专利名称：一种鸭黄病毒病亚单位疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种经重组细胞系表达的鸭黄病毒病亚单位疫苗，具体地，本发明涉及的重组细胞系为BHK-BYD-ME，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6342。本发明还公开了制备所述重组细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防鸭黄病毒病疫苗中的应用。属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。
背景技术：
鸭黄病毒病(暂命名)又名鸭出血性卵巢炎，或鸭减蛋综合征等，是2010年在中国东南部一带首次发现的一种新鸭病。该病主要对蛋鸭致病，也发生于种鹅，肉鸭。蛋鸭发病临床表现为肢体站立不稳，行走困难，采食量下降，产蛋量骤然减少，在短时间内产蛋减少能超过90%，部分病鸭在数日内死亡，死亡率为5%-10%。内脏病变为卵巢发生出血，萎缩，卵泡破裂等，部分出现脑膜出血。该病为新发病源，由一种新型的黄病毒感染引起发病。现有 的研究表明该病的病原属于黄病毒科黄病毒属鸭黄病毒(Flaviviridae, Flavivirus, Duckflavivirus) (Jingliang Su, et al. PLoS one, 2011 ;藤巧泱等，中国动物传染病学报，2010)。黄病毒科共有70余种病毒,其中黄病毒属(GenusFlavivirus)对人类来讲已经不陌生。包括乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、登革病毒(Dengue virus,DEN)、黄热病毒(Yellow fever virus, YFV)、西尼罗病毒(West Nile virus, WNV),圣路易斯脑炎(St. Louis encephalitis virus, SLE)等。其中大部分病毒能感染人和动物,引发较为严重的人兽共患病。所以针对这种新出现的鸭黄病毒，其病原的流行病学，其它感染宿主等还不明确，在这种情况下使用经病毒灭活的疫苗或细胞致弱病毒活疫苗均存在很大的生物安全风险。由于该病原为新出现的病原，相关研究还有待深入。特别是预防控制该病方面目前还没有可用的疫苗。因此迫切需要研制一种安全有效的鸭黄病毒病疫苗以用来控制我国这种新出现的鸭病。黄病毒为正链RNA病毒，其基因组结构相似。基因组编码一个大的多聚蛋白，多聚蛋白经剪切后形成病毒的结构蛋白和与病毒复制相关的非结构蛋白。如JEV，WNV等黄病毒，其结构蛋白PrM-E蛋白经细胞内表达后可以形成病毒样颗粒，这种病毒样颗粒抗原能被细胞分泌致细胞外培养液中。这一特性对研究病毒亚单位疫苗非常有利。如本发明人已经用BHK21细胞构建了稳定表达JEV prM-E蛋白的重组细胞系，用些细胞制备了猪乙型脑炎亚单位疫苗，经动物免疫实验表明这种经细胞表达的病毒样颗粒疫苗能非常有效地诱导动物产生保护性免疫反应(中国发明专利，申请号201110302769. 5)。根据公开发表的鸭黄病毒基因组序列，本发明人分析了结构蛋白基因编码序列，并进一步对基因结构蛋白基因prM-E蛋白基因进行了编码密码子优化，以利于该蛋白基因在细胞中更高效地表达。构建了密码子优化基因真核表达质粒，转染细胞后筛选出了一株稳定表达鸭黄病毒prM-Ε蛋白的重组细胞系，研制了鸭黄病毒基因工程亚单位疫苗。现对发明内容与具体实施例描述如下。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鸭黄病毒亚单位疫苗，该疫苗安全性好，免疫效果可靠，能有效预防鸭黄病毒感染。本发明的目的之二是提供一种用于制备上述鸭黄病毒亚单位疫苗的稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系及其制备方法 。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明的一种鸭黄病毒病亚单位疫苗，含有经稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系表达的鸭黄病毒PrM-E蛋白及佐剂。在本发明中，优选的，所述的稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系由以下方法构建得到(I)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入的编码鸭黄病毒prM-E蛋白的基因序列；(2)将所述真核表达质粒转染BHK21细胞；(3)经质粒转染的细胞以添加了 G418的培养液选择培养；(4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较鸭黄病毒PrM蛋白与E蛋白的表达量，获得稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系O在本发明中，优选的，编码鸭黄病毒prM-E蛋白的基因序列如SEQ ID No. 2所示。