专利名称：核-壳型三模态纳米造影剂、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多模态影像技术，具体涉及ー种MRI/NIR/CT三模态纳米造影剤、其制备方法及应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一，肿瘤的早期诊断和治疗是提高患者生存质量和治愈率的关键。目前，应用于肿瘤的分子显像技术有光学成像技木、CT(电脑断层扫描)成像技术、MRI (磁共振成像)分子成像技术、超声分子影像技术、SPECT技术、PET技术以及NIR (近红外荧光成像)技木。但是，単一分子影像技术存在着自身难以克服的缺陷，如荧光成像在人体尤其深部组织很难获得定量信息，CT成像技术缺乏特异性靶向对比剂，超声成像分辨率低等。単一的成像方式不足以充分的获取肿瘤信息，联合使用多种分子成像技术可实现彼此优势互补，为明确诊断提供更加精确全面的信息。 多模态分子影像技术将同时具有多种现象功能的分子探针注入机体，通过多种成像技术的检测，获取病变部位多种信息，而多模态分子影像探针合成是多模态分子影像技术的核心。纳米技术的发展为多模态分子影像探针的研究提供了良好的平台，通过纳米载体结合多种影像功能，应用于肿瘤早期的检测和诊断。现有技术中，大量基于纳米技术的分子影像探针得到开发，如量子点、磁性纳米粒子、近红外荧光染料及放射性标记分子，但仍不能很好的解决肿瘤靶向性低的问题和生物毒性的问题。人血清白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质，现有技术中出现了以人血清白蛋白作为载体的纳米药物，该纳米药物具有良好的生物相容性和肿瘤靶向性，原因在于肿瘤细胞对人血清白蛋白作为载体的纳米药物具有选择吞噬性，肿瘤细胞代谢旺盛，会主动摄取纳米药物中的人血清白蛋白，为自身能量来源，而正常细胞无上述效应，因此，以人血清白蛋白为载体的纳米粒子在解决多模态纳米影像探针的肿瘤靶向性问题上具有潜在的价值。另外，直径大于20nm的纳米粒子易被网状内皮系统(RES)吞噬，导致其效率和灵敏度降低。直径小于IOnm的纳米粒子易被体内的淋巴系统所清理，生物毒性降低。同吋，直径小于IOnm的纳米粒子更易利用肿瘤组织内血管系统的高滲透性，实现肿瘤直接靶向，不仅能进入病变器官或组织，还能进入肿瘤细胞内部。因此，直径小于IOnm的多模态纳米影像探针在解决肿瘤靶向性问题及生物毒性问题上均有潜在的价值。
发明内容
本发明g在解决上述现有技术中存在的问题，本发明一方面提出ー种核-売型三模态纳米造影剤，包括金属纳米簇内核，所述金属纳米簇内核包括金属，以及组装在金属外作为保护基团的人血清白蛋白；包裹所述金属纳米内核的顺磁性金属离子配合物外売，所述外壳包括通过酰胺键与人血清蛋白共价连接的螯合剂，及配位结合于螯合剂上的顺磁性金属离子。优选地，所述核-壳型纳米造影剤直径小于10nm。
优选地,所述的金属纳米簇为人血清蛋白-金纳米簇或人血清蛋白-银纳米簇。优选地，所述的螯合剂为こニ胺四こ酸(EDTA)或ニこ三胺五こ酸(DTPA)。优选地，所述的顺磁性金属离子为锰离子、铁离子或镧系稀土元素的三价离子。优选地，所述的顺磁性金属离子为Gd3+。本发明另一方面提供了 制备所述的核-壳型纳米造影剤的方法，包括金属纳米簇制备金属离子与人血清白蛋白混合，得到第一混合液，将第一混合液的PH值调至10. 0-14. 0，反应得到金属纳米簇溶液；螯合剂与金属纳米簇共价结合于所得金属纳米簇溶液中加入缓冲液，得到第二混合溶液，于第二混合溶液中加入螯合剤，得到第三混合溶液，将第三混合溶液的PH值调至6. 0-14. 0，反应得到螯合剂-金属纳米簇溶液；螯合剂-金属纳米簇与顺磁性金属离子配位结合于酸性溶液中，将顺磁性金属离子溶解，得到第四混合液，将第四混合液与螯合剤-金属纳米簇溶液混合，得到第五混合液，将第五混合溶液的PH值调至6. 0-8. 0，反应，得到核-壳型纳米造影剤溶液。优选地，所述制备方法还包括将核-壳型纳米造影剤溶液置于透析袋，分别于缓冲液及双蒸水中透析。优选地，所述金属纳米簇制备中金属的物质的量与人血清白蛋白的质量比为(5-10) u mo1:(25-50) mg。