一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途

一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种FSH融合蛋白及其制备方法和用途，本发明的FSH融合蛋白的β亚基直接或者间接通过链接元件融合在FC片段上，FSH的α亚基则通过α亚基和β亚基的亲和力或者链接元件与FSH的β亚基结合在一起，本发明的FSH融合蛋白为异二聚体或同二聚体，本发明的FSH融合蛋白的制备方法包括FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体的质粒构建，FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体蛋白瞬时表达及纯化，本发明提供提高对象生育力的方法和治疗具有对FSH治疗有反应的疾病状态的方法。
【专利说明】一种FSH融合蛋白及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及人类生殖领域，更具体地说，本发明涉及促性腺激素及其制备方法及其在辅助生殖中的作用。
【背景技术】
[0002]促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone,简称FSH),是一种由脑垂体前叶嗜喊性细胞合成与分泌的高度糖基化蛋白，与脑垂体分泌的其他糖蛋白激素如促黄体激素(LH)、促甲状腺激素(TSH)，还有胎盘分泌的促绒毛膜激素(HCG)共同组成糖蛋白家族。都由α亚基和β亚基所组成，α亚基相同，而β亚基具有激素各自的特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素。FSH的α亚基由92~96个氨基酸组成，β亚基由109-115个氨基酸组成。两亚基通过内部二硫键维持自身正确的三级结构，C端残基的位置决定其折叠的三维空间结构。糖基是以N-糖苷键的方式连接在α和β两个亚基各自的区域。根据Qing R.Fan等人在nature上发表的FSH与其受体的三维结构,FSH主要通过β亚基的C端与其受体结合，同时β亚基的C端通过内部二硫键的固定与α亚基紧密结合，其中真正与受体的结合位点是β亚基的C端第89-105位氨基酸，它像三明治一样，夹在α亚基的L2环和C端中间。女性卵泡颗粒细胞上含有FSH的特异性受体，FSH与受体结合后产生两种作用，一方面活化芳香化酶，另一方面诱导LH受体生成。内膜细胞在LH作用下提供19-雄烯二酮或睾酮，这些底物通过基底膜进入颗粒细胞，活化的芳香化酶把它们转变为17-β雄二醇。雌激素协同FSH使颗粒细胞增生，内膜细胞分化，卵泡液形成，卵泡腔扩大，从而促进卵泡生长和发育成熟。卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断卵泡刺激素的进一步合成，并呈剂量依赖关系。这一机制保证了排卵的选择性。男性曲细胞精管内的支持细胞是FSH的靶细胞，FSH与支持细胞上的特异性受体结合后将刺激曲细精管上皮和次级精母细胞的发育，在LH和雄激素的协同下促进精子发育成熟。因为FSH对女性的卵泡成熟和男性的精子发育有非常重要意义，因而可以单独使`用FSH或联合LH应用治疗不育不孕症。
[0003]FSH可以从脑垂体或绝经后妇女尿液中分离得到(ΕΡ322，438)，也可以重组生产(US5, 639，640、US5, 156，957、US4, 923，805、US4, 840，896、EP211, 894)。通常为了获得治疗效果需要长期治疗，刺激女性卵泡发生需要连续8-10天，有时高达21天，而对于低促性腺激素的男性，诱导精子发生需要高达18个月。重组hFSH通常是每天肌肉注射或皮下注射给药，这样的给药方案经常伴有局部反应和不适。根据Bishop等人的总结，半衰期似乎是FSH体内活性的主要决定因素，因此开发长效rhFSH，减少给药频率具有实际临床应用价值。
[0004]近年来有多篇专利及文章报道开发长效FSH，基本思路是通过增加FSH的糖基化位点来达到提高半衰期的目的。一种是在FSH分子内部增加糖基化修饰位点。W001/58493公开了可以在FSH的a亚基进行的77种突变和可以在FSH的b亚基进行的51种突变。只是该专利没有公开通过定点突变而引入糖基化位点的任何FSHa或b亚基的生产或测定情况。US7，740,862公开了在FSH a_亚基的氨基酸残基第3和4位之间插入GNFT或GNRT序列，在大鼠体内半衰期约为17h，体外刺激重组表达FSH受体的CHO细胞产生环磷酸腺苷(cAMP)的能力与天然FSH相当。另外一种是在序列末端添加额外序列来增加糖基化修饰位点。