专利名称：Dcx和sparc双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种基因药物，尤其涉及DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应 用。
背景技术：
胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。脑胶质瘤的基本治疗手段是手术切除+放疗和化疗。随着分子生物学、免疫生物学、肿瘤免疫学和医学生物工程的发展，脑胶质瘤治疗的新方法新技术不断出现，如细胞免疫治疗、分子靶向治疗、热疗等。在这些治疗方法中，各种都有自身的局限性。脑胶质瘤因其恶性程度对放射治疗不甚敏感，一般认为分化差的肿瘤较分化好的为高。放疗的临床效果也不是很令人满意，一是受到放射剂量的限制，再者就是大多数脑胶质瘤细胞对射线具有抗性，加大照射剂量又会増加对周围正常脑组织的辐射损伤。随着基因技术的不断深入研究，如何能利用基因有效治疗胶质瘤已成为当今研究的热点。基因治疗的分子策略主要包括细胞周期调节、自杀基因疗法、免疫基因疗法、抑癌基因治疗、抗血管生成治疗、以及生长因子等。而且于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中具有广泛的应用价值，尤其在针对肿瘤等疾病发生发展的各个环节设计多基因共表达载体的联合基因治疗更备受关注。因而构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。双基因或多基因的构建现主要采取两种途径一是将多个携带不同治疗基因的独立载体系统同时转染靶细胞表达多个基因[20]，优点是可以自由调节各表达载体的比例，但是效率太低，载体的副作用明显；ニ是在同一载体上实现多基因共表达，其实现多个基因共同表达的方式主要有在多个基因之间插入独立启动子表达盒、内部核糖体结合位(LRES)或连接2A序列、Furin切割序列等。与多个携带不同治疗基因的独立载体实现共表达相比，于同一载体上实现多基因共表达可提高转移及表达效率。
发明内容
本发明的发明目的是提供ー种DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用，以解决胶质瘤对放疗不敏感的问题。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。具体地，通过构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体，由重组腺病毒对胶质瘤细胞进行感染，增加G2期细胞的比例，以提高胶质瘤细胞的放射敏感性。所述重组腺病毒载体的构建方法是
(I)针对DCX和SPARC基因序列，制备PCR引物，所述PCR引物由 DCX 正义引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反义引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、
SPARC 正义引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和
SPARC 反义引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 构成，在 DCX 两端分别引入 BglII 和KpnI酶切位点，SPARC两端分别引入NotI和XhoI酶切位点，扩增得到DCX和SPARC目的片段；
(2)双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4 DNA连接酶将其4°C连接过夜，构建单、双基因重组转移质粒载体pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter, pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ；
(3)将构建的单、双基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-Ι腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用PacI单酶切鉴定并转化DH5 α大肠杆菌；· (4)将成功重组的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大肠杆菌扩增抽提，PacI酶切线性化后用脂质体2000 (Iipofectamine 2000)转染293Α细胞，所得腺病毒为 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
本发明提供了 DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体，获得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染细胞的能力，并且显著提高了感染细胞中DCX和SPARC的表达水平，能够有效提高胶质瘤的放射敏感性。
图I是本发明实施例中的双基因连接方式示意 图2是腺病毒构建及包装示意 图3是实施例中PCR产物琼脂糖电泳图 4 是实施例中 PacI 单酶切鉴定 pAd-po I yA+pr omo ter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-poIyA+promoter-SPARC>pAdTrack-DCX-polyA-promoter-SPARC ；
图5是实施例中RT-PCR鉴定Ad-DCX-SPARC的表达；
图6是实施例中重组腺病毒体外感染U251细胞荧光表达情况；