优选地，所述螯合剂与金属纳米簇共价结合中人血清白蛋白与螯合剂质量比为(100-200):(28-50)。本发明提供的核-壳型三模态纳米造影剤因含有具有在近红外光区具有荧光效应的金属纳米簇内核，可用于NIR成像；本发明的造影剤的外壳中含有具有核磁共振效应的顺磁性金属离子，所述造影剂还可用于MRI成像；本发明的造影剤的金属纳米簇内核中通常含有高原子序数的金或银，X射线的吸收率高，本发明的造影剤具有纳米尺寸小，更易进入组织或器官，改变组织或器官对X射线的吸收，因此所述造影剂还可用于CT成像。本发明的有益效果在干，结合纳米技木，以人血清白蛋白为载体连接顺磁性金属离子，实现了 NIR、CT和MRI三模态成像，提高了肿瘤靶向性；所制备的核-壳型纳米造影剤粒径小，生物毒性低；制备方法简单。
图1是实施例1中制备的核-壳型纳米造影剤的透射电镜图。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。本发明综合了纳米技术、人血清白蛋白的肿瘤靶向性与顺磁性物质的MRI造影功能三者，发明了ー种造影剤，有效实现了 NIR、CT和MRI三模态成像。本发明的造影剂为核-壳型纳米造影剤，其内核为金属纳米簇，由金属和人血清白蛋白构成，是ー种由金属的几个至几十个原子组成核心，人血清白蛋白作为保护基团组装而成的分子级聚集体。例如，本发明中的金属纳米簇可为人血清蛋白-金纳米簇或人血清蛋白-银纳米簇。金属纳米簇是具有荧光的水溶性分子聚集体，其特有的量子尺寸效应使其荧光发射光谱在可见光到近红外光区范围内可谐调。同吋，良好的生物相容性和光稳定性使其成为高性能的生物标记物。核-壳型纳米造影剤的外壳由顺磁性金属离子配合物构成，包括通过酰胺键与内核中人血清蛋白共价连接的螯合剂，及配位结合于螯合剂上的顺磁性金属离子。通过在金属纳米簇内核上引入顺磁性物质使本发明的造影剤具有MRI成像功能。例如，螯合剂可为こニ胺四こ酸(EDTA)或ニこ三胺五こ酸(DTPA)，但不排除其他可用的螯合剤。顺磁性金属离子选用锰离子、铁离子或镧系稀土元素的三价离子。顺磁性金属离子优选为Gd3+、Eu3+、Fe3+或Mn2+，更优选为Gd3+或Mn2+，最优选为Gd3+。本发明还提供制备该核-壳型纳米造影剤的方法，主要包括以下步骤首先，制备金属纳米簇。金属纳米簇中包含金属与人血清白蛋白，用于形成核-壳 型纳米造影剤内核部分的组成。将金属离子与人血清白蛋白混合，得到第一混合液，将第一混合液的PH值调至10. 0-14. 0，反应得到金属纳米簇溶液。制备第一混合液时可通过搅拌、震荡、超声等方式来帮助均匀混合。调节第一混合液PH值可选用NaOH溶液或KOH溶液。反应条件优选为温育，更优选为37°C温育，伴随温和搅拌或置于摇床上轻微震荡。所述金属纳米簇制备中金属的物质的量与人血清白蛋白的质量比优选为(5-10) u mo1:(25-50)mg,更优选为 I U mo1:1Omg-1 u mo 1: 5mg,最优选为 I U mo1:1Omg 或 I ii mo 1: 5mg。然后，制备螯合剂与金属纳米簇共价结合物(螯合剂-金属纳米簇)。于所得金属纳米簇溶液中加入缓冲液，得到第二混合溶液，于第二混合溶液中加入螯合剂，得到第三混合溶液，将第三混合溶液的PH值调至6. 0-14. 0，反应得到螯合剂-金属纳米簇溶液。所加缓冲液优选为PH6-14的PBS溶液，制备第二混合液或第三混合液时可通过搅拌、震荡等方式来帮助均匀混合。通过滴加NaOH溶液或KOH溶液调节第三混合液pH值。反应温度优选为室温，伴随温和搅拌或置于摇床上轻微震荡。所述螯合剂与金属纳米簇共价结合中人血清白蛋白与螯合剂质量比优选为为(100-200) :(28-50)，更优选为100:25-100:32，最优选为 100:28,125:40 或 200:50。接着，制备含有顺磁性金属离子的酸性溶液，并与上述螯合剂-金属纳米簇溶液混合制备核-壳型纳米造影剤。于酸性溶液中，将顺磁性金属离子溶解，得到第四混合液，将第四混合液与螯合剂-金属纳米簇溶液混合，得到第五混合液，将第五混合溶液的PH值调至6. 0-8. 0，反应，得到核-壳型纳米造影剤溶液。