目前开发比较成功的是2010年由德国默克公司上市的elonva，该类似物具有天然FSH的生物活性，但却具有较长的循环半衰期，在人体内的半衰期约69h。蛋白具体序列在专利US5, 338，835和US5, 585，345中公开，是一种改造的FSH b_亚基，其C-末端谷氨酸以hCG的羧基末端肽(CTP)基团延长。根据Pieter Verbost等人的实验结果:该类似物在大鼠和狗体内的半衰期分别为17.3，46.9h，比重组FSH提高了 1.5_2倍。Signe Perlman等人报道一种改造的FSH a-亚基，其N-末端添加“ANITVNITV”氨基酸序列。该类似物在大鼠体内半衰期为22h，比重组FSH提高了 3-4倍。
[0005]IgG类免疫球蛋白为人体血液中最丰富的蛋白之一，半衰期达到21d，其稳定性是由于IgG的Fe片段可与新生Fe受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解(5_7)。因此，IgG的Fe片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。根据铰链区的长短及Fe片段氨基酸序列的不同，人IgG分为4个亚型，其中IgG Fe Y 2具有较低的诱导细胞毒性作用，而IgG Fe Y I最强。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fe (Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2_CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连，以避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造成的影响。此外，IgG的融合蛋白可以通过ProteinA亲和层析得到高效便捷的纯化。因此已有多篇专利报道将IgGFe片段与其他蛋白融合可显著延长目的蛋白的半衰期，提高体内生物活性(US5，155,027,5，428，130，5，480，981 和 5，808，029)
[0006]专利US0，186,662公布了通过构建FSH-FC融合蛋白同二聚体、异二聚体，在大鼠体内半衰期提高至60h。活性实验:大鼠单次给药后，72小时后测定卵巢重量，结果显示FSH-FC融合蛋白相比重组FSH卵巢重量增加，从14.3mg提高至26.9mg,阴性对照为
12.1mg0前面提到过，重组FSH半衰期很短，通常需要每天给药，如果按照该实验方案三天给药一次，FSH基本已经代谢完毕，没有活性。所以构建的FSH-FC融合蛋白在保证半衰期的前提下，活性还有待于提高。
[0007]临床上需要一种产品，能够提供FSH的部分或全部治疗相关的效果，可以比现有的FSH产品更低频率给药，并且和现有治疗达到的FSH活性相比，可以提供更稳定的活性水平。
[0008]本发明旨在提供这类产品以及这类产品的制备方法。

【发明内容】

[0009]本发明提供了一种FSH的融合蛋白及其制备方法和用途，本发明的FSH融合蛋白，其特征在于，所述的FSH融合蛋白的β亚基直接或者间接通过链接元件融合在FC片段上，FSH的α亚基则通过α亚基和β亚基的亲和力与FSH的β亚基结合在一起。
[0010]本发明的主要特征在于:本发明的FSH融合蛋白的的β亚基直接或者间接通过链接元件(linker)融合在FC片段上，FSH的α亚基则通过α亚基和β亚基的亲和力与FSH的β亚基结合在一起(见附图1)。通过这些FSH的融合蛋白，本发明实现了在尽量保留FSH的亲和力的前提下，增强FSH的体内 半衰期，在某种意义上说提供了一种通过减少有效剂量、有效地增强生育能力的方法。
[0011]本发明同US20050186662的FSH-FC融合蛋白的最大区别在于，US20050186662的融合蛋白通过间接或者直接的方法将α亚基固定在FC链上，而本发明的专利在于将α亚基游离出来，通过自身的亲和力结合在β亚基上。本发明的原理是基于FSHa亚基的C端参与了 FSH的β和α亚基与FSH受体(FSHR)的相互作用，而US20050186662的FSH-FC融合蛋白将α亚基的C端直接连在了 FC的N端或者将之与β亚基串联，使α亚基C端被FC或者β亚基遮蔽，最终造成了 FSH与FSH受体亲和力的丢失。本发明将α亚基游离出来，使α亚基的C端暴露出来，克服了 US20050186662的缺点，使FSH能够正常与FSH的受体结合，在增强FSH的体内半衰期的同时，最大程度的保留FSH的体内活性。
[0012]在一个方面，本发明的FSH融合蛋白包括三条肽链，为异二聚体(附图1a)，其特征符合以下方程:
