专利名称：一种用于治疗乳腺癌的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤药物及其制备方法，尤其是一种用于治疗乳腺癌的药物及其制备方法。
背景技术：
·乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国CA:A Cancer Journal forClinicians杂志(2010年影响因子94. 262)公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，排名女性恶性肿瘤发病率第一位。在我国北京、上海、天津等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。现有的乳腺癌治疗过程中对患者免疫系统的损害极大，导致肿瘤治疗过程中遇到无法突破的瓶颈，肿瘤无法完全治愈。现阶段细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)是具有细胞毒作用的免疫活性细胞；树突状细胞(dendritic cell, DC)是最具潜力的抗原提呈细胞，在初始性免疫和获得性免疫中具有重要作用。因此将CIK联合DC进行耐药乳腺癌的联合治疗具有非常重要的临床应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于治疗乳腺癌的药物。本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述用于治疗乳腺癌的药物的制备方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种用于治疗乳腺癌的药物，为抗原冲击的DC与CIK的共培养物(简称AP-DC+CIK的组合方式)，其中，所述抗原为冻融抗原，是由下述方法得到的收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为I X 107/mL的细胞悬液，加入100 u L生理盐水中，放入液氣中，5min后,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氣中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用；所述抗原冲击的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为I X IOVmL,接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天；所述CIK是由下述方法得到的收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3 X 107mL，接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天。优选的，上述用于治疗乳腺癌的药物，所述DC与CIK细胞的体积比为I : 10。上述用于治疗乳腺癌的药物的制备方法，将抗原冲击的DC与CIK进行共培养，具体步骤为(I)制备抗原收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为IXlOVmL的细胞悬液，加入IOOii L生理盐水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用，得到冻融抗原；
(2)制备抗原冲击的DC :收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为I X 106/mL,接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL-4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天；(3)所述CIK是由下述方法得到的收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3 X 107mL，接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天；(4)将上述CIK细胞与上述抗原冲击的DC继续共培养。优选的，上述用于治疗乳腺癌的药物的制备方法，所述步骤(4)中DC与CIK细胞按照体积比I : 10的比例共培养15天。本发明的有益效果是上述用于治疗乳腺癌的药物，其中CIK细胞是来源于T淋巴细胞的具有免疫活性的异质细胞群，具有较强的抗肿瘤毒性，可以杀伤对化疗耐药的肿瘤细胞，是治疗多药耐药肿瘤的最具潜力的方法，DC细胞是最具潜力的抗原提呈细胞，可以识别、加工、提呈抗原给T细胞，是激发特异性免疫应答的中心和抗肿瘤免疫的重要载体，AP-DC+CIK的组合方式对于抑制肿瘤的生长、延长患者生存时间的效果突出；所述制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。
图I是各组肿瘤标本RT-PCR检测MDRl和P -actin结果，其中I :AP_DC+CIK治疗组，2 DC+CIK治疗组，3 :CIK单独治疗组，4 :生理盐水对照组；图2是TUNEL染色检测示肿瘤细胞凋亡(TUNEL X 400)； 图3是各组荷瘤标本BCL-2染色结果(免疫组化X 200 );图4是各组荷瘤标本Bax免疫组化染色结果(免疫组化X 400)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