图7是实施例中腺病毒感染后GFP阳性细胞的比例；
图8是实施例中重组腺病毒对U251生长的影响；
图9是实施例中重组腺病毒感染后照射对U251生长的影响；
图10是实施例中重组腺病毒对U251细胞周期的影响；
图11实施例中重组腺病毒感染后照射对U251细胞凋亡的影响。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进ー步描述
实施例
一.构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体 技术流程
1、针对DCX和SPARC设计引物(表1)，在DCX两端分别引入BglII和KpnI酶切位点，SPARC两端分别引入NotI和XhoI酶切位点。以人cDNA文库为模板，在Phusion高保真DNA聚合酶的作用下扩增得到DCX和SPARC的目的片段，并进行琼脂糖电泳鉴定。表I. PCR 引物
細通
For GCAAGATCTATGMMCACTCOCCCTTC
Dd -
8ct TMGGTAGLTTACATGGAATCACCAAGCG
SPARC For TMGCGGODGCATCAGGGOCTGGATOT
Rct : TAGCrCKA&raCATaOAGATOCTTCT
2、双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4DNA连接酶将其4°C连接过夜(连接方式见图I)。连接产物转化DH5a大肠杆菌，用LB琼脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)筛选抗性克隆。在DNA序列測定后，将阳性克隆保种备用。构建的单、双基因重组转移质粒载体为pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-poIyA+promoter-SPARC, pAdTrack-DCX-poIyA-promoter-SPARC。3、将构建的单、双基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-Ι腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用LB琼脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)筛选抗性克隆。用PacI单酶切鉴定并转化DH5a大肠杆菌。4、将成功重组的 pAd-po I yA+promoter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-po I yA+pr omo t er-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 a 大肠杆菌扩增抽提，PacI酶切线性化后用Iipofectamine 2000转染293A细胞，2周后观察细胞形态变化，腺病毒构建及包装总体步骤如图2所示，所得腺病毒命名为Ad-GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。5、在半数细胞脱壁后，收获细胞和上清液，反复冻融3次，释放腺病毒Ad-GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。将获得的病毒再感染293A细胞，抽提总RNA进行RT-PCR鉴定双基因的表达。实验結果
(I)引入限制性酶切位点的PCR产物的琼脂糖电泳如图3所示，DCX为1326bp，SPARC为 912bp。(2)重组 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC 用 PacI 单酶切后，琼脂糖电泳鉴定抗卡那霉素小片段(4. 5kb)的释放，如图4所示。(3)转染293A细胞2周后出现细胞空斑，收获腺病毒Ad_GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC,Ad-DCX-SPARC,再次感染293A细胞，观察细胞病变情況，RT-PCR检测双基因的表达，PCR产物如图5所示，可见Ad-DCX-SPARC感染的细胞中DCX和SPARC的表达水平显著提高。实验结果表明成功构建了 DCX和SPARC双基因共表达的重组腺病毒，获得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染细胞的能力，并且显著提高了感染细胞中DCX和SPARC的表达水平。ニ、构建的DCX和SPARC双基因功能实验方法
I重组腺病毒的大量扩增
将第一部分构建获得的pAd-po lyA+promoter(以下简称为Ad-GFP)、pAd-DCX-polyA+promoter (以下简称 Ad-DCX) > pAd-polyA+promoter-SPARC (以
下简称 Ad-SPARC)和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC(以下简称 Ad-DCX-SPARC)腺病毒再分别多轮感染QBI-293A细胞中进行大量繁殖，待出现细胞病变效应明显，荧光显著增强时，收集细胞并反复冻融3次，2000r/min离心5min，取病毒上清，于_80°C保存。2.重组腺病毒的效价检测
将对数生长期的QBI-293A细胞胰酶消化后，调整细胞浓度为I X IO5个/mL，在96孔板上按每孔100 μ L接种细胞，培养24h后，将上述获得的Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC 重组腺病毒作 I (Γ1、I (Γ2、I (Γ3、I (Γ4、I (Γ5、I (Γ6、I (T7、I (Γ8、I (Γ9、I (Γ1。`、I (Γ11 稀释后，每个稀释度按每孔100 μ L接种3孔，370C，5%C02细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下，进行荧光计数，按病毒效价(pfu/mL)=(每孔荧光数X 10)/稀释度公式计算腺病毒效价。3.重组腺病毒对胶质瘤细胞的感染效率
