制备处方组成按重量百分比计，单硬脂酸甘油酯(7%)、硬脂酸(10%)、白凡士林(13%)、液体石蜡(12%)、甘油(14%)、SDS (1%)、水溶性氮酮(1%)、对羟基苯甲酸丙酯(O. 02%)、高剂量和厚朴酚乳膏(1%)、中剂量和厚朴酚乳膏(O. 5%)、低剂量和厚朴酚乳膏(O. 1%)、水(余量)。制备步骤按处方精密称取单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液体石蜡共置于干燥烧杯中，水浴加热至90°C，使其全熔并搅拌均匀即得油相；再按处方准确量取甘油和水共置于另一干燥烧杯中，水浴加热至85°C，再加入SDS、水溶性氮酮和对羟基苯甲酸丙酯，使其全溶并搅拌均匀即得水相；将油相缓缓加入水相，边加边搅拌，直至冷却，即得空白乳剂型基质；将和厚朴酚研成细粉，称取适量，溶于少量的二甲基亚砜中(确保最终加入基质中二甲基亚砜的浓度为O. 1%)，然后加入在空白乳剂基质中，搅匀即得O. 1%和厚朴酚乳膏、O. 5%和厚朴酚乳膏和1%和厚朴酚乳膏。实施例2和厚朴酚乳膏的体外透皮试验离体鼠皮的制备将健康SD大鼠处死，用6%硫化钠将大鼠腹部毛脱去，用温生理盐水反复冲洗3次，纱布吸干，剪下腹部皮肤，小心剥离脂肪组织，选取完整皮肤，用生理盐水冲洗干净，浸泡于生理盐水中4° C冰箱保存过夜备用。透皮吸收实验及测定采用透皮吸收试验仪，将离体备用鼠皮放置扩散池的接合部(皮肤角质层朝上，面向供给池；皮肤真皮层朝下，面向接受池)，均匀涂抹含和厚朴酚25 μ g的和厚朴酚乳膏，铁夹夹紧两池，密封好，向接受池加入5mL的pH7. 4PBS (含O. 5%吐温80)到接受液，保证液面与皮肤刚接触且无气泡，开启磁力搅拌，转数为600r/min，37° C水浴循环。加样后分别于0、0. 5、1、2、4、6、8、10、12和24h从接受池取样O. 2mL接受液并弥补等量空白接受液，样品离心后进高校液相色谱仪测定和厚朴酚含量。平行做6份样品。根据下列公式计算累积透皮率(Q) =Q=CnVyMtl (C^C^Ca+Cg+··· +Cn)ο公式中Q为和厚朴酌■累积透皮率，cn为第η次取样以及前面各个时间点取样的和厚朴酚浓度之总和，V为接受池液体总体积，Mtl为皮上涂抹的和厚朴酚量。以O. 5%吐温80溶解的游离和厚朴酚作为对照，进行体外透皮试验。结果显示和厚朴酚乳膏在12h内和厚朴酚的透皮吸收率到达20°/Γ30%，而直接采用O. 5%吐温80溶解的游离和厚朴酚在相同条件下12h内和厚朴酚的透皮吸收率不足10%，这显示本发明和厚朴酚乳膏提高了和厚朴酚的皮肤透皮吸收率，有利于药物发挥更好的治疗作用。、试验例I和厚朴酚在治疗角质化过度及角化性皮肤病方面的用途试验方法I :对筛选出来的K14-VEGF转基因纯合子牛皮癣小鼠和FVB/N小鼠进行
试验分组随机分为13组，每组4只，分别为第I组.FVB/N小鼠(备注该小鼠是K14-VEGF转基因小鼠的野生型鼠种)；第2组.模型组1，涂抹生理盐水2周时间；第3组.模型组2，涂抹生理盐水4周时间；第4组.模型组3，涂抹生理盐水6周时间；第5组.空白基质组I，涂抹空白基质2周时间；第6组.空白基质组2,涂抹空白基质4周时间；第7组.空白基质组3，涂抹空白基质6周时间；第8组.中剂量和厚朴酚组1，涂抹O. 5%和厚朴酚2周时间；第9组.中剂量和厚朴酚组2，涂抹O. 5%和厚朴酚4周时间；第10组.中剂量和厚朴酚组3，涂抹O. 5%和厚朴酚6周时间；第11组.低剂量和厚朴酚组，涂抹O. 1%和厚朴酚4周时间 ’第12组.高剂量和厚朴酚组，涂抹1%和厚朴酚4周时间 ’第13组.阳性药物组，涂抹维A酸乳膏4周时间。除第I组外，其余各组皆用棉签沾取各自药物均匀涂抹K14-VEGF转基因小鼠耳背，每日涂抹I次。按照治疗终止时间，采集样本进行相关检测。治疗4周时各组小鼠耳部成像结果见图I，显示了和厚朴酚明显抑制了 K14-VEGF转基因小鼠耳部牛皮癣的发生发展，呈在剂量依赖性。低剂量和厚朴酚比阳性药物效果略好，皆能改善牛皮癣的症状；中、高剂量和厚朴酚治疗效果更佳，且高剂量和厚朴酚略好于中剂量和厚朴酚。治疗2、4、6周小鼠耳朵H&E染色结果见图2-4，显示了和厚朴酚使K14-VEGF转基因小鼠耳朵表皮浮肿大大减轻,棘层大大变薄,角化不全大大减轻,对牛皮癣的治疗效果呈剂量依赖关系。试验方法2 :以5%心得安乳膏均匀涂抹豚鼠两侧耳背，每日2次，连续3周，建立豚鼠耳背牛皮癣动物模型。选择和厚朴酚中剂量进行该模型的药效学评价，将建模后的豚鼠随机分为5组，每组4只，雌雄各半，分别为第一组.正常对照组，第二组.模型组，第三组.空白基质组，第四组.0.5%和厚朴酚组，第五组.阳性药物维A酸乳膏组。除正常组外，其它各组分别于豚鼠双侧耳背皮肤均匀涂抹给药，模型组给予生理盐水组，每天涂抹2次，连续给药12天。最后一次涂药后，次日断颈处死豚鼠，迅速沿耳廓偏离基线剪取豚鼠耳朵并放入4%中性多聚甲醛中固定，石蜡包埋，H&E染色，显微镜下观察。结果见图5，显示了和厚朴酚能使牛皮癣豚鼠耳朵角质层显著变薄，角质化过度显著变轻，颗粒层细胞成连续成行分布，棘层变薄，基底细胞表皮突变得平坦且真皮乳头上升成杆状较少，效果比阳性药物好。