[0013]a FSH @ ^FSH-L-FC: FC
[0014]其中a FSH指的是FSH的α亚基；@代表了 FSHa亚基和β亚基两条链之间的关系；β FSH指的是FSH的β亚基；L代表了连接FSHii亚基和FC之间的直接或者间接链接元件，代表了将FSHii亚基连接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；冒号(:)指的是融合蛋白β FSH-L-FC和FC两条链之间的关系。
[0015]在一个方面，本发明的FSH融合蛋白包括两条肽链，为同二聚体(附图1b)，其特征符合以下方程:
[0016]( a FSH @ β FSH-L-FC) 2
[0017]其中a FSH指的是FSH的α亚基；@代表了 FSHa亚基和β亚基两条链之间的关系；β FSH指的是FSH的β亚基；L代表了连接FSHii亚基和FC之间的直接或者间接链接元件，代表了将FSH β亚基连接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；括号内下标2代表着此蛋白为二价同二聚体。`
[0018]本发明还涉及一种载体，该载体含有编码SEQ ID NO:3的序列的FSHa亚基的DNA。该载体可以是表达载体。
[0019]本发明还涉及一种载体，该载体含有编码SEQ ID N0:6的序列的FSH0亚基的DNA。该载体可以是表达载体。
[0020]本发明还涉及一种载体，该载体含有编码SEQ ID N0:8的序列的FC片段的DNA。该载体可以是表达载体。
[0021]本发明还涉及一种载体，该载体含有第一 DNA、第二 DNA及第三DNA，其中第一 DNA编码含有编码SEQ ID NO:3的序列的FSHa的DNA，第二 DNA编码含有编码SEQ ID NO:6的序列的FSHii的DNA，该载体可以是表达载体，第三DNA编码含有编码SEQ ID NO:8的序列的FC的DNA该载体可以是表达载体。
[0022]所述的FC包括人免疫球蛋白FC。
[0023]本发明涉及的FSH-FC融合蛋白可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。例如，FSH-FC融合蛋白包含了 FC，蛋白则可以用蛋白A来纯化。纯化方法包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法。本发明涉及的融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。
[0024]所述的FSH-FC融合蛋白包括FC，优选人免疫球蛋白FC。在一般情况下，人免疫球蛋白FC区域的CH3区域多肽来源于野生型的人免疫球蛋白FC区域。野生型的人免疫球蛋白FC指发生在人群中的氨基酸序列，当然FC序列在个体中会有一些细微的差异。本发明中人免疫球蛋白FC也包括对于野生型人免疫球蛋白FC序列的氨基酸个别的改变，比如，FC区域局部某些氨基酸的改变，如包括某些在糖基化位点突变的氨基酸，或者其他无义的突变；也包括根据“把手-孔洞”模型突变的个别氨基酸的改变。[0025]本发明的人免疫球蛋白FC指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白FC区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白:IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1, IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白FC区在本领域技术人员所掌握的范围之内。
[0026]在【具体实施方式】中，本发明所用的人免疫球蛋白FC包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，具体为人IgGl FC0
[0027]本发明涉及的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CH0，293，骨髓瘤细胞。宿主细胞也可以是酵母或者原核细胞如E.Coli。
[0028]本发明涉及的治疗领域包括，通过FSH治疗降低任意对治疗有反应的生殖障碍或疾病状态的严重性；预防与这些障碍或疾病状态相关的一种或多种症状；减少FSH异常的疾病过程的治疗时间；给患有这些异常的对象提供有益效果(例如:增强生育力)，治愈FSH异常或生殖障碍。