下述实施例中所用材料包括SPF级SCID裸鼠，5飞周龄，购自北京军事医学科学院动物研究所；R/MINI_1640粉剂(美国Hyclone公司)、新生牛血清(HycloneLaboratories Inc),淋巴细胞分离液(Sig_ma)、重组人巨卩遼细胞集落刺激因子(rhGM-CSF )、重组人白细胞介素(rh IL ) -4、重组人肿瘤坏死因子(rhTNF ) - a、rh IL-2、(Bioscience公司)、抗人⑶3单抗(北京思科达生物科技有限公司)；RNA提取试剂盒、一步法 RT-PCR 试剂盒(QIAGEN 公司)，MDRl 引物上游 5’ -CCCATCAITGCAATAGCAGG-3’，下游 5’-TGITCAAACTTCTGCTCCTGA-3’，总长 158bp ; P-actin 内参引物上游5’ -GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3’，下游 5’ -GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3 ’，总长 12 Ibp ;琼脂糖凝胶(上海生工公司)，TUNEL试剂盒(罗氏公司)，抗人BAX单抗(北京中杉)，抗人BCL-2单抗、免疫组化二抗试剂盒(基因科技公司)。实施例I( I)靶细胞及细胞冻融抗原的制备 MCF-7/ADR细胞购自中国医学科学院血液病医院，收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为I X 107/mL的细胞悬液，加入100 u L生理盐水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用；(2) DC体外诱导培养收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为I X 106/mL,接种于24孔培养板(ImL/孔)，加入终浓度为1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，与未冲击的DC共同于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天。(3)CIK细胞的分离及培养收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3X 106/mL，接种于24孔平底培养板(ImL/孔)，当天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 u g/L及300U/mL的rhIL-2,以后每3d以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液；培养到第7天，将CIK细胞分为3组继续培养，分别是抗原冲击的DC与CIK共培养组(AP-DC+CIK组)、DC与CIK共培养组(DC+CIK组)和CIK单独培养组(CIK组)，其中DC与CIK细胞按照体积比I : 10的比例进行共培养15天。实施例2I、建立荷瘤裸鼠模型收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为IXlOVmL的细胞悬液，按每只裸鼠接种ImL细胞悬液，在每只裸鼠右侧腋下进行接种，肿瘤体积生长到直径为0. 5cm为成瘤。2、分组第一组抗原冲击的DC与CIK共培养组(AP-DC+CIK组)；第二组DC与CIK共培养组(DC+CIK组)；
第三组CIK单独培养组(CIK组)；第四组生理盐水(空白组)。3、实验裸鼠模型治疗分组以接种MCF-7/ADR的SCID裸鼠肿瘤体积生长到直径为0. 5cm为成瘤，将荷瘤裸鼠随机分到4组中，分别注射AP-DC+CIK、DC+CIK、CIK和生理盐水，从注射开始每7天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b) I次，肿瘤体积=0. 5 XaXb2，观察肿瘤生长的情况；注射治疗35天后 ，处死荷瘤裸鼠，取出瘤体，部分瘤体标本中性甲醛液固定、石蜡包埋，留作免疫组化用，其余标本称质量，留做逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。( I ) RT-PCR测定MDRl基因表达情况标本称质量后，按不同治疗组顺序，取同质量瘤体，研碎，并按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA，提取物定量检测。然后按照一步法RT-PCR试剂盒步骤，配加25 u L反应体系，包括总RNA 0. 5 u g, 5 X Buffer 5 u L, dNTPMix I u L,上下游引物各I u L, Enzyme Mix I u L, Rnase-free水补齐至25 u L。反应条件为5(TC 30min, 95°C 15min, 94°C 45s,58°C 45s,72°C Imin 35 个循环，72°C 10min，4°C。将PCR产物置I. 5%琼脂糖中电泳，溴化乙锭染色，每次上样量均为6 ii L，包括Marker，目的基因MDRl及内参照P-actin，置紫外灯下观察电泳结果并照片。(II) TUNEL试剂盒检测凋亡(I)石蜡包埋的切片的预处理常规脱蜡脱水，用蛋白酶K工作液(20mg/L溶于IOmmoI/L Tris/HCl 中，pH 7. 4 8. 