专利名称：基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种人源而/7的新用途。特别是人源而/7基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用。
背景技术：
脑胶质瘤(glioma)是由神经外胚层分化而来的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等)发生的肿瘤。胶质瘤在颅内肿瘤中发病率位于第一位，约占45%左右。胶质瘤的治疗问题是神经外科中较为棘手的一个问题，由于其死亡率高，预后较差，无法控制的细胞增殖、细胞凋亡减慢，肿瘤细胞侵袭性强等使肿瘤的治疗面临巨大的困难，患病后手术加放化疗的平均生存期仅为8 11个月。目前肿瘤治疗主要有以下几种方法手术治·疗、化学药物、治疗放射治疗、光动力治疗。但这四种治疗方法对大脑损伤性大，易复发，对患者机体消耗大，也无法起到根治目的。树突状细胞因子(dendritic cell factor I, dcfl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59,是单次跨膜蛋白。根据基因芯片GDS2853分析显示，随着胶质瘤级别的升高，dcfl基因表达量呈现下调状态。同时，dcfl基因敲除小鼠基因芯片和蛋白芯片表明，敲除而/7后，贫/每7 (胶质细胞标记物)表达量上调。2008年Wang，L; et al研究证明，在神经干细胞中，过量表达而/7，可维持神经干细胞未分化状态，而沉默ofc/7则能促进神经干细胞的分化。2012年Li, X; et al通过小分子microRNA-351,下调而/7的表达后，神经干细胞系C17. 2向胶质方向分化。以上结果都表明，而/2表达量下调可能促进胶质细胞发生。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种人源而/2基因在诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。本发明的目的之二在于提供人源i/c/7基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值中的应用。本发明的目的之三在于提供人源而/2基因在抑制肿瘤生长中的应用。技术方案本发明通过培养U251胶质瘤细胞系，运用Lipofectamine 2000Transfection Reagent阳离子脂质体转染法，在U251细胞中分别转染pEGFP_N2和PEGFP-N2-DCF1，使其分别表达EGFP绿色荧光蛋白和EGFP-DCF1融合蛋白，前者作为对照。发绿色突光的融合蛋白可指示ofc/V在细胞中的分布，进一步运用ofc/V —抗和胶体金二抗，可在电镜下观察胶体金颗粒，从而确定其亚细胞定位。通过CCK8试剂盒，检测细胞增殖能力。JC-I染料检测细胞线粒体膜电位。电镜和原子力显微镜观察线粒体外观，判断线粒体是否发生病变。Western检测过表达而/7后凋亡相关蛋白表达量是否发生变化，从而在凋亡机制上做初步探索。运用裸鼠肿瘤异位移植技术，在体内层面判断而/7基因对胶质瘤的治疗作用。
本发明通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC-I染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对而/7诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcfl通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，而/7能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。
图I为-.dcfl基因扩增及重组质粒PEGFP-N2-DCF1酶切鉴定。A图为以Hela细胞cDNA为模板，通过PCR法扩增获得人源dcfl基因片段，全长972bp。图中最左边泳道为DNAMarkerCSM#0311),泳道I为dcfl基因PCR后扩增产物。B图为重组质粒pEGFP_N2_DCFl酶切鉴定图。泳道I为空载PEGFP-N2经EcoRI单酶切，2_5为阳性克隆经EcoRI和BamHI双酶切后释放出目的条带ifc/i(972bp)及空载片段(4700bp)。表明重组质粒pEGFP_N2_DCFl构建成功，经测序验证正确后用于后续实验方案。图2为U251细胞系中转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1。EGFP-DCFI融合蛋白(图A, C)呈现核外点状分布，B图为DAPI细胞核染色，E图DCFl蛋白免疫荧光，C图为A图与B图叠加。F图为D图与E图叠加。(放大倍数200倍；标尺50um)