所述鸭黄病毒PrM-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。在本发明中，优选的，步骤(3)中所述培养液中G418的浓度是ΙΟΟΟμ g/mL。在本发明中，优选的，所述的稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系命名为BHK-BYD-ME，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. 6342，保藏时间为2012年7月10日。进一步的，本发明还提供了以上任一项所述的鸭黄病毒病亚单位疫苗在制备预防鸭黄病毒病药物中的用途。本发明的一种稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系，命名为BHK_BYD_ME，分类命名为幼仓鼠肾细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCCNo. 6342，保藏时间为2012年7月10日。本发明还提供了所述的重组细胞系在制备预防鸭黄病毒病药物中的用途。及所述的重组细胞系在制备检测鸭黄病毒抗体试剂中的用途。具体的，为了达到以上目的本发明采用的技术方案为I)本发明参考鸭黄病毒BYD-I株的蛋白序列(GenBank:AEA72437. I)，并以哺乳动物细胞偏嗜性密码子优化鸭黄病毒PrM-E蛋白的基因序列，即在prM蛋白的N端加入一个Met氨基酸残基和鸭黄病毒C蛋白C末端的22个氨基酸残基序列作为信号肽序列。在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列与Sac I酶切位点与保护性碱基；在E蛋白基因编码末端加有终止子与Xho I酶切位点与保护性碱基。设计合成的序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因命名为opti-BYD-ME，大小为2073bp，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。将基因克隆进入真核细胞表达质粒PCAGneο 中，构建表达质粒 pCAGneo-opti-BYD-ME。2)将重组质粒转染BHK21细胞，转染48h后换含G418的培养基，IOd后通过有限稀释法获得克隆化细胞。3)单克隆化细胞经IFA，Western blot, ELISA,电镜观察等方法检测，筛选获得稳定表达鸭黄病毒PrM-E蛋白的重组细胞系。4)将本发明的表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞培养物制备成疫苗用于动物免疫，结果表明经本发明的重组细胞系制得的疫苗可以诱导动物机体产生针对鸭黄病毒的中和抗体，并能够在体内或体外中和鸭黄病毒，阻止病毒感染动物机体。本发明的有益效果如下I.将本发明的表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞培养物制备疫苗可以诱导动物机体产生针对鸭黄病毒的中和抗体，并能够在体内或体外中和鸭黄病毒，阻止病毒感染 动物机体。2.本发明所选用的表达系统为BHK21细胞，重组细胞系抗原表位量高，可以悬浮
培养高密度发酵培养，易于大量生产。3.本发明的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低抗原或疫苗生产成本。4.本发明对抗原蛋白基因进行了基因密码子优化，有利于提高抗原表达量。5.利用本发明的重组表达细胞系细胞培养物制备的油佐剂疫苗能诱导动物机体产生较高效价的病毒中和抗体。
图I为真核细胞表达质粒构建示意图；图2为转染后不同克隆细胞表达E蛋白Western blot检测；1-6，1-6号细胞克隆培养上清液E蛋白WB检测结果；表达量最高的3号克隆为本发明所最终筛选出的细胞克隆；图3为不同代次重组细胞系表达E蛋白IFA检测；图中所示结果为黄绿色荧光通道与DAPI染细胞核通道叠加结果；A，重组细胞系BD-ME第5代细胞；B，重组细胞系第20代细胞；C，正常BHK21细胞对照