通过滴加NaOH溶液或KOH溶液调节第五混合液PH值。反应温度优选为室温，伴随温和搅拌或置于摇床上轻微震荡。形成在溶液中的核-壳型纳米造影剤可以进ー步纯化。将核-壳型纳米造影剤溶液置于透析袋，分别于缓冲液及双蒸水中透析。透析的目的是去除无机小分子。所述缓冲液优选为PBS溶液。将核-壳型纳米造影剤溶液置于透析袋，首先于PBS溶液中透析l-300h，每l_12h更换PBS溶液；再置于双蒸水内透析l_12h。以下为实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。原料与试剂氯金酸溶液；HAS (人血清白蛋白)溶液；DTPACA (ニこ三胺五こ酸环酐)；PBS (磷酸盐缓冲液)溶液；NaOH溶液；HC1溶液；GdCl3. 6H20 ;双蒸水。实施例1a、金纳米簇的制备将lOmmol/L氯金酸溶液和50mg/mL HSA溶液于37°C下温浴，使上述两种溶液恒温至37°C，将0. 5mL氯金酸溶液加入到0. 5mL HSA溶液中，混合均匀，再加入lmol/L NaOH溶液0. 05mL,调节pH值为强碱性(pH10. 0-14. 0)，将所得混合液置于37°C摇床温育12h，形成金属纳米簇溶液。
b、螯合剂与金属纳米簇共价结合取上述金属纳米簇溶液4ml，加入0. 2mL PBS溶液(2mol/L，pH=9)，混合，向上述混合溶液中加入28mg DTPACA粉末，用5mol/L NaOH溶液滴定，调整pH值至6. 0-8. 0，室温下置于摇床反应2h，得到螯合剂-金属纳米簇溶液。C、螯合剂-金属纳米簇与顺磁性金属离子配位结合称取30mg GdCl3. 6H20溶于lmLlmol/L HCl中，得到Gd3+酸性溶液，将Gd3+酸性溶液倒入所得螯合剤-金属纳米簇溶液中，用5mol/LNa0H溶液滴定，调整pH值至6. 0-8. 0，室温下置于摇床反应2h，得到核-壳型纳米造影剤溶液。d、核-壳型纳米造影剂纯化将所得核-壳型纳米造影剤溶液移入透析袋，室温下，将透析袋置于500ml PBS缓冲液内透析16h，每8h换液新的PBS缓冲液，后将透析袋置于500ml双蒸水内透析8h，除去溶液中无机小分子。图1是本实施例中制备的核-壳型纳米造影剤的透射电镜图，由图1可知，本发明的核-壳型纳米造影剤粒径小(直径小于10nm)，分散性好，悬浮稳定性好。实施例2a、金纳米簇的制备将10mmol/L氯金酸溶液和50mg/mL HSA溶液于37°C下温浴，使上述两种溶液恒温至37°C，将ImL氯金酸溶液加入到ImL HSA溶液中，混合均匀，再加入lmol/L NaOH溶液0. 05mL，调节pH值为强碱性(pH10. 0-14. 0)，将所得混合液置于37°C摇床温育24h，形成金属纳米簇溶液。b、螯合剂与金属纳米簇共价结合取上述金属纳米簇溶液5ml，加入0. 2mL PBS溶液(4mol/L，pH=9)，混合，向上述混合溶液中加入40mg DTPACA粉末，用5mol/LNa0H溶液滴定，调整pH值至9. 0，室温下置于摇床反应Ih,得到螯合剂-金属纳米簇溶液。C、螯合剂-金属纳米簇与顺磁性金属离子配位结合称取50mg GdCl3. 6H20 溶于 0. 05mLlmol/L HCl 中，得到 GcT 酸性溶液，将 GcT 酸性溶液倒入所得螯合剤-金属纳米簇溶液中，用3mol/L NaOH溶液滴定，调整pH值至10. 0，室温下置于摇床反应lh，得到核-壳型纳米造影剤溶液。d、核-壳型纳米造影剂纯化将所得核-壳型纳米造影剤溶液移入透析袋，室温下，将透析袋置于500ml PBS缓冲液内透析16h，每8h换液新的PBS缓冲液，后将透析袋置于500ml双蒸水内透析8h，除去溶液中无机小分子。