将经0. 25%胰酶消化分散的人脑胶质瘤细胞U251用10%FBS DMEM完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为I X IO5个/ml，每孔100 μ L接种于96孔培养板，37°C，5%C02培养过夜。次日Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒体外分别以1、5、10、25、50、75、100、200 MOI不同剂量感染胶质瘤细胞，各分为5组细胞对照组、空载体Ad-GFP、单基因Ad-DCX、单基因Ad-SPARC和双基因Ad-DCX-SPARC组感染24h后在荧光显微镜下观察细胞中GFP绿色荧光表达情況，以判断重组腺病毒不同感染剂量对胶质瘤细胞的感染效率，g在筛选最佳感染剂量进行重组腺病毒感染。三、通过增加DCX-SPARC双基因表达联合放疗的体外实验，探讨对脑胶质瘤生长转移的影响及作用机制。I.流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例
将U251脑胶质瘤细胞每孔100万接种于六孔板中，37°C，5%C02培养过夜。次日Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒体外分别以20M0I不同剂量感染胶质瘤细胞，感染24h后，收集细胞后上流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。2.重组腺病毒对胶质瘤细胞生长的影响
将处于对数生长期的U251细胞用0. 25%胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数调整细胞浓度为3X IO4个/ml，每孔100 μ L接种于96孔板，待细胞贴壁后，将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I剂量感染细胞，每组均设5个平行孔。37°C，5%C02培养箱中培养，培养若干天，每孔加入20 μ LMTT (5mg/mL), 37°C继续培养4h后在加入DMS0150 μ L/孔，于37°C充分溶解后，在酶标仪570nm下測定吸光值(0D值)，以OD值为纵坐标，天数为横坐标绘制细胞生长活力图。3.重组腺病毒感染后对照射后U251细胞生长的影响
将处于对数生长期的U251细胞用0. 25%胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数调整细胞浓度为5X IO4个/ml，每孔100 μ L接种于96孔板，待细胞贴壁后，将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I剂量感染U251细胞后48h进行X射线照射(4、8Gy)，MTT检测2天后细胞的生长活力。4.细胞周期分析
取对数生长期细胞制成单细胞悬液，每组三个平行样，60mm培养皿中培养过夜，隔日将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I剂量感染细胞，继续培养48h后检测细胞周期分布。各组细胞用胰酶消化，制备单细胞悬液，1000rpm，5min离心，弃上清，PBS洗2次以去除细胞碎片，200 μ L PBS重悬细胞，缓慢加入70%冷こ醇2mL，吹打均匀，4°C固定过夜，1000rpm，5min离心，弃上清，PBS洗2遍，カロ2(^g/mL RNase 37°C水浴消化30min，再以2 (^g/mL的PI (碘化丙啶)染色液置4°C避光染30min,上机检测。5、照射后细胞凋亡检测
取对数生长期细胞制成单细胞悬液，每组三个平行样，隔日将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I剂量感染细胞，48h后对各组细胞进行X射线照射(8Gy)。继续培养48h后细胞用O. 25%胰酶消化并收集，制备单细胞悬液，IOOOrpm, 5min离心，弃上清，预冷的PBS洗2次，重悬细胞于I XBinding Buffer中，调整细胞浓度为IXlOfVmL,取IOOyL的细胞悬液分别加入5μ L PE Annexin V和
5μ L7-AAD.室温避光作用15min，加入400 μ LI XBinding Buffer, Ih内上机检测细胞凋亡率。实验结果
I闻效价腺病韋的获得
Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC腺病毒粗提液经过多轮感染293A细胞和扩增后，获得了高滴度和高纯度的Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC腺病毒，其效价分别为109 ；109 ；109 ；109 (pfu/ml)。2.激光共聚焦显微镜观察重组腺病毒体外感染U251细胞荧光表达情况
将 Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC 和 Ad-DCX-SPARC 腺病毒分别以 1，5，10，20，50，100，200M0I不同剂量感染U251细胞。感染24h后，在激光共聚焦显微镜下观察空载腺病毒和不同剂量重组腺病毒对U251细胞的感染情況。结果显示(图6)在20M0I时，U251细胞中GFP表达的细胞可达95%以上，故20M0I为这几种腺病毒的最佳感染剂量。3.流式细胞仪检测腺病毒感染后GFP阳性细胞的比例