具体实施例方式下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。实施例I稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系的构建及检测I材料与方法I. I质粒，菌株与细胞表达载体质粒pCAGneo、DH5 α感受态细胞和ΒΗΚ21细胞由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存，质粒中提试剂盒和RNA提取试剂盒由QIAGEN公司生产，胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司，G418购自Gibco公司，胰酶购自Hyclone公司，Reverse Transcriptase M-MLV、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Sail、XhoI、BamHI、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，抗PrM蛋白与抗E蛋白的单克隆抗体由本研究组制备，红外荧光染料标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自KPL公司，FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。I. 2重组表达质粒的构建opti-BYD-ME基因为经真核细胞偏嗜性密码子优化的编码鸭黄病毒prM_E蛋白的基因。鸭黄病毒prM-E蛋白的氨基酸序列参考鸭黄病毒BYD-I株的蛋白序列(GenBank:AEA72437. I)，在蛋白的N端加入一个M和鸭黄病毒C蛋白C末端22个氨基酸残基序列作为信号肽。在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列与Sac I酶切位点与保护性碱基；在的E蛋白基因编码末端加有终止子与Xho I酶切位点与保护性碱基。opti-BYD-ME基因以及该基因特异性扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因opti-BYD-ME大小为2073bp，其核苷酸序列如SEQ IDN0. 2所示，两端含有SacI、XhoI酶切位点，合成基因克隆在pUC57质粒中。真核表达载体pCAGneo用SacI、XhoI双酶 切处理，然后与经Sac I与XhoI双切回收的opti-BYD-ME基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化DH5 α感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用SacI、XhoI双酶切对其进行鉴定；酶切鉴定阳性质粒命名为pCAGneo-opti-BYD-ME，同时送生物公司进行测序验证。质粒构建示意图见图I。I. 3G418工作浓度的确定为确定G418筛选稳定转染质粒的细胞最适用量,本试验通过制备含不同浓度梯度的G418 (含200 1400 μ g/mL培养基，以200 μ g/mL递增)的培养基，对培养在24孔板中的、长至90%满的BHK21细胞进行加压处理。在培养的3 14d内，逐日观察细胞病变和死亡情况。I. 4细胞转染与筛选选生长状态良好的BHK21细胞消化传代至24孔板中，待BHK21细胞长至90%满时，按照Lipofectamine 2000转染试剂操作说明用重组质粒pCAGneo-opti-BYD-ME转染细胞。转染48h后加入含G418(1000l·! g/mL)选择性培养基进行加压培养，4d后将细胞用胰酶消化，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目。挑选含有I个细胞集落(即I个细胞团块)的孔相继在24孔板、6孔板、细胞培养瓶中扩大培养，同时对各细胞进行IFA鉴定。筛选IFA信号较强的细胞克隆。I. 5克隆细胞表达目的蛋白的Western blot鉴定克隆细胞在24孔板中培养2d后，收集上清液，10倍浓缩后加入电泳上样缓冲液制样电泳；检测细胞内蛋白时去掉细胞培养液，用PBS将细胞洗两遍，加入培养液1/10体积的细胞裂解液，收集细胞裂解液，加入蛋白电泳上样缓冲液。沸水中煮lOmin。SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，含5%脱脂乳PBS中4°C封闭过夜。然后加入500倍稀释的鼠抗E蛋白单克隆抗体，37°C作用lh，PBST洗涤3次，每次5min，再加入5000倍稀释的红外染料标记的羊抗鼠IgG抗体，37°C作用45min, PBST洗5次,最后用Odyssey扫描仪扫描结果。I. 6间接免疫荧光试验检测目的蛋白在转染细胞中的表达将克隆细胞接种至24孔或12孔板中，24h后去除培养液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS洗3次，用含O. l%Triton XlOO的PBS作用细胞lOmin，PBS洗3次，用含4%BSA的PBS封闭2h，PBS洗I次，加入1:500稀释的鼠抗鸭黄病毒E蛋白抗体，4°C孵育过夜，PBS洗3次，加入按1:200稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育2h，PBS洗3次，以I μ g/ml含量的DAPI液染细胞核15min，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察结果。