一种银杏叶提取物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种银杏叶提取物的制备方法，它公开了一种从天然银杏叶中提取有效成分的制备方法，包括以下步骤：1)将银杏叶投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取；2)将提取物溶液投入到大孔吸附树脂柱中，用乙醇水溶液进行分离、纯化；3)加入乙醇水溶液回流溶解，常温过滤，取滤液，除去溶剂干燥得成品；本发明方法条件温和、操作简单，周期短，产品易于分离纯化，收率、纯度高，溶剂可回收利用、生产成本低，提取物中无有毒试剂残留、环境污染小，适用于银杏叶提取物工业化生产。
【专利说明】一种银杏叶提取物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然药物化学领域，尤其涉及一种银杏叶提取物的制备方法。
【背景技术】
[0002]银杏(Ginkgo biloba L.)又名公孙树，白果，是裸子植物银杏科植物，是当今地球上最古老的树种之一。银杏全身都是宝，集果用、叶用、材用、花粉用、防护用和观赏用于一身。银杏的药用价值，我国古代就有记载，《本草纲目》记载，白果可“入肺经、益脾气、定咳喘、缩小便、性平味甘苦潘，有小毒”，可治哮喘、痰咳、白带、遗精、淋病、小便频数等。银杏是一种药用价值极高的植物，而银杏叶中的活性成分的研究备受亲睐。
[0003]银杏叶提取物的主要生物活性成分是总黄酮类和萜类内酯类，总黄酮以山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercitrin)、异鼠李素(Isorhamntin)的苷为主；職类内酯则以银杏内酯(ginkgolide A.B.C)和白果内酯(bilodalide)为主。银杏提取物具有强抗氧化性，能有效清除体生物内过剩的自由基，达到延缓衰老的功能；银杏提取物的萜类化合物具有抗血小板凝集的功能。此外，银杏叶提取物可扩张冠脉血管，增加脑血流量，拮抗血小板活化因子，可治疗由于血管老化、脑血管供血不足所致的多种疾病。[0004]关于银杏叶提取物的制备方法研究，国内外已经有大量报道。这些提取银杏叶中活性成分的方法，具有操作繁琐、成本高、有效成分流失严重、提取物收率较低、污染严重、不利于工业化生产等缺点。
【发明内容】
[0005]为了克服上述银杏叶提取物制备方法的缺陷，本发明提供一种方法简单、操作方便、收率极高、成本低廉、提取物中无有毒试剂残留、污染小的银杏提取物制备方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案，具体操作方法为:
[0007]步骤I)将银杏叶投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取，合并提取液，浓缩得到密度为0.7-1.2g/ml的浓缩物A ；
[0008]步骤2)浓缩物A用水溶解后投入到DM130、AB_8、DMl31或D318大孔吸附树脂柱中充分吸附，依次用体积分数为O %、10-30 % >40-80 %的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集40-80%乙醇水洗脱液并浓缩得到浓缩物B ;浓缩物B用乙醇水溶液溶解后投入到DlOl、HPD100、LKY134或DM2大孔吸附树脂柱中充分吸附，用体积分数为40-80%的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至密度为0.7~1.2g/ml，得到浓缩物C ；
[0009]步骤3)浓缩物C中加入乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，干燥后到银杏叶提取物成品。
[0010]将制备的银杏叶提取物通过高效液相进行表征鉴定，与2010版中国药典的表征数据一致；同时采用高效液相色谱法分析银杏叶提取物成品总银杏酸、总黄酮醇苷、萜类内酯的含量与收率。
[0011]所述步骤I)中，经过发明人多次预实验，发现乙醇水体积分数为50-85%时，对银杏叶中总黄酮类、萜类内酯化合物的提取比较完全。体积分数为50-85%乙醇水溶液的用量以投料的银杏叶体积的8-15倍体积为宜，低于8倍体积时，提取液浓度过高，使得提取效率明显降低；高于15倍体积时，很容易将其他杂质成分引入提取液中，增加了后续工作的难度，加之提取液总体积急剧增加，加大了浓缩的工作量。
[0012]所述步骤I)中，用乙醇水溶液热回流提取银杏叶的温度控制在70-90°C为宜，温度过低会降低提取效率，温度过高容易破坏银杏叶中的有效成分。
[0013]所述步骤I)中，用乙醇水溶液热回流提取银杏叶的次数优选2-4次，每次1.5-2.5小时，进一步的，优选为提取次数为2次，每次提取2小时。
[0014]所述步骤2)中，经发明人反复筛选，结合银杏叶提取物有效成分的理化分析，最终选定以DM130、AB-8、DM131或D318大孔吸附树脂柱对银杏叶提取浓缩物进行乙醇水溶液梯度洗脱，用D101、HPD100、LKY134或DM2大孔吸附树脂柱对浓缩物B进行进一步纯化，其分离效果好，且溶剂可以回收利用，便于产业化生产。
[0015]所述步骤2)中，发明人对银杏叶提取浓缩物进行梯度洗脱时，依次用I倍柱体积纯水、2倍柱体积的体积分数为10-30%乙醇水溶液进行梯度洗脱，能有效去除浓缩物中的色素及其大极性成分，提高银杏提取物有效成分的纯度；用3倍柱体积的体积分数为40-80%乙醇水溶液梯度洗脱，能有效富集有效成分，提高有效成分的含量。
