透明质酸改性的多孔钛涂层及其制备方法
【专利摘要】一种透明质酸改性的多孔钛涂层及其制备方法，所述透明质酸改性的多孔钛涂层采用生物化学改性方法，通过共价键接枝方式，在多孔钛涂层表面固定有透明质酸。本发明所提供的透明质酸改性的多孔钛涂层，具有良好的稳定性和生物学性能，可改善钛涂层的临床效果。本发明的制备方法工艺简单、效率高、可重复性好，解决了现有技术中所存在的透明质酸吸附稳定性差等问题，为医用生物涂层技术提供新的方法。
【专利说明】透明质酸改性的多孔钛涂层及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种透明质酸改性的多孔钛涂层及其制备方法，具体涉及一种采用共价键接枝方式在等离子体喷涂钛涂层表面固定有透明质酸并具有良好生物学性能的透明质酸改性的多孔钛涂层及其制备方法，属于医用生物涂层【技术领域】。
【背景技术】
[0002]骨替换材料是一类用于取代或修复人体骨组织、增进其功能的材料。临床应用的骨替换材料不但要求其具有良好的生物相容性，能够有效和长期在生物体内行使其功能，还应具有良好的骨传导和骨整合能力，促使骨组织再生，缩短术后愈合时间，减轻病人的痛苦。
[0003]采用等离子体喷涂技术在钛合金等医用金属(合金)表面制备的多孔钛涂层，能与宿主骨组织产生机械嵌合作用，恢复机体功能，是临床常用的骨植入材料。然而，钛涂层属于生物惰性材料，不具有生物活性，不能与骨组织产生直接的化学键合作用，特别是其早期成骨性能有待提高。
[0004]透明质酸一种重要的糖胺聚糖，是细胞外基质主要成分，影响着细胞粘附、迁移、增殖和分化，在生物医用材料领域的研究广受重视(Jing Ma, etal.Journal of Membrane Science.2010(364):290-297.)。Lei 等(Yuguo Lei,etal.Biomaterials.2011 (32):39-47.)制备了透明质酸基水凝胶，发现该水凝胶对大鼠间充质干细胞的行为具有促进作用。因此，若将透明质酸固定在钛涂层上，则可以使钛涂层具有透明质酸的生物活性，从而获得生物学性能更好的改性多孔钛涂层。中国专利CN102218159A公开一种通过喷涂透明质酸水溶液然后干燥的方法在颅骨缺损修复钛网表面涂覆透明质酸，但该法无法形成均匀覆盖基材表面的透明质酸薄层，并且容易脱附。而通过共价键结合透明质酸可以增强其结合稳定性，例如中国专利CN101052427A公开一种在金属或聚合物性质的植入器械上涂覆具有氨基的涂层然后通过透明质酸的羟基的胺化而结合透明质酸的方法，中国专利CN1173824A公开一种在缩合剂或双官能剂存在下将透明质酸的羧基与烷氧基硅烷偶合剂的氨基缩合，然后将该缩合产物涂覆在等离子体处理基材表面以结合透明质酸的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种透明质酸改性的多孔钛涂层及其制备方法，以获得生物学性能更好的改性多孔钛涂层，从而增强它的骨传导和骨整合能力，促使骨组织再生。
[0006]在此，本发明提供一种透明质酸改性的多孔钛涂层，即采用生物化学改性方法，以共价键接枝方式，在多孔钛涂层表面固定有透明质酸的透明质酸改性的多孔钛涂层。
[0007]本发明提供的透明质酸改性的多孔钛涂层有利于细胞在改性钛涂层表面的铺展，改善了细胞-材料的相互作用和钛涂层的细胞相容性，并且能更好地促进人骨髓间充质干细胞(hMSCs)细胞的粘附、增值和碱性磷酸酶的活性表达，具有良好的生物学性能。[0008]另一方面，本发明还提供所述透明质酸改性的多孔钛涂层的制备方法，包括碱处理、硅烷化和共价键固定透明质酸。
[0009]较佳地，所述碱处理包括将多孔钛涂层浸入浓度为5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保温6~12h。
[0010]较佳地,所述硅烷化处理米用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化剂。
[0011]所述硅烷化处理可以采用甲苯为溶剂，加热回流反应6~12h。
[0012]较佳地，所述共价键固定透明质酸包括将经硅烷化处理的多孔钛涂层浸泡在透明质酸/乙酸溶液中并采用1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为羧基活化剂。