图3为EGFP-DCF1融合蛋白与线粒体染料MitoTracker-Red共定位。EGFP-DCF1融合蛋白(图A)与线粒体(图B)存在共定位，C图为A图与B图的叠加。图4为'dcfl基因可定位于线粒体。Western检测转染重组质粒pEGFP_N2_DCFl的U251细胞系线粒体中有DCFl蛋白的存在(图A)。DCFl免疫电镜观察发现在转染重组质粒pEGFP-N2-DCFl的U251细胞系线粒体处有少量胶体金被标记(图B)。(放大倍数20000倍；标尺500nm)
图5为在胶质瘤细胞系中过量表达可抑制细胞增殖能力。U251细胞系过量表'lkdcfl引起细胞增殖能力下降，细胞皱缩(图A)，从左至右依次为对照组，转染空载质粒PEGFP-N2组，转染重组质粒pEGFP-N2-DCFl。CCK8检测表明dcfl能极显著降低U251细胞增殖能力(图B)，同时也表明dcfl能显著降低U87MG细胞系增殖能力，但其抑制效果比U251稍差(图C)。但i/c/7基因过量表达对K562，H1299，Hek293T细胞系增殖能力未有影响。*，Ρ〈0· 1;**，Ρ〈0·05，***，Ρ〈0·001。(放大倍数100 倍；标尺 200um)
图6为过量表达可引起U251细胞系线粒体膜电位下降。U251细胞系经线粒体电子传递链抑制剂CCCP处理后，线粒体膜电位下降，JC-I无法聚集，呈现绿色(图A)。对照组线粒体膜电位正常，JC-I聚集体呈红色(图B)。转染空载质粒pEGFP-N2组，JC-I也呈现红色，大块绿色为EGFP发光(图C)。转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1 48小时候，JC-I主要呈现绿色，与药物处理组相似(图D)，说明过表达而/7后，U251细胞线粒体膜电位发生下降。(放大倍数100倍；标尺200um)
图7为过表达而/7引起U251细胞线粒体肿胀，最终引起细胞凋亡。(A，D，G)图为对照，(B，E，H)图为U251细胞转染空载对照pEGFP-N2，(C，F，I)图为U251细胞转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1。(A-C)图为透射电镜观察U251细胞结构。对照与空载组细胞结构完整，核仁清晰可见(图A，B);实验组细胞核裂解，胞质中出现大量空泡状结构，并包含数个自噬体存在，呈现典型凋亡特征(图C)。(D-F)图为透射电镜观察细胞线粒体结构形态。对照与空载组线粒体结构完整，可见嵴结构存在(图D，E);实验组中多个线粒体发生严重肿胀，嵴发生破裂，存在严重病变(图F)。(G-I)图为原子力显微镜观察抽提的U251细胞线粒体。对照与空载组线粒体尺寸在600nm左右，表面光滑(图G，H);实验组线粒体发生肿胀，尺寸在1600nm左右，且线粒体外膜呈现多孔状结构，这与线粒体通透性孔开放有关，表明线粒体功能发生异常(图I)。图8为调亡相关重要蛋白Western检测。结果表明，过表达t/c/7后,调亡关键蛋白procaspase-3酶被剪切成有活性的形式(17kD，19 kD)，抑凋亡基因Bcl_2表达发生下调，促凋亡基因Bax表达上调。从机制上对而/2引起U251细胞凋亡做出初步解释。图9为裸鼠成瘤实验结果表明dcfl能显著减小胶质瘤的体积，抑制肿瘤生长。A图为接种U251细胞裸鼠成瘤结果，B图为A图中肿瘤鼠解剖后所得肿瘤体积比较。从左至右分别为注射U251细胞，注射转染空载对照pEGFP-N2 U251细胞，注射转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1 U251细胞。图中明显可见实验组肿瘤体积小于对照组，且在成瘤时间及肿瘤生长速度上也有明显差异。
具体实施例方式实施例一 'dcfl基因扩增及重组质粒PEGFP-N2-DCF1酶切鉴定
I、以HeLa细胞的cDNA为模版进行PCR扩增，在dcfl弓丨物两端分别弓I入EcoRI和BamHI酶切位点。上游引物为(5’ -CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGGAG-3’)，
下游引物为(5，-CGGGATCCGTAAAATTTCAGAATGAGCA-3’)，Tm 为 53 摄氏度，30 个循环后获得大小为972bp的目的片段(图1A)。2、获得阳性重组质粒pEGFP-N2-DCFl后，对重组子进行双酶切鉴定。酶切体系中同时添加EcoRI和BamHI两种酶，对照采用pEGFP_N2 EcoRI单酶切，37摄氏度反应2小时，电泳鉴定酶切结果，在972bp处有条带释放，说明而/2片段已插入到阳性重组质粒中(图1B)。实施例二 质粒pEGFP-N2-DCFl转染
U251 细胞系铺 24 孔板 24 小时后，米用 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent阳离子脂质体转染法转染质粒pEGFP -N2-DCF1。每孔Iul lipo2000，Iug质粒pEGFP-N2-DCF1分别溶于50ul无血清DMEM培养基，室温静置5分钟后，将两者混匀，室温静置20分钟。将孔板中培养基更换成400ul无血清DMEMJPA IOOul上述混合产物。37摄氏度培养6小时后，将培养基换成含10%胎牛血清DMEM。转染后48小时检测荧光发光情况(图2A-C)。实施例三细胞免疫荧光