[0029]本发明提供了一个在不丢失FSH的体内活性的基础上增强FSH的体内半衰期的FSH-FC片段的融合的方法。具体方式是将FSH的β亚基融合于FC片段上，并利用FSHa亚基与β亚基的自身亲和力的特性，单独表达FSH α亚基。本发明将提供FSH的部分或全部治疗相关的效果，可以比现有的FSH产品更低频率给药，并且和现有治疗达到的FSH活性相比，可以提供更稳定的活性水平。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0031]图1为FSH-FC融合蛋白异二聚体及同二聚体示意图。
[0032]图2为FSH-FC同二聚体重组质粒。
[0033]图3为FSH-FC/FC异二聚体重组质粒。
[0034]图4为FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体经一步纯化后SDS-PAGE图谱。
[0035]FSH-FC同二聚体SDS-PAGE图谱1，非还原胶样品不煮沸；2，非还原胶样品煮沸；M, Marker ;3,还原胶。
[0036]FSH-FC/FC异二聚体SDS-PAGE图谱1，非还原胶样品不煮沸；2，非还原胶样品煮沸；M, Marker ;3，还原胶。
[0037]图5为FSH-FC/FC异二聚体平均C-T曲线。
[0038]图6为FSH-FC/FC单克隆筛选还原SDS-PAGE图谱。
【具体实施方式】
[0039]下面给出一种根据本发明制备的非限定性的实施例。[0040]实施例一 FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体的质粒构建
[0041]1.FSH-FC同二聚体的质粒构建
[0042]商业化哺乳动物细胞表达载体pcDNA4/myc-HisA的改造。商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen, V863-20)含有两个PvuII酶切位点，分别在大约1411,3160bp的位置。对质粒定点突变，将3106bp位置的碱基C突变为G，去除在该位置的PvuII酶切位点，只保留在大约1411bp处的一个酶切位点，新的载体命名为pcDNA4m。
[0043]根据基因库中搜索到的人FSH α亚基基因序列(Gene bank N0.NP_000726.1),人工合成方法获得人的FSHa基因(SEQ ID NO:1)，合成好的FSH α基因经Takara公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到改造的载体pcDNA4m中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即:pcDNA4m-FSHa。
[0044]人的FSHa序列见SEQ ID NO:1，信号肽序列见(SEQ ID NO:2)，编码该序列的核苷酸序列见SEQ ID NO:3o
[0045]根据基因库中搜索到的人FSHP亚基基因序列(Gene bank N0.NP_000501.1),人IgGl的Fe片段(hing-CH2-CH3)基因序列，人工合成方法获得人的FSHP-Fc融合蛋白基因(SEQ ID NO:4)，合成好的FSHP-Fe基因经Takara公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到改造的载体pcDNA4m，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即:pcDNA4m-FSHP -Fe。
[0046]人的FSH^-Fc融合蛋白基因序列见SEQ ID NO:4，信号肽序列见SEQ ID N0:5，编码该序列的核苷酸序列见SEQ ID N0:6。
[0047]取上述构建成功的单基因 表达载体pcDNA4m_FSH α用Takara公司的Bgl II,PvuII双酶切。酶切产物通过0.8%的琼脂糖电泳分离纯化，并回收约1.6kb大小含有FSHa基因的DNA片段；pcDNA4m-FSHP -Fe经BglII，NruI双酶切回收约6kb大小含有FSHP -Fe基因的DNA片段。随后将酶切处理过的DNA片段进行连接，整合FSH α和FSHi^-Fc外源基因表达原件于一个表达载体上，获得重组质粒pcDNA4m-FSH-Fc，即FSH-FC同二聚体重组质粒(见附图2)。
[0048]2.FSH-FC/FC异二聚体的质粒构建
