专利名称：具有抗脂质累积活性的川芎内酯提取物制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属中药化学领域，具体地说涉及一种从川芎中提取的有效组分及其制备方法，以及该组分在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。
背景技术：
肝损伤是由多种病因引起且有多种因素参与的复杂过程。肝损伤引发的肝脏疾病已成为常见病、多发病，更为严重的是其引发的肝功能衰竭和肝性脑病等，发病率和死亡率高，极大地威胁着人类健康。很多因素可引起肝损伤。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD),又称非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL),是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。非酒 精性脂肪肝包含一系列的肝脏疾病，从单一的脂肪变性到不同程度的脂肪变性联合坏死和纤维化。而肝细胞内脂质异常累积则是脂肪肝类疾病发生的最主要因素。油酸是人体内最为丰富的脂肪酸之一，它参与形成肝脏中的三酸甘油酯并能促进脂滴的形成，油酸诱导HepG2脂肪累积是一种常用的脂质累积细胞模型，可用于评价药物的抗脂质累积作用。目前，非酒精性脂肪肝治疗方法有很多，且均有一定疗效，但也存在着明显的不足。首先，西药具有较大的毒副作用，且疗效并不确切。而另一方面，实验和临床研究证实，中药在改善肝功能、抗氧化、改善微循环、调节免疫功能以及抗肝纤维化等方面显示出良好的疗效，安全、可靠、有效，进一步显示出中医辨证论治的合理性，突显了中药在治疗称非酒精性脂肪肝方面的良好前景。川弯为伞形科植物川弯chuanxiong Hort.的干燥根莖,其性味辛，温。归肝、胆、心包经。活血祛瘀作用广泛，适宜瘀血阻滞各种病症；祛风止痛，效用甚佳，可治头风头痛、风湿痹痛等症。现代药理学研究表明，川芎提取物对离体豚鼠心脏有剂量依赖性抑制作用，对离休大鼠或豚鼠心脏均具有显著的增加冠脉流量作用，其主要活性成分川芎嗪能扩张大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收缩反应和右心室肥大。此外，川芎还具有中枢神经系统抑制作用，对动物大脑的活动具有抑制作用，而对延脑呼吸中枢、血管运动中枢及脊髓反射中枢具有兴奋作用。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，对于川芎内酯类组分是否具有抑制肝细胞脂质累积的活性尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种川芎有效组分，该有效组分主要含有藁本内酯，含量为30 90%。本发明的另一目的是提供该川芎有效组分的制备方法，通过以下步骤实现将川芎药材粉碎后加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小时，加热回流提取0. 8^1. 2小时，提取f 3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到有效组分。本发明的再一个目的是提供该川芎有效组分在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。本发明第一方面提供了一种川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本内酯。根据本发明第一方面的川芎提取物，其中含有8(Γ97%(例如85%_95%)的藁本内酯。根据本发明第一方面的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的将川芎药材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，力口入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。根据本发明第一方面的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的将川芎药材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小时，加热回流提取O. 8^1. 2小时，提取f 3次，合并 滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。根据本发明第一方面的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的将IOOOg川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度I. 08 ;将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液,加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。本发明第二方面提供了制备川芎提取物的方法，其包括以下步骤将川芎药材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤将川芎药材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小时，加热回流提取O. 8^1. 2小时，提取f 3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤将IOOOg川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度I. 08 ;将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。根据本发明第二方面的方法，其所得川芎提取物中含有3(Γ90%的藁本内酯。根据本发明第二方面的方法，其所得)11芎提取物中含有8(Γ97% (例如85%_95%)的藁本内酯。本发明第三方面提供了本发明第一方面的川芎提取物在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。
本发明第四方面提供了一种药物组合物，其中包括本发明第一方面的川芎提取物以及药学可接受的载体或赋形剂。本发明的川芎有效组分可以作为活性部位，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。在本发明中，术语“川芎有效组分”亦可称为“川芎组分”、“川芎提取物”、“川芎内酯”等，这些术语可以互换使用。本发明的有益效果为
I.本发明的提取分离工艺简单，能快速准确地得到有效组分。 2.本发明提供的川芎有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。3.本发明首次在油酸诱导HepG2脂肪累积模型上，评价了川芎内酯类提取物对抗脂质累积降脂作用，得到较好的药理活性。
图I为本发明川芎提取物的GC-MS分析图，模坐标表示分钟。图2.不同浓度川芎提取物对500uM油酸诱导的H印G2细胞脂质累积的影响。
具体实施例方式本发明结合附图和下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例一川芎有效组分的制备