实施例3a、金纳米簇的制备将20mmol/L氯金酸溶液和100mg/mL HSA溶液于37°C下温浴，使上述两种溶液恒温至37°C，将0. 5mL氯金酸溶液加入到0. 5mL HSA溶液中，混合均匀，再加入lmol/L NaOH溶液0.1mL,调节pH值为强碱性(pH10. 0-14. 0)，将所得混合液置于37°C摇床温育20h，形成金属纳米簇溶液。b、螯合剂与金属纳米簇共价结合取上述金属纳米簇溶液4ml,加入0.1mL PBS溶液(3mol/L,pH=9),混合，向上述混合溶液中加入50mg DTPACA粉末，用3mol/LNa0H溶液滴定，调整pH值至10. 0，室温下置于 摇床反应3h,得到螯合剂-金属纳米簇溶液。C、螯合剂-金属纳米簇与顺磁性金属离子配位结合称取 70mg GdCl3. 6H20 溶于 3mL0. 5mol/L HCl 中，得到 Gd3+ 酸性溶液，将 Gd3+ 酸性溶液倒入所得螯合剤-金属纳米簇溶液中，用6mol/LNa0H溶液滴定，调整pH值至9. 0，室温下置于摇床反应3h，得到核-壳型纳米造影剤溶液。d、核-壳型纳米造影剂纯化将所得核-壳型纳米造影剤溶液移入透析袋，室温下，将透析袋置于500ml PBS缓冲液内透析32h，每8h换液新的PBS缓冲液，后将透析袋置于500ml双蒸水内透析8h，除去溶液中无机小分子。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.一种核-壳型二模态纳米造影剂，包括金属纳米簇内核，所述金属纳米簇内核包括金属，以及组装在金属外作为保护基团的人血清白蛋白；和包裹所述金属纳米内核的顺磁性金属离子配合物外壳，所述外壳包括通过酰胺键与人血清蛋白共价连接的螯合剂，及配位结合于螯合剂上的顺磁性金属离子。
2.根据权利要求1所述的核-壳型三模态纳米造影剂，其特征在于，直径小于10nm。
3.根据权利要求1所述的核-壳型三模态纳米造影剂，其特征在于，所述的金属纳米簇为人血清蛋白-金纳米簇或人血清蛋白-银纳米簇。
4.根据权利要求1所述的核-壳型三模态纳米造影剂，其特征在于，所述的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙三胺五乙酸(DTPA)。
5.根据权利要求1所述的核-壳型三模态纳米造影剂，其特征在于，所述的顺磁性金属离子为锰离子、铁离子或镧系稀土元素的三价离子。
6.根据权利要求5所述的核-壳型三模态纳米造影剂，其特征在于，所述的顺磁性金属离子为Gd3+。
7.制备权利要求1至6中任一项所述的核-壳型纳米三模态造影剂的方法，包括金属纳米簇制备金属离子与人血清白蛋白混合，得到第一混合液，将第一混合液的 PH值调至10. 0-14. O,反应得到金属纳米簇溶液；螯合剂与金属纳米簇共价结合于所得金属纳米簇溶液中加入缓冲液，得到第二混合溶液，于第二混合溶液中加入螯合剂，得到第三混合溶液，将第三混合溶液的PH值调至6.0-14. O,反应得到螯合剂-金属纳米簇溶液；螯合剂-金属纳米簇与顺磁性金属离子配位结合于酸性溶液中，将顺磁性金属离子溶解，得到第四混合液，将第四混合液与螯合剂-金属纳米簇溶液混合，得到第五混合液， 将第五混合溶液的PH值调至6. 0-8. 0，反应，得到核-壳型纳米造影剂溶液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，还包括将核-壳型三模态纳米造影剂溶液置于透析袋，分别于缓冲液及双蒸水中透析。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述金属纳米簇制备中金属的物质的量与人血清白蛋白的质量比为(5-10) μ mo1:(25-50) mg。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述螯合剂与金属纳米簇共价结合中人血清白蛋白与螯合剂质量比为(100-200) (28-50)。
全文摘要
本发明公开了一种核-壳型三模态纳米造影剂，包括金属纳米簇内核，所述金属纳米簇内核包括金属，以及组装在金属外作为保护基团的人血清白蛋白；包裹所述金属纳米内核的顺磁性金属离子配合物外壳，所述外壳包括通过酰胺键与人血清蛋白共价连接的螯合剂，及配位结合于螯合剂上的顺磁性金属离子。本发明还提供了上述核-壳型三模态纳米造影剂的制备方法。
文档编号A61K49/14GK103007303SQ20121055326
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者蔡林涛, 胡德红, 盛宗海, 龚萍, 高笃阳, 张鹏飞 申请人:深圳先进技术研究院