[0049]以pcDNA4m-FSH β -Fe为模板，设计引物进行PCR扩增获得FC基因，通过PCR弓丨物在基因N端添加IgGl信号肽(5’ METDTLILWRLLLWVPGSTLGSA3’)，在基因两端分别添加酶切位点Hindlll，EcoRI, PCR产物经双酶切亚克隆到改造的载体pcDNA4m中，获得重组质粒pcDNA4m-Fc。用Takara公司的Nru I，Pvu II对重组质粒进行双酶切，酶切产物通过0.8%的琼脂糖电泳分离纯化，回收约1.8kb大小含有Fe的DNA片段。通过平末端连接，将其连入经Nru I单酶切，并经过CIAP去磷酸化处理的pcDNA4m-FSH_Fc质粒中，获得重组质粒pcDNA4m-FSH mono,即FSH-FC/FC异二聚体重组质粒。质粒图谱如附图3所示，基因FSHa，FSHP-FC，FC以摩尔比1:1:1的方式构建至同一个质粒，最终表达的蛋白FSH-FC，FC以三种方式存在=FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体和FC同二聚体，理论上三者之间的摩尔比为1:2:1。
[0050]采用Qiagen的中抽试剂盒，按照说明书操作，获得去除内毒素的重组质粒pcDNA4m-FSH_Fc，pcDNA4m_FSH mono。
[0051]实施例二 FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体蛋白表达和纯化[0052]1.FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体蛋白瞬时表达
[0053]转染前两天，准备500ml经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8X106cells/ml。两天后对待转染细胞悬液进行计数细胞密度为3.5~4X 106cells/ml,取细胞悬液1000rpm离心5min,弃上清液。用100ml的新鲜的Freestyle293培养基重新悬浮细胞，再次1000rpm离心5min,弃上清液。用500ml Freestyle293培养基重新悬浮293细胞。分别用2.5ml Freestyle293培养基稀释 250ug pcDNA4m-FSH-Fc, pcDNA4m-FSH mono 质粒，5ml Freestyle293 培养基稀释
1.5mlPEI (Polyethylenimine)，分别将 2.5ml 质粒和 2.5ml 的 PEI 混匀，室温 5 分钟。将质粒/PEI混合物分别加入250ml细胞悬液中，放置在37度，10% C02,90rpm中培养；同时补加50ug/L IGF-10四小时后分别补加250ml EX293培养基，2mM Glutamine和50ug/LIGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM VPA，培养5~6天收集500mlSH_FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体上清液准备纯化。
[0054]2.FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体蛋白纯化
[0055]首先,FcRn蛋白交联至NHS-activated agrose resin (Thermo),细胞液经离心，取上清0.22um过滤后上载到FcRn柱子上，然后用20mM PB,50mMNaCl, pH6.2漂洗后，最后用20mM PB，50mMNaCl，pH7.4洗脱目的蛋白。经一步纯化后，SDS-PAGE结果如下图所示。Fe融合蛋白是通过Fe之间二硫键结合的，在非还原胶即不加入DTT强还原剂的情况下，Fe的链接二硫键没有被破坏，融合蛋白以二聚体的形式存在。而FSH的两个亚基α、β是以非共价键的方式结合，在非还原胶样品不经过煮沸的情况下，非共价键没有遭到破坏；在非还原胶煮沸的情况下，两个亚基之间的二硫键断裂。所以电泳分别采取还原、非还原样品煮沸及不煮沸的方式进行检测。经一步纯化后，FSH-FC同二聚体蛋白纯度达90%以上；FSH-FC/FC异二聚体重组质粒，蛋白表达后以混合物的形式存在:FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体和FC同二聚体，摩尔比大致为1: 2: `1，与理论推测相符合(见附图4)。
[0056]实施例三FSH-FC同二聚体，FSH-FC/FC异二聚体大鼠体内药效动力学研究
[0057]评价FSH-FC同二聚体，FSH-FC/FC异二聚体蛋白体内生物学活性的模型是大鼠卵巢重量增加法。使用FSH或具有FSH活性的分子，治疗未成熟的21日龄雌性大鼠，触发卵巢卵泡生长和卵细胞产生。这种生长通过测量治疗末期卵巢重量很容易探测。该方法作为给临床产品标定FSH活性已经使用了数十年，它能衡量FSH的相关生理学作用，与临床产品的表现有明确的相关性。