[0016]所述步骤3)中，结合银杏叶中总黄酮类及其萜类内酯的理化性质，选用10-30倍体积分数为60-95%的乙醇水溶液对浓缩物C回流溶解，进一步除去杂质，增加总黄酮类及其萜类内酯的纯度。
[0017]采用高效液相色谱法对银杏叶提取物的色谱图与2010年中国药典进行表征比较，从而增加了对银杏提取物各成分指认的准确性。
[0018]通过高效液相色谱法分析总银杏酸、总黄酮醇苷、萜类内酯等的含量与收率，方法简单,结果准确可靠。
[0019]高效液相色谱分析条件为:柱长及型号:Sapphire C18 4.6 X 250mm, 5 μ m,柱温:30°C，流速:lml/min。总银杏酸:流动相:A相:甲醇，B相:I %冰醋酸水溶液，A相:B相=90: 10，检测波长:310nm ;总黄酮醇苷:流动相:A相:甲醇，B相:0.4%磷酸水溶液，A相:B相=50: 50，检测波长:360nm ;萜类内酯:A相:正丙醇:四氢呋喃=I: 15，B相:水，A相:B相=16: 84，检测器:蒸发光散射检测器。
[0020]制备的银杏叶提取物通过高效液相进行表征鉴定，与2010版中国药典的表征数据一致。通过高效液相色谱法分析总银杏酸、总黄酮醇苷、萜类内酯的含量与收率。其中，总银杏酸< 2ppm，总黄酮醇苷含量为24.0% -27.5%，总萜类内酯≥6.0%，其中银杏内酯A≥2.2%，银杏内酯B≥1.2%，银杏内酯C≥1.3%，收率≥2%。
[0021]本发明以天然植物银杏叶为起始原料，用乙醇水溶液提取，大孔树脂吸附，乙醇水溶液洗脱，乙醇溶液精制，可得到高收率、高质量的银杏叶提取物。本发明方法与已报道文献方法相比有如下优点:
[0022]1.以乙醇水溶液为提取溶剂，成本低，提取物中无有毒试剂残留、无环境污染，试剂可回收利用；
[0023]2.以大孔树脂为吸附剂，乙醇水溶液为洗脱剂，成本低，分离效果好；
[0024]3.银杏叶提取物成品收率高，质量好，生产操作简单，便于工业化生产；[0025]4.通过高效液相色谱法进行表征鉴定、并对银杏提取物中总银杏酸、总黄酮醇苷、萜类内酯的含量与收率进行分析，操作简单，结果准确可靠。
【具体实施方式】[0026]下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]实施例1
[0028]本实施例提取银杏叶提取物的操作方法按照如下两个步骤来进行:
[0029]银杏叶提取物粗品的制备:将200g银杏叶投于3L圆底烧瓶中，用2000g体积分数为65%乙醇热回流提取2次，每次2小时。合并提取液，浓缩至密度为0.75g/ml，加入450g纯化水溶解。将溶液投入到200g大孔树脂(DM130)柱中。依次用375ml纯水、750ml体积分数10%乙醇、1125ml体积分数80%乙醇洗脱，流速为3倍柱体积/小时。收集体积分数为80%的乙醇水洗脱液，浓缩，加入400L体积分数为50%乙醇溶解，将溶液投入到200g大孔树脂(HPD100)柱中。上完样后，加750ml体积分数为50%乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至密度为0.8g/ml，得银杏叶提取物粗品。
[0030]银杏叶提取物成品的制备:往浓缩物中加入100ml体积分数为80%乙醇回流溶解，常温过滤，得滤液，回收溶剂，得成品。总黄酮醇苷含量为25.5 %，总萜类内酯含量为14.12%，其中银杏内酯A含量为3.94%，银杏内酯B含量为1.99 %，银杏内酯C含量为
3.94%,总银杏酸未检出，收率2.23%。
[0031]实施例2
[0032]银杏叶提取物粗品的制备:将200g银杏叶投于3L圆底烧瓶中，用2200g体积分数为80%乙醇热回流提取3次，每次2小时。合并提取液，浓缩至密度为0.9g/ml，加入600g纯化水溶解。将溶液投入到300g大孔树脂(AB-8)柱中。依次用375ml纯水、750ml体积分数为20%乙醇、1125ml体积分数为80%乙醇洗脱，流速为3倍柱体积/小时。收集体积分数为80%的乙醇水洗脱液，浓缩，加入500L体积分数为50%乙醇溶解，将溶液投入到250g大孔树脂(LKY134)柱中。上完样后，加750ml体积分数为50%乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至密度为0.9g/ml，得银杏叶提取物粗品。
[0033]银杏叶提取物成品的制备:往浓缩物中加入150ml体积分数为80%乙醇回流溶解，常温过滤，得滤液，回收溶剂，得成品。总黄酮醇苷含量为26.7 %，总萜类内酯含量为
14.89%，其中银杏内酯A含量为3.75%，银杏内酯B含量为1.93 %，银杏内酯C含量为
4.71%,总银杏酸未检出，收率2.43%。
[0034]实施例3
[0035]银杏叶提取物粗品的制备:将200g银杏叶投于3L圆底烧瓶中，用3000g体积分数为65%乙醇热回流提取两次，每次2小时。合并提取液，浓缩至密度为1.1，加入600g纯化水溶解。将溶液投入到400g大孔树脂(DM131)柱中。依次用375ml纯水、750ml体积分数为30%乙醇、1125ml体积分数为70%乙醇洗脱，流速为3倍柱体积/小时。收集体积分数为80%的乙醇水洗脱液，浓缩，加入500L体积分数为40%乙醇溶解，将溶液投入到300g大孔树脂(DM2)柱中。上完样后，加900ml体积分数为60%乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至密度为l.0g/ml，得银杏叶提取物粗品。