[0013]更佳地，所述共价键固定透明质酸可以是在浓度为lmg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液中，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以使其在反应体系中的浓度分别为2~3.5mg/mL和0.25~0.875mg/mL。
[0014]所述共价键固定透明质酸的反应时间优选为4~10h。
[0015]较佳地，在所述硅烷化处理之前还包括去离子水陈化处理。
[0016]所述去离子水陈化可以是将经碱处理的多孔钛涂层在去离子水中40~80°C下保温3~7天。
[0017]本发明工艺简单、效率高、可重复性好。本发明所提供的透明质酸改性的多孔钛涂层，具有良好的稳定性和生物学性能，解决了现有技术中所存在的问题，可改善钛涂层的临床效果，为医用生物涂层技术提供新的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是钛涂层改性前后的红外光谱；
图2是钛涂层改性前后的光电子能谱C谱图；
图3是hMSCs在改性钛涂层表面的电镜观察:(al)、(a2)，TC ； (bl)、(b2)，TC-AAH ;其中(al)、(bl)，放大 300 倍；(a2)、(b2)，放大 1000 倍；
图4是透明质酸改性的多孔钛涂层的生物学性能实验:(a) hMSCs的细胞粘附实验；(b)hMSCs的细胞增殖实验；(c)hMSCs细胞分化的碱性磷酸酶活性检测实验。
【具体实施方式】
[0019]以下结合附图及下述【具体实施方式】进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0020]基于透明质酸良好的生物学性能，本发明采用生物化学改性方法，以共价键接枝方式，将透明质酸固定在等离子体喷涂多孔钛涂层表面，从而获得生物学性能更好的透明质酸改性的多孔钛涂层。作为示例，其具体工艺如下。
[0021](I)钛涂层的制备:利用等离子体喷涂技术制备钛涂层。
[0022](2)碱处理:将所述钛涂层浸入浓度为5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保温6~12h，取出后可用去离子水 超声清洗，超声清洗可以持续约5分钟。这里采用5~IOM的NaOH作为碱处理的碱液，但应理解其他合适的碱液也是适用的，例如氢氧化钾。
[0023](3)去离子水陈化:将经碱处理得到的多孔钛涂层在去离子水中40~80°C下保温3~7天。可以每天换一次水，最后40°C下干燥。
[0024](4)硅烷化:将干燥的多孔钛涂层浸泡在浓度为5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加热至沸腾，冷凝回流，反应6~12h，冷却后，分别用酒精、去离子水超声清洗1-2次，真空干燥。这里采用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)为硅烷化剂，采用甲苯作为溶剂，但应理解其他合适的硅烷化剂、溶剂也是适用。
[0025](5)共价键固定透明质酸:将所述硅烷化多孔钛涂层浸泡在透明质酸/乙酸溶液(例如浓度为lmg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液)中，滴加入1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)水溶液(例如120mg/mL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液(例如30mg/mL)，使得EDC最终溶度为2~3.5mg/mL,NHS最终溶度为0.25~0.875mg/mL,反应4~IOh后取出，去离子水超声清洗，真空干燥。
[0026]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的试剂的量和浓度、反应时间和温度也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0027]实施例1
[透明质酸改性的多孔钛涂层的制备]