[0058]取健康合格，出生21天左右的Sprague-Dawley雌鼠，按照中国药典附录121的实验方案进行FSH-FC同二聚体，FSH-FC/FC异二聚体蛋白动物体内研究。给药剂量分高、中、低三组(依次为2.5、1.25,0.5U)，对照品Gonal-F(比活预估10，000U/mg)每日给药一次，样品FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体蛋白(比活预估1，000U/mg)只给药一次，72小时后进行卵巢称重，运用《中检所药典生物检定统计BS2000程序3.3法》计算，结果显示Gonal-F比活为11，000IU/mg，样品FSH-FC/FC异二聚体蛋白比活为1，300IU/mg，样品FSH-FC同二聚体蛋白比活100U/mg。结果表明:相对于Gonal-F连续三天每日给药一次，FSH-FC/FC异二聚体蛋白在只给药一次的情况下，仍然具有一定的FSH活性。根据Gonal-F的产品说明书，临床推荐给药剂量为75IU，即可以推算FSH-FC/FC异二聚体蛋白的临床给药剂量约为17微克，在合理给药剂量范围内。[0059]实施例四FSH-FC/FC异二聚体大鼠体内药代动力学研究
[0060]将具有一定FSH活性的FSH-FC/FC异二聚体蛋白进行大鼠体内药代动力学研究。具体方案如下:采用16只出生21天左右的Sprague-Dawley雌鼠,接受静脉注射FSH-FC/FC异二聚体蛋白，注射剂量10U。选择未成熟雌性大鼠是基于使用该年龄、性别来进行FSH体内活性测定。采用眼眶采血的方式，给药0，1,2,4,12，24，48，72，96，144，192小时采血，每次采血体积IOOul，离心后取血清冻存与-80度待ELISA分析。使用FSH ELISA试剂盒进行检测，每个血清样品重复分析三次。结果如下图所示:FSH-FC/FC异二聚体蛋白的半衰期为30-40小时(文献报道标准品重组FSH为12h)(见附图5)。
[0061]实施例五FSH-FC/FC异二聚体高表达稳定细胞株的获得
[0062]根据前期实验结果，FSH-FC/FC异二聚体蛋白具有一定的FSH活性，同时在大鼠体内的半衰期约30-40h，是对照品Gnoal-F的3倍多，具有很好的临床应用前景，因此试图获得FSH-FC/FC异二聚体稳定细胞株，为后期工艺开发及产业化做准备。稳定细胞株获得的具体方案:将对数生长期的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞以IX 105cell/孔浓度接种于24孔板，用完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养基)培养24h，第二天使细胞汇合度达到 75%~85%。使用 Lipofectamine2000 转染试剂(Invitrogen，P/N52887)转染重组质粒pcDNA4m-FSH mono。转染5h后换液，每孔加入400ul完全培养基，24小时后将细胞以I: 10比例传代到含有IOml新鲜完全培养基的细胞培养皿中，24小时后更换筛选培养基(含200ug/ml zeocin的完全培养基)，每隔3_4天更换一次筛选培养基。4_6周以后挑取单克隆传代到24孔板，约4-5天至汇合度达到80% -100%时进行单克隆筛选。单克隆筛选策略:第一轮检测用Fe ELISA试剂盒检测，共筛选了 309个克隆。根据ELISA结果，结合菌落大小情况，选取102个Fe表达水平相对较高的克隆，传代培养至6孔板，使用FSH ELISA试剂盒(DRG，E1A-1288)检测FSH表达量，筛选阳性克隆。选取FSH表达水平相对较高的克隆进行非还原SDS-PAGE电泳。`
[0063]前面已提到过，基因FSHa，FSHb-FC, FC以摩尔比1:1:1的方式构建至质粒pcDNA4m-FSH-Fc mono，最终表达的蛋白FSH-FC，FC以三种方式存在:FSH_FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体和FC同二聚体，一般情况下三者之间的摩尔比为1: 2: I。我们最终的目的产物是FSH-FC/FC，蛋白具有FSH活性且半筛期在大鼠体内是FSH的3_4倍，另外，考虑到后续的蛋白纯化工艺，FSH-FC/FC异二聚体和FC同二聚体蛋白的分离，比其与FSH-FC同二聚体的蛋白分离要容易的多。所以我们的蛋白电泳筛选标准是FSH-FC/FC异二聚体蛋白占主要部分，FSH-FC同二聚体含量较低。最终筛选到的部分非还原SDS-PAGE电泳图谱如附图6所示，根据电泳情况最终选取第2、3、6和9泳道的克隆进行后续细胞培养及纯化工艺的开发。其中值得一提的是第6泳道的克隆，表达产物基本是以FSH-FC/FC异二聚体的形式存在，FSH-FC同二聚体蛋白含量很低，使后续的蛋白纯化工艺开发变得简单。以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种FSH融合蛋白，其特征在于，所述的FSH融合蛋白的β亚基直接或者间接通过链接元件融合在FC片段上，FSH的α亚基则通过α亚基和β亚基的亲和力或者链接元件与FSH的β亚基结合在一起。