0)室温孵育 15 30min，PBS 洗 2 次；(2)标记PBS冲洗2次，擦干样品周围的水，滴加50 ii L的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37°C孵育60min (为防止蒸发和保证TUNEL反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片)，PBS冲洗3次，至此样品可在荧光镜下分析结果；(3)信号转化和分析擦干样品周围的水分，加入50 ii L转化剂-P0D，在湿盒中37°C孵育30min，为防止蒸发和保证转化剂-POD均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片；PBS冲洗3次，加入5(Tl00 u L DAB底物溶液，室温孵育lOmin，PBS冲洗3次；复染、封片，在光镜下分析结果；同时设立阴性对照组；光镜下观察结果，阳性细胞(即凋亡细胞)的胞核为棕黄色或棕褐色均匀或颗粒状染色。观察凋亡细胞的数量和分布，以20 X 10倍显微镜计数一个视野内的凋亡细胞数，随机计数5个高倍(X400)视野，求出平均每个高倍视野内凋亡细胞的凋亡指数(apoptotic index，Al)，Al=凋亡细胞数/观察细胞总数；以凋亡指数计，〈O. I为阴性(_) ；0. I 0. 2为弱阳性(+ ) ；0. 2 0. 3为中等阳性(++) ；>0. 3为强阳性(+++)。(III)免疫组化检测Bcl-2和Bax表达(I)石蜡切片脱蜡、水化室温放置60min，后置于二甲苯浸泡20min，无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇序贯脱水，各5min，后PBS冲洗3次；
(2)抗原修复用3%H202室温封闭lOmin，后将切片放入92°C 98°C的0. 01mol/L枸橼酸钠缓冲液2次，后PBS冲洗3次；(3)血清封闭用与二抗同种属动物血清封闭30min后取出；
(4)抗原抗体反应、染色按照免疫组化试剂盒步骤，先后加入一抗，4°C过夜，PBS冲洗3次，加二抗，室温20min，PBS冲洗3次，加DBA显色液，室温5min，PBS冲洗3次。(5)苏木素复染、酸乙醇分化、氨水反蓝、冲洗切片、脱水、透明、封片，光镜下分析结果，同时设立阴性对照组。4、统计学处理采用SPSS 10. 0软件，计量资料数据以均数土标准差(x土s)表示，多组间均数比较进行方差分析，组间多重比较用Tamhane法，P〈0. 05为差异有统计学意义。
5、结果(I) RT-PCR检测MDRl基因表达各组均有MDRl基因表达，MDRl表达由I 4逐渐增强；4组P-actin表达无明显区别，见图I。I 4组MDRl/0-actin比值分别为0. 14、0. 57、0. 81 及 0. 98。(2) TUNEL凋亡评价生理盐水组、CIK组、DC+CIK组和AP-DC+CIK组平均凋亡指数分别为 0. 088±0. 008,0. 297±0. 049,0. 390±0. 035 及 0. 565±0. 065，差异有统计学意义(F=96. 931，P〈0. 001)。凋亡细胞胞核为棕黄色或棕褐色均匀或颗粒状染色，见图2。(3) Bcl-2与Bax蛋白表达Bcl_2蛋白定位于细胞膜或胞衆,Bax蛋白定位于细胞浆，阳性细胞为包浆出现棕黄色或棕褐色颗粒，染色强度高于背景非特异性染色者，OD值比较差异均有统计学意义(P〈0. 01)，见表1，图3、4。Bcl-2/Bax AP-DC+CIK 组为 0. 10，DC+CIK 组为 0. 46，CIK 组为 I. 44，生理盐水组为 6. 16。·表I各组Bcl-2和Bax积分光密度值比较(n=10，OD值，f 士s)
组别Bcl-2Bax
生理盐水组(I)_52.54±1.57_8.53±0.30_
CIK 组(2)_37.48 ±1.07_26.05 土 0.89_
DC+CIK 组(3)_22.45±0.45_48.66±1.89_
AP-DC+CIK 组(4) 6.25 土0.22_62.62±1.46_
_F_4052.21 林_3469.39**_**P<0. 01 ;各指标间两两比较均P〈0. 001综上，CIK细胞是来源于T淋巴细胞的具有免疫活性的异质细胞群，具有较强的抗肿瘤毒性，可以杀伤对化疗耐药的肿瘤细胞，是治疗多药耐药肿瘤的最具潜力的方法；DC细胞是最具潜力的抗原提呈细胞，可以识别、加工、提呈抗原给T细胞，是激发特异性免疫应答的中心和抗肿瘤免疫的重要载体。通过上述实施例的结果显示，AP-DC+CIK组、DC+CIK组、CIK组和生理盐水组均有MDRl基因表达，表达量无明显差别，AP-DC+CIK组MDRl/^-actin最低，生理盐水组最高，提示荷瘤裸鼠模型成瘤后，各自经过CIK、DC+CIK和AP-DC+CIK治疗后，MDRl基因表达均不同程度减少。在AP-DC+CIK治疗后，MDRl基因减少最为明显，其次为DC+CIK治疗组，单独CIK治疗组减少的效果最弱，此现象亦表明负载乳腺癌抗原的DC激发出的CIK，其杀伤能力得到提高的同时，其逆转MDRl基因表达的能力亦增强，提示耐药肿瘤细胞在AP-DC+CIK组被杀伤程度强于DC+CIK组和CIK组，与肿瘤细胞在不同组别其MDRl基因逆转程度不同有关，逆转程度强的肿瘤细胞被CIK杀伤程度大，逆转程度差的肿瘤细胞被杀伤程度减低。进一步的实验发现，经脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测体外细胞凋亡得出，各组比较差异有统计学意义，进一步证实治疗组对荷瘤小鼠均具有促进凋亡的治疗作用，其中CIK组、DC+CIK组及AP-DC+CIK组对肿瘤细胞的促凋亡能力逐渐增强。Bcl-2基因是7 (14，18)染色体易位断点处的一种原癌基因，其转位造成Bcl-2蛋白水平增高。Bcl-2蛋白主要表达在线粒体的外膜、细胞核膜及内质网上。Bcl-2基因是线粒体膜渗透性改变的内源性抑制物，并可阻止线粒体内Ca2+与细胞色素C向外释放，具有抑制凋亡的作用。