将IOOOg川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度I. 08。将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚(60-90)和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后得到淡黄色液体
11.3g，为本发明川芎提取物，其在本发明中亦可称为川芎内酯，并且用于下文生物学试验例。实施例二川芎有效组分的分析
称取如实施例I所示川芎提取物溶解，取适量转移至棕色液相进样瓶，用于液相色谱分析。分析条件如下Agilent 1100型液相色谱仪,进样量10 μ I ;流速lml/min,柱温30。。。色谱流动相梯度为:(T40min :水(O. 1%甲酸)70% 20%，乙腈30% 80% ;40_50min 水(O. 1%甲酸)20% 5%，乙腈80% 95% ;50 55min :水(O. 1%甲酸)5%，乙腈95% ;检测波长271nm。分析谱图如附图I所示。液相色谱分析显示川芎提取物在26. 5min有I个明显色谱峰，经与标准品比对后鉴定该峰代表的化合物为藁本内酯。分析结果显示，川芎内酯提取物中主要成分为藁本内酯，其含量约为90%。出人意料地发现，在实施例I中，如果用浓度低于70%的乙醇提取，或者用石油醚为洗脱剂，或者所用洗脱剂中乙酸乙酯份量大于5，即50份石油醚与5份以上的乙酸乙酯混合液为洗脱剂时，藁本内酯获得量比实施例I的获得量低30%以上。用75%以上乙醇提取，或者用石油醚乙酸乙酯为50 :0. 5^3的比例的混合液作为洗脱液时，藁本内酯获得量是实施例I的获得量的909^115%，并且提取物中藁本内酯含量均在80 97%。实施例三川芎有效组分制剂
取实施例I所得的川芎有效组分O. 5g与10. 5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6 8°C液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。实施例四川芎有效组分制剂
取实施例I所得的川芎有效组分O. 5g，磨成细粉，与约1/3的淀粉混匀，加淀粉浆混匀制成软材，16目筛制粒，70°C干燥，干粒过14目筛整粒，加剩余淀粉(预先在100 - 105 V干燥)与吸附有液状石蜡的滑石粉(将轻质液状石蜡喷于滑石粉中混匀)，再通过14目筛，压片，即得。实施例五川芎有效组分(实施例I的川芎提取物)抗脂质累积活性评价 溶待测组分于DMSO中，得50 mg -inL-l储备液，与细胞孵育的终浓度为50 μ g -inL-l,
在油酸诱导的HepG2肝细胞模型评价其抑制脂质累积活性。将生长良好的HepG2细胞以每孔20万细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，每孔培养液1ml。待细胞贴壁后(约24小时)，分对照组和给药组处理，平行三次实验，对照组中加入O. 5mM油酸，给药组中加入O. 5mM油酸及实施例I所得川芎提取物(浓度为25、50、100,200 ug/ml)，于37°C、5%C02的条件下培养24h后，弃去每孔上清，酶法测定甘油三酯、总胆固醇含量。测定方法为24孔细胞培养板用预冷PBS500ul洗两次，每孔加入200ul细胞裂解液裂解30min，取裂解总液于I. 5ml离心管中，离心(12000rpm，4°C，lOmin)，分别取上清液80ul加IOOul甘油三酯酶剂测每孔甘油三酯(TG)含量，80ul加IOOul胆固醇酶剂测每孔胆固醇(TC)含量，IOul用BCA法测蛋白含量，计算每孔单位蛋白的TG和TC含量(ug/mg蛋白)。结果表明，实施例I所得川芎提取物在50ug/ml，100ug/ml, 200ug/ml浓度下有明显的抑制油酸诱导HepG2细胞中甘油三酯累积的作用，并呈量效关系。结果见图2，其中显示了不同浓度川芎提取物对500uM油酸诱导的H印G2细胞脂质累积的影响。纵坐标表示对照的％。
权利要求
1.一种川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本内酯。
2.根据权利要求I的川芎提取物，其中含有8(Γ97%的藁本内酯。
3.根据权利要求I或2的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的将川芎药材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。
4.根据权利要求I或2的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的将川芎药材粉碎后加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小时，加热回流提取O. 8^1. 2小时，提取f 3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。
5.根据权利要求I或2的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的将IOOOg川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度I. 08 ;将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液,加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。
6.制备川芎提取物的方法，其包括以下步骤将川芎药材粉碎后，用709Γ99%乙醇(例如759Γ98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。
7.根据权利要求6的方法，其包括以下步骤将川芎药材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小时，加热回流提取O. 8^1. 2小时，提取f 3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。
8.根据权利要求6的方法，其包括以下步骤将IOOOg川芎药材粉碎后，加入4000ml95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度I. 08 ;将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。
9.权利要求1-6的川芎提取物在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。
10.一种药物组合物，其中包括权利要求1-6的川芎提取物以及药学可接受的载体或赋形剂。
全文摘要
本发明涉及具有抗脂质累积活性的川芎内酯提取物制备方法及用途。具体地，本发明涉及一种川芎提取物，其中含有30～90%的藁本内酯。该提取物是通过以下方法制备得到的将川芎药材粉碎后，用70%～99%乙醇(例如75%～98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50∶0.5～5(例如50∶0.5～3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。
文档编号A61K36/236GK102824382SQ20121030221
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者程翼宇, 张萌, 王怡, 王毅, 刘二伟 申请人:天津中医药大学