流式细胞仪检测显示空白对照组，空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I的剂量感染U251细胞后，表达GFP的细胞比例分别为
I.49%, 98. 81%, 99. 52%, 95. 02%, 98. 96%。4.重组腺病毒感染后对U251细胞生长的影响
空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I的剂量感染U251细胞后，MTT检测0-6天细胞的生长活力，并绘制细胞生长曲线，由图8可见，Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC 在 20M0I 均有明显的抑制作用，并且 Ad-DCX-SPARC 明显强于Ad-DCX和Ad-SPARC，与空白对照组和Ad-GFP组比较呈显著性差异(P〈0. 05)。5.重组腺病毒感染后对照射后U251细胞生长的影响
空载体腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因重组腺病毒以20M0I的剂量感染U251细胞后48h进行X射线照射(4、8Gy)，MTT检测2天后细胞的生长活力，由图9可见，Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC在照射后对细胞的抑制作用随照射剂量增加而更为明显，并且Ad-DCX-SPARC明显强于Ad-DCX和Ad-SPARC，与空白对照组和Ad-GFP组比较呈显著性差异(P〈0. 05)。6.重组腺病毒对U251细胞周期的影响
用流式细胞仪分析了各重组腺病毒感染后细胞周期分布的变化。结果显示(图10):Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC单、双基因组均出现了 G2期细胞比例的增加(即G2期阻滞的出现)(P〈0. 05)，G2 期细胞的比例分别达至Ij 19. 043%, 18. 044%, 22. 413%,且 Ad-DCX-SPARC双基因组G2期阻滞更为显著，与空白对照(G2期细胞比例10. 984)和Ad-GFP组(G2期细胞比例11. 296)相比差异具有统计学意义(p〈0. 05)，G2-M期放射敏感性最高，故増加这两种基因的表达比增加单个基因的表达更能够增加胶质瘤细胞的放射敏感性，提高治疗效果。7.重组腺病毒感染后照射对U251细胞凋亡的影响
检测重组腺病毒感染后细胞辐照前后细胞凋亡的情況。结果表明(图ll)，8Gy照后48h时细胞的凋亡率均较OGy组增加。而且，感染了 Ad-DCX, Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC细胞的凋亡率均高于空白对照组和空载腺病毒组(P〈0. 01), Ad-DCX-SPARC组凋亡率尤为显著，表明增加DCX和SPARC的表达可提高辐射诱导的U-87MG细胞凋亡。
权利要求
1.DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于通过构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体实现。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述重组腺病毒载体的构建方法是 (1)针对DCX和SPARC基因序列，制备PCR引物，所述PCR引物由DCX 正义引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反义引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正义引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反义引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 构成，在 DCX 两端分别引入 BglII 和KpnI酶切位点，SPARC两端分别引入NotI和XhoI酶切位点，扩增得到DCX和SPARC目的片段； (2)双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4 DNA连接酶将其4°C连接过夜，构建单、双基因重组转移质粒载体pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ； (3)将构建的单、双基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-Ι腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用PacI单酶切鉴定并转化DH5 α大肠杆菌； (4)将成功重组的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大肠杆菌扩增抽提，PacI酶切线性化后用脂质体2000转染293Α细胞，所得腺病毒为Ad_GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。
全文摘要
本发明公开了DCX和SPARC双基因共表达载体在制备放疗增敏剂中的应用。通过构建DCX和SPARC双基因共表达重组腺病毒载体能够有效提高胶质瘤的放疗敏感性。
文档编号A61P35/00GK102836442SQ20121034034
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者刘芬菊, 徐媛媛, 蒋昕, 俞家华 申请人:苏州大学