Bcl-2是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一。Bax也是Bcl-2基因家族重要成员之一，属于抑癌基因，一般出现在胞质中，机体出现损伤和刺激时重新定位于线粒体表面并破坏Bcl-2蛋白在正常状态下的抗凋亡功能，促进细胞凋亡，还可直接促进细胞凋亡。它表达于许多肿瘤组织中，如乳腺癌、肺癌、大肠癌、白血病等。上述CIK组、DC+CIK组及AP-DC+CIK组均能抑制Bcl_2的表达，增加Bax的表达。其中各组间Bcl-2及Bax比较差异均有统计学意义。其中在AP-DC+CIK组Bcl-2/Bax比值最低，表明其凋亡活性最强；生理盐水组Bcl-2/Bax比值最高，表明其凋亡活性最低。因此，由于其诱导的细胞凋亡程度不同，肿瘤抗原负载的DC激活的CIK产生的杀伤作用要强于单纯DC激活的CIK和单独CIK。 上述参照实施例对该一种用于治疗乳腺癌的药物及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种用于治疗乳腺癌的药物，其特征在于为抗原冲击的DC与CIK的共培养物，其中， 所述抗原为冻融抗原，是由下述方法得到的收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为I X 107/mL的细胞悬液，加入100 μ L生理盐水中，放入液氣中，5min后,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氣中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用； 所述抗原冲击的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为I X IOVmL,接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天； 所述CIK是由下述方法得到的收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3 X 106/mL,接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF- Y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 μ g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天。
2.根据权利要求I所述的用于治疗乳腺癌的药物，其特征在于所述DC与CIK细胞的体积比为I : 10。
3.权利要求I或2所述的用于治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征在于将抗原冲击的DC与CIK进行共培养，具体步骤为 Cl)制备抗原收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为I X IOVmL的细胞悬液，加入100 μ L生理盐水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用，得到冻融抗原； (2)制备抗原冲击的DC:收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养a后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为IX 106/mL，接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天； (3)所述CIK是由下述方法得到的收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3 X 107mL，接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF- Y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 μ g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天； (4)将上述CIK细胞与上述抗原冲击的DC继续共培养。
4.根据权利要求3所述的用于治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中DC与CIK细胞按照体积比I : 10的比例共培养15天。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗乳腺癌的药物及其制备方法，所述药物为抗原冲击的DC与CIK的共培养物，通过将抗原冲击的DC与CIK进行共培养获得；所述用于治疗乳腺癌的药物，其中CIK细胞是来源于T淋巴细胞的具有免疫活性的异质细胞群，具有较强的抗肿瘤毒性，可以杀伤对化疗耐药的肿瘤细胞，是治疗多药耐药肿瘤的最具潜力的方法，DC细胞是最具潜力的抗原提呈细胞，可以识别、加工、提呈抗原给T细胞，是激发特异性免疫应答的中心和抗肿瘤免疫的重要载体，AP-DC+CIK的组合方式对于抑制肿瘤的生长、延长患者生存时间的效果突出；所述制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。
文档编号A61K35/14GK102949414SQ201210341248
公开日2013年3月6日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者庞华, 司玉玲, 孙雯雯 申请人:庞华, 司玉玲, 孙雯雯