结论利用和厚朴酚具有使角质层显著变薄、角质化过度显著变轻等作用，因此，可以用于治疗具有角质层变厚症状的角化性皮肤病，如鱼鳞病、打泡性表皮松懈症、牛皮癣、着色性干皮症、毛囊角化病、汗孔角化症、掌跖角化症、进行性对称性红斑角皮症、绝经期角皮症、剥脱性角质松懈症、蟾皮症、硬皮病等。试验例2和厚朴酚具有免疫抑制作用方面的用途试验方法方案同实施例3的试验方法I。转基因牛皮癣小鼠血清中IFN-Y、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10等细胞因子的检测结果见图6_9，显示了和厚朴酚可以降低血清中IFN- Y、TNF- α分泌水平，而对IL_2、IL-4和IL-10几乎无影响。小鼠耳朵组织中IFN- Y , TNF- α基因表达水平结果见图10，显示了和厚朴酚可以抑制IFN-Y、TNF-α的mRNA表达水平。和厚朴酚对小鼠T淋巴细胞的影响试验结果见表1，显示了和厚朴酚是通过下调淋巴细胞中⑶3+T细胞、⑶4+T细胞的表达，进一步下调Thl细胞的表达来发挥免疫抑制作用，尤其是用于发挥治疗牛皮癣的免疫抑制作用。表I和厚朴酚对小鼠脾脏T淋巴细胞中⑶3、⑶4、⑶8、ThU Th2细胞表达率的影响(.\-±SD;%)
权利要求
1.和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备治疗角质化过度的药物中的用途。
2.和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备治疗角化性皮肤病的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的角化性皮肤病是鱼鳞病、打泡性表皮松懈症、牛皮癣、着色性干皮症、毛囊角化病、汗孔角化症、掌跖角化症、进行性对称性红斑角皮症、绝经期角皮症、剥脱性角质松懈症、蟾皮症、硬皮病中的任意一种。
4.和厚朴酚或其药学上可接受的盐在制备具有免疫抑制作用的药物中的用途。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于所述的药物为外用制剂；所述外用制剂优选乳膏、涂剂、搽剂、洗剂中任意一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于所述和厚朴酚药学上可接受的盐为和厚朴酚二钠盐、和厚朴酚二甲盐。
7.含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，其特征在于它是以和厚朴酚或其药学上可接受的盐为主要活性成分，加入药剂学常用辅料制成的外用制剂； 优选，它是以和厚朴酚或其药学上可接受的盐为唯一活性成分，加入药剂学常用辅料制成的外用制剂。
8.根据权利要求7所述的含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，其特征在于外用制剂中含有下述重量百分比的组分 和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10% 高效皮肤渗透促进剂O. 1% 10%。
9.根据权利要求8所述的含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，其特征在于所述的高效皮肤渗透促进剂为水溶性氮酮、丙二醇、薄荷脑中的一种或其混合物。
10.根据权利要求8或9所述的含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，其特征在于外用制剂中含有下述重量百分比的组分 和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10% 高效皮肤渗透促进剂O. 1% 6%。
11.根据权利要求8或9所述的含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，其特征在于外用制剂中还含有重量百分比为O. 001-0. 05%防腐剂；即为 和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10% 高效皮肤渗透促进剂O. 1% 10% 防腐剂O. 001%-0. 05%。
12.根据权利要求11所述的含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，其特征在于 和厚朴酚或其药学上可接受的盐O. 01% 10% 高效皮肤渗透促进剂O. 1% 6% 防腐剂O. 001%-0. 05%。
13.根据权利要求8-12任一项所述的含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制齐U，其特征在于外用制剂中还含有外用制剂常用的、常规用量的辅料。
全文摘要
本发明属于医药领域领域，涉及和厚朴酚或其药学上可接受的盐的新用途，以及含有和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂，新用途具体为制备治疗角质化过度和角化性皮肤病的药物中的用途。利用该新的药用用途，制成以和厚朴酚或其药学上可接受的盐为主要活性成分或唯一活性成分，加入药剂学常用辅料制成的外用制剂。本发明外用制剂中，含有下述重量百分比的组分和厚朴酚或其药学上可接受的盐0.01%～10%、高效皮肤渗透促进剂0.1%～10%。利用上述和厚朴酚或其药学上可接受的盐的外用制剂可以实现以透皮给药的途径治疗角化性皮肤病的目的，而且透皮作用明显，效果显著，为临床治疗提供了一种全新的选择。
文档编号A61K31/05GK102871989SQ20121022990
公开日2013年1月16日 申请日期2012年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者陈俐娟, 魏于全, 彭爱华, 王先火 申请人:四川大学