2.根据权利要求1所述的FSH融合蛋白，其特征在于所述的FSH融合蛋白包括三条肽链，为异二聚体，符合以下方程:aFSH@ β FSH-L-FC:FC，其中a FSH指的是FSH的α亚基；@代表了 FSHa亚基和β亚基两条链之间的关系，PFSH指的是FSH的β亚基；L代表了连接FSHii亚基和FC之间的直接或者间接链接元件，代表了将FSHii亚基连接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；冒号指的是融合蛋白β FSH-L-FC和FC两条链之间的关系O
3.根据权利要求1所述的FSH融合蛋白，其特征在于所述的FSH融合蛋白包括两条肽链，为同二聚体，符合以下方程:UFSH@ PFSH-L-FC) 2，其中a FSH指的是FSH的α亚基；@代表了 FSHa亚基和β亚基两条链之间的关系，PFSH指的是FSH的β亚基；L代表了连接FSHii亚基和FC之间的直接或者间接链接元件，代表了将FSHii亚基连接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；括号内下标2代表着此蛋白为二价同二聚体。
4.根据权利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白，其所述的FSH为人FSH。
5.根据权利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白，其所述的FC片段包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少具有80%的一致性。
6.根据权利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白，其特征在于所述的FC为人免疫球蛋白链恒定区。
7.制备权利要求1所述的FSH融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤:I)FSH-FC同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体的质粒构建；FSH-FC同二聚体的质粒构建步骤:对表达载体pcDNA4进行改造，消除其中的 一个PvuII酶切位点；人工合成方法获得人的FSH α基因SEQID NOdJfFSHa基因克隆到表达载体pcDNA4m中，获得重组质粒即:pcDNA4m-FSHα，将人工合成方法获得人的FSHi1-Fe融合蛋白基因SEQ IDN0:4，克隆到表达载体pcDNA4m中，获得重组质粒即:pcDNA4m_FSH β-Fe ;取 pcDNA4m_FSH a、pcDNA4m_FSH β-Fe,分别酶切，分离纯化回收pcDNA4m-FSH α中含有FSH α基因的DNA片段；pcDNA4m_FSH β -Fe含有FSH β -Fe基因的DNA片段，随后将FSH α和FSH β -Fe外源基因表达原件整合于一个表达载体上，获得重组质粒pcDNA4m-FSH-Fc，即FSH-FC同二聚体重组质粒；以pcDNA4m_FSH β -Fe为模板，PCR扩增获得FC基因，通过PCR引物在基因N端添加IgGl信号肽，在基因两端分别添加酶切位点HindIII，EcoRI ；PCR产物亚克隆到质粒pcDNA4m中，获得重组质粒pcDNA4m_FC，质粒pcDNA4m-FC含有FC基因部分经酶切克隆到已构建好的pcDNA4m-FSH-Fc，获得重组质粒pcDNA4m-FSH-Fc mono,即 FSH-FC/FC异二聚体重组质粒；2) FSH-FC 同二聚体、FSH-FC/FC异二聚体蛋白瞬时表达，纯化。
8.根据权利要求1所述的FSH融合蛋白的应用，是通过FSH治疗降低任意对治疗有反应的生殖障碍或疾病状态的严重性；预防与这些障碍或疾病状态相关的一种或多种症状；减少对FSH异常的疾病过程的治疗时间；提高对象生育力的同时降低给药频率；给患有这些异常的对象提供有益帮助。
【文档编号】A61P15/08GK103509121SQ201210476665
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2012年11月22日
【发明者】徐霆, 郭康平, 汪皛皛, 吴杰, 季剑芸, 黄艳, 须涛 申请人:苏州康宁杰瑞生物科技有限公司