[0036]银杏叶提取物成品的制备:往浓缩物中加入300ml体积分数为90%乙醇回流溶解，常温过滤，得滤液，回收溶剂，得成品。总黄酮醇苷含量为25.8 %，总萜类内酯含量为15.62%，其中银杏内酯A含量为4.57%，银杏内酯B含量为1.91 %，银杏内酯C含量为
4.78%，总银杏酸未检出，收率2.40%。
[0037]实施例4
[0038]银杏叶提取物粗品的制备:将IOkg银杏叶投于提取罐中，用IOOkg体积分数为70%乙醇热回流提取两次，每次2小时。合并提取液，浓缩至密度为0.9，加入25kg纯化水溶解。将溶解液投入到IOkg大孔树脂(AB-8)柱中。依次用15kg纯水、30kg体积分数为35%乙醇、45kg体积分数为80%乙醇洗脱，流速为3倍柱体积/小时。收集体积分数为80%的乙醇水洗脱液，浓缩，加入20kg体积分数为50%乙醇溶解，将溶液液投入到IOkg大孔树月旨(DM130)柱中。上完样后，加30kg体积分数为50%乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩至密度为0.9g/ml，得银杏叶提取物粗品。
[0039]银杏叶提取物成品的制备:往浓缩物中加入6kg体积分数为75%乙醇回流溶解，常温过滤，得滤液，回收溶剂，得成品。总黄酮醇苷含量为26.9%，总萜类内酯含量为14.30%，其中银杏内酯A含量为4.25%，银杏内酯B含量为1.94%，银杏内酯C含量为
4.25%，总银杏酸未检出，收率2.23%`。
【权利要求】
1.一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤I)将银杏叶投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取，合并提取液，浓缩得到密度为0.7-1.2g/ml的浓缩物A; 步骤2)浓缩物A用水溶解后投入到DMl30、AB-8、DMl31或D318大孔吸附树脂柱中充分吸附，依次用体积分数为O %、10-30 % >40-80 %的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集40-80 %乙醇水洗脱液并浓缩得到浓缩物B ;浓缩物B用乙醇水溶液溶解后投入到D101、HPD100、LKY134或DM2大孔吸附树脂柱中充分吸附，用体积分数为40-80%的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至密度为0.7-1.2g/ml，得到浓缩物C ； 步骤3)浓缩物C中加入乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，干燥后到银杏叶提取物成品。
2.如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，乙醇水溶液的体积分数为50-85%。
3.如权利要求2所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，乙醇水溶液的用量为提取物体积的8-15倍。
4.如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中回流提取次数为2-4次，每次提取1.5-2.5小时，提取温度为70-90°C。
5.如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，银杏叶浓缩物A用2-4倍纯化水进行溶解。
6.如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，大孔树脂柱的体积:银杏原叶质量 为l_2ml: Ig0
7.如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，依次用体积分数为0^^10-30^30-80%的乙醇水溶液洗脱，所用洗脱体积分别是I倍柱体积、2倍柱体积、3倍柱体积，流速为3倍柱体积/小时。
8.如权利要求1所述的一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，D101/HPD100/LKY134/DM2大孔吸附树脂用量为提取物质量的8_15倍，洗脱液为体积分数为40-80%乙醇水溶液，用量为1.5-2.5倍柱体积。
9.如权利要求1所述的一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，乙醇水溶液的体积分数为60-95%，加入的乙醇水溶液体积为浓缩物C体积的10-30倍。
10.如权利要求1所述的一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中干燥为喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥。
【文档编号】A61K36/16GK103655642SQ201210353451
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月21日 优先权日:2012年9月21日
【发明者】罗春, 黄丽丝 申请人:广州白云山汉方现代药业有限公司