I. 7克隆细胞的RT-PCR鉴定用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取10 μ L进行反转录，加入OligodT I μ L，RNase 抑制剂 I μ L, M-MLV5 X Buffer 5 μ L, M-MLV 转录酶 I μ L, dNTP (IOmM) 2. 5 μ L,补加双蒸水至25yL，混合，42°C加热60min，95°C 5min终止反应。然 后利用opti-BYD-ME基因特异性引物，PCR扩增目的基因。2 结果2. I重组表达质粒的构建构建的重组表达质粒pCAGneo-opti-BYD-ME的结构图见图I。提取的重组质粒经XhoI、SacI双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，较小条带大约为2073bp，表明酶切结果与预期结果一致，同时测序结果表明重组质粒中SacI、XhoI酶切位点间的序列和设计的编码prM-Ε蛋白的基因(SEQ ID NO. 2所示)完全一致。2. 2prM-E基因稳定表达细胞系的建立2. 2. 1G418工作浓度的确定在第14d时，G418浓度为1000 μ g/mL的孔内的BHK21细胞全部死亡，而小于此浓度的孔内还有存活细胞，所以最终确定G418的最适工作质量浓度为1000μ g/mL。2. 2. 2转染细胞株的筛选细胞转染48h后，加入G418选择培养基，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下挑选出含单个细胞集落的克隆并经IFA鉴定，筛选出6个阳性细胞克隆。2. 2. 2克隆细胞的RT-PCR鉴定利用RT-PCR对IFA鉴定阳性细胞克隆进行目的基因的扩增后，结果表明，对所筛选出的细胞克隆的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一至的目的条带。表明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。2· 3· 3表达细胞系的Western blot鉴定对6个克隆细胞培养上清液进行10倍浓缩后，经SDS-PAGE电泳后进行Westernblot鉴定结果表明经IFA筛选出的6个克隆中3号克隆蛋白表达量最高(图2)，选取3克细胞克隆进行传代培养与进一步特性分析。3号克隆细胞经过不同代次传代后对培养上清液进行E蛋白Western blot检测，结果表明筛选出的克隆细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。结果表明构建的重组细胞系能稳定表达目的基因。2. 3. 4间接免疫荧光试验检测E蛋白在转染细胞中的表达间接免疫荧光试验显示，细胞克隆在克隆后第一代即能呈现较强的黄绿色荧光信号，而对照细胞不呈现荧光信号。且该细胞克隆经传代至第20代时，仍能稳定表达目的蛋白(图3)，而且阳性细胞比例均大于90%。3 结论通过本实施例一系列的实验结果表明，经过真核表达质粒的构建，转染BHK21细胞以及多种方式的筛选，最终得到了一株能高效稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的细胞系。所述的细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. 6342。实施例2鸭黄病毒亚单位疫苗的制备及对鸭的免疫试验I、疫苗制备将实施例I所构建筛选的重组细胞系BHK-BYD-ME细胞正常传代后长至90%满时，换无血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养物于_20°C冻融三次，反复冻融三次后的含细胞培养物原液中加入终浓度为O. 02%硫柳汞后为疫苗抗原液。油佐剂疫苗制备法为疫苗抗原液与法国SEPPIC公司ISA 50V2油佐剂按体积比为I :1进行混合并充分乳化后存于4°C备用。2、动物分组与免疫实验动物SPF级绍麻鸭为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，6周龄SPF鸭12只随机分为2组。第一组鸭8只，为油佐剂疫苗免疫组，免疫鸭黄病毒油佐剂亚单位疫苗O. 5ml/只；第三组鸭4只，为空白对照组，只注射PBS作为对照。免疫分二次进行，第一次免疫2周后进行第二次免疫,第二次免疫4周后进行病毒攻击实验。3、血清中和抗体检测各试验组鸭在第一次免疫后I周和2周分别采血分离血清。在第二次免疫后第1，2，3周分别采血分离血清进行病毒中和抗体检测，检测中和抗体方法为96孔板微量中和实验。具体方法为各组鸭血清56°C灭活30min，取50ul两倍梯度稀释血清+50ul病毒(10TCID50)混合于37°C作用lh，后加入次代鸭胚成纤维细胞(DEF)，三天后观察细胞病变(CPE),按Reed and Muench方法计算血清效价，以能够完全抑制病毒复制的最大血清稀释倍数为其中和效价。