利用等离子体喷涂技术制备钛涂层(标记为TC)，所制备的钛涂层浸入5M NaOH溶液中，在80°C下保温12h，用去离子水超声清洗后，在去离子水中60°C下陈化7天，每天换一次水，40°C下干燥。碱处理改性钛涂层标记为TC-A。将干燥的样品TC-A浸泡在浓度为10%的APS/甲苯溶液中，溶液加热·至沸腾，冷凝回流，反应12h。冷却后用酒精超声清洗I次，去离子水超声清洗2次，真空干燥。硅烷化的钛涂层标记为TC-AA。将样品TC-AA浸泡在浓度为lmg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液中。每38mL透明质酸溶液中滴入120mg/mL EDC水溶液和30mg/mL NHS水溶液各ImL,使得EDC最终溶度为3mg/mL, NHS最终溶度为0.75mg/mL。反应6h后取出，去离子水超声清洗，真空干燥，样品标记为TC-AAH。
[0028]图1为钛涂层改性前后的红外光谱。与TC-AA谱图相比，TC-AAH谱图上的S1-O-Si系列特征吸收峰(1020-1290(3!^1)和氨基系列特征峰减弱，表明硅烷化钛涂层表面覆盖了透明质酸。
[0029]从图2所示的C谱可以看出:与TC-AA的C谱图相比，TC-AAH的C谱上出现了羧基中的C=O峰，进一步表明透明质酸成功地固定在钛涂层表面。
[0030][透明质酸改性的多孔钛涂层的生物学性能实验]
用人骨髓间充质干细胞(hMSCs)来考察共价键固定透明质酸钛涂层的生物学性能:电镜观察细胞在材料表面的铺展情况；用MTT法考察hMSCs在材料表面的粘附和增殖行为；用BCA法对hMSCs的碱性磷酸酶(ALP)的活性进行定量测定。
[0031]图3为细胞在材料表面的电镜照片。细胞在TC-AAH上的铺展要好于TC，表明透明质酸有利于细胞在改性钛涂层表面的铺展，改善了细胞-材料的相互作用和钛涂层的细胞相容性。
[0032]图4为透明质酸改性的多孔钛涂层的生物学性能实验。从图中可以看出:与TC和TC-A相比，TC-AAH能够更好的促进hMSCs的粘附(图4(a))、增殖(图4(b))和碱性磷酸酶的活性表达(图4(c))。结果表明:新型透明质酸改性的多孔钛涂层具有良好的生物学性能。[0033]产业应用性:本发明通过共价键接枝方式，将透明质酸固定在多孔钛涂层表面，获得一种透明质酸改性的多孔钛涂层，具有良好稳定性和生物学性能，可促进骨组织再生，在医学生物涂层【技术领域】有广阔的应用前景。
【权利要求】
1.一种透明质酸改性的多孔钛涂层，其特征在于，采用生物化学改性方法，通过共价键接枝方式，在多孔钛涂层表面固定有透明质酸。
2.—种权利要求1所述的多孔钛涂层的制备方法，其特征在于，包括碱处理、硅烷化处理和共价键固定透明质酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱处理包括:将多孔钛涂层浸入浓度为5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保温6~12h。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷化处理采用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷化处理采用甲苯为溶剂，加热回流反应6~12h。
6.根据权利要求2~5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述共价键固定透明质酸包括将经硅烷化处理的多孔钛涂层浸泡在透明质酸/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为羧基活化剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以使其在反应体系中的浓度分别为2~3.5mg/mL和0.25~0.875mg/mL。
8.根据权利要求6 或7所述的制备方法，其特征在于，所述共价键固定透明质酸的反应时间为4~IOh。
9.根据权利要求2~8中任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述硅烷化处理之前还包括去离子水陈化处理。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述去离子水陈化包括:将经碱处理的多孔钛涂层在去离子水中40~80°C下保温3~7天。
【文档编号】A61L27/56GK103785067SQ201210431866
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2012年11月1日
【发明者】敖海勇, 郑学斌, 汤亭亭, 谢有桃, 季衍, 黄利平 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所, 上海交通大学医学院附属第九人民医院