U251细胞转染后48小时，弃培养基，PBS洗三次。4%PFA固定10分钟，PBS洗三次。1% Triton-XlOO通透10分钟，PBS洗三次。2%BSA_PBS室温封闭I小时。1%BSA_PBS稀释DCFl兔源多抗(I: 700)，37摄氏度孵育I小时，PBS洗三次。1%BSA_PBS稀释TRITC荧光二抗(I: 300)，避光37摄氏度孵育40分钟，PBS洗三次，荧光显微镜观察(图2D-F)。实施例四线粒体染料Mitotracker-Red染色
含10%胎牛血清DMEM培养基配制Mitotracker-Red工作液(1:1500), 37摄氏度预热。弃培养基，PBS洗一次。加入预热Mitotracker-Red工作液，37摄氏度孵育30分钟。弃去染色液，加入预热的含10%胎牛血清DMEM，荧光显微镜观察(图3)。
实施例五Western
细胞培养于60mm培养皿，弃培养基，4摄氏度保存的PBS洗三次。置于冰上，加入IOOul细胞蛋白裂解液。每隔15分钟枪头吹打混匀，反应I小时后将裂解液收集于I. 5ml EP管中。4°C，12000rpm离心10分钟。上清即为细胞全蛋白，BCA法测定浓度。每孔蛋白上样量为25ug。电泳条件浓缩胶80V，30分钟；分离胶120V，90分钟。转膜条件20V，90分钟。一抗稀释比例1:3000，二抗稀释比例1:10000 (图4A)。实施例六免疫电镜
取置于镍网上电镜切片，1%双氧水室温处理10分钟，PBS (pH7. 4)洗三次。镍网浮于1%BSA - PBS (pH7. 4)液滴上，室温孵育I小时，阻断非特异性吸附。镍网转移至1%BSA —PBS (pH7. 4)稀释的一抗(1:700)液滴上，4°C孵育过夜。PBS (pH7. 4)洗三次，PBS (ρΗ8· 2)洗三次。I % BSA-PBS (pH8. 2) 37°C孵育 I 小时。胶体金二抗用 I % BSA-PBS (ρΗ8· 2)稀释(I :50)，淡红色为适宜稀释液，载网浮于该液滴上，室温孵育30分钟。PBS (ρΗ8.2)洗三 次，PBS (ρΗ7. 4)洗三次。吸干PBS后送样观察(图4Β)。实施例七CCK8细胞增殖能力检测
于转染开始O小时，每隔12小时对细胞增殖能力进行检测。96孔板中，反应液为4ulCCK8+96ul无血清DMEM，37摄氏度避光反应30分钟。酶标仪测0D450nm处吸光值，绘制增殖曲线(图5)。实施例八JC-I检测线粒体膜电位
U251细胞转染48小时后，弃培养基，PBS洗一次。加入配制好的JC-I染色液(每Iml染色液=5ul JC-l+800ul ddH20+200ul 5X染色缓冲液)，37摄氏度避光反应20分钟。弃染色液，JC-I染色缓冲液(IX)洗两次。荧光显微镜下拍照观察(图6)。实施例九裸鼠肿瘤移植
胰酶消化后分别收集转染PEGFP-N2、pEGFP-N2-DCFl 48小时后的U251细胞及只添加Lipo2000的U251细胞，数量为2*107。注射于雄性6周BALB/c裸鼠右侧腋下，留针30秒，共三组，每组4只。观察裸鼠成瘤情况(图9)。
权利要求
1.人源dcfl基因在诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。
2.人源dcfl基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值中的应用。
3.人源而/2基因在抑制肿瘤生长中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种人源dcf1基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值和诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。本发明通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC-1染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对dcf1诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcf1通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，dcf1能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。
文档编号A61P35/00GK102940890SQ20121038245
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者文铁桥, 谢雨琼, 杨眉, 杨清波 申请人:上海大学