4、免疫鸭病毒攻击实验各试验组鸭在第二次免疫4周后进行病毒攻击保护实验。接种病毒为鸭黄病毒FJTP2010株，剂量为IOODID5tl (半数鸭感染量)。病毒接种I周后剖杀全部实验鸭，观察鸭内脏病理变化，分别取鸭心脏，肝脏，肾脏与脾脏等组织进行病毒分离滴定。病毒滴定方法为，方法无菌称取每只鸭子脏器O. 2g，加入Iml无血清DMEM培养液后，在组织研磨器中研磨5min, 5000g, 4°C离心lOmin,取上清进行10倍梯度稀释后，接种于96孔板次代DEF,每个样品接种四个孔，每孔lOOul，于37°C培养箱中培养3-4天，观察细胞病变，以能引起细胞病变的最高稀释度为其滴度。5、结果血清中和抗体检测结果表明，本发明所构建制备的表达鸭黄病毒prM-E蛋白重组BHK-BYD-ME细胞系所表达的抗原制备的疫苗免疫鸭后能诱导鸭产生鸭黄病毒中和抗体。一免后二周中和抗体效价还很低，但二免后病毒中和抗体迅速上升，而对照组鸭血清则不能检测出病毒中和抗体。具体实验数据如表I所示。表I重组亚单位疫苗免疫鸭血清病毒中和抗体检测结果
权利要求
1.一种鸭黄病毒病亚单位疫苗,含有经稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系表达的鸭黄病毒PrM-E蛋白及佐剂。
2.根据权利要求I所述的鸭黄病毒病亚单位疫苗，其特征在于所述的稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系由以下方法构建得到 (1)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入的编码鸭黄病毒PrM-E蛋白的基因序列； (2)将所述真核表达质粒转染BHK21细胞； (3)经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养； (4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较鸭黄病毒PrM蛋白与E蛋白的表达量，获得稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系。
3.根据权利要求I或2所述的鸭黄病毒病亚单位疫苗，其特征在于编码鸭黄病毒prM-E蛋白的基因序列如SEQ ID No. 2所示。
4.根据权利要求I或2所述的鸭黄病毒病亚单位疫苗，其特征在于所述鸭黄病毒prM-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
5.根据权利要求2所述的鸭黄病毒病亚单位疫苗，其特征在于步骤(3)中所述培养液中G418的浓度是1000 u g/mL。
6.根据权利要求I所述的的鸭黄病毒病亚单位疫苗，其特征在于所述的稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白的重组细胞系为BHK-BYD-ME，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6342。
7.权利要求1-6中任一项所述的鸭黄病毒病亚单位疫苗在制备预防鸭黄病毒感染药物中的用途。
8.一种稳定表达鸭黄病毒PrM-E蛋白的重组细胞系，命名为BHK-BYD-ME，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6342。
9.权利要求8所述的重组细胞系在制备预防鸭黄病毒感染药物中的用途。
10.权利要求8所述的重组细胞系在制备检测鸭黄病毒抗体试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种鸭黄病毒病亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明的鸭黄病毒病亚单位疫苗含有经稳定表达细胞系表达的鸭黄病毒prM-E蛋白及佐剂。本发明还公开了稳定表达鸭黄病毒prM-E蛋白细胞系的建立与培养细胞系表达蛋白方法，更具体地，表达鸭黄病毒prM-E蛋白重组细胞系为BHK-BYD-ME，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.6342。本发明的鸭黄病毒亚单位疫苗安全性高，免疫效果好，免疫鸭后能诱导产生病毒中和抗体。实验证明，本发明的疫苗能显著提高免疫鸭对鸭黄病毒的抵抗力，可以用于预防控制鸭黄病毒病。
文档编号A61P31/14GK102793918SQ201210271338
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者华荣虹, 步志高, 陈化兰, 柳金雄 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨维科生物技术开发公司