专利名称：一种融合蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白的应用，特别涉及融合蛋白在促进粒系造血祖细胞增殖方面的应用。
背景技术：
血液具有运输物质、维持组织的兴奋性、调节机能、防御作用等功能，是构成人体和维持人类生命活动的基本物质之一，所以一旦血液的组成成分发生异常变化，就会引起严重的后果。引起血液病的因素很多，诸如化学因素、物理因素、生物因素等，都可以成为血液病发病的诱因或直接原因，其中很多是近几十年现代工业的产物，从而使血液病的发病率有逐年增高的趋势。
骨髓抑制型贫血是较为常见的一类因化学、物理、生物因素及不明原因所致骨髓造血组织减少，引起造血功能衰竭而发生的贫血。骨髓抑制可引起骨髓微环境、造血干细胞、造血细胞生长因子等的损伤，粒、巨核系细胞系统也会受到抑制，粒细胞缺乏会引起严重感染。
目前放、化疗仍然是肿瘤治疗中最常用的手段，但大多数患者治疗后会产生恶心、 呕吐等不良反应，其中最常见而且最为严重的不良反应就是骨髓抑制，不但致使机体造血功能下降，免疫力降低，使得化疗不能按正常剂量进行从而影响治疗的连续性，还可引起白细胞和血小板的减少，患者易并发感染和出血，甚至死亡。尽快促进患者造血功能的恢复成为提闻肿瘤治愈率，降低感染发生率，提闻患者生存质量的关键。
目前临床上主要用粒系集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)等集落刺激因子来促进造血功能的恢复。它们直接刺激粒系造血祖细胞的增殖， 缩短白细胞和中性粒细胞的恢复时间，疗效快。但是由于CSF是直接刺激无自我更新能力的造血祖细胞的增殖，导致造血祖细胞的耗竭，不利于长期的造血功能的恢复，甚至导致骨髓储备不足；另外，一些肿瘤细胞，如白血病细胞具有CSF的正常受体，用药后可能通过提高宿主残余肿瘤细胞的增殖,提高肿瘤的复发率。同时，由于其作用稳定性差,往往导致外周血及骨髓象中充满大量幼稚白细胞，使白细胞计数呈现成倍增长、成倍下降的现象，患者为维持正常疗程不得不反复用药。因此，临床上需要开发出能有效促进造血细胞增殖而对肿瘤细胞无刺激增殖作用的药物。发明内容
本发明的目的是提供一种促进粒系造血祖细胞增殖的融合蛋白的应用。
本发明的另一目的是提供一种用于促进以粒细胞为主的造血细胞增殖的药物组合物。
本发明的再一目的是提供一种能够在体外促进粒系细胞生长的方法。
本发明的第一方面，提供一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示，所述融合蛋白用于制备(i)刺激骨髓间充质干细胞向造血干/祖细胞分化的药物；或 (ii)促进粒系造血祖细胞增殖的药物。 在另一优选例中，所述药物用于(1)预防和/或治疗化疗引起的造血功能低下；(2)预防和/或治疗放疗引起的造血功能低下；或(3)预防和/或治疗白细胞减少症。在另一优选例中，所述药物在放疗或化疗之前、之中、和/或之后使用。本发明的第二方面，提供一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示，所述融合蛋白用于促进粒系造血祖细胞的增殖。在另一优选例中，所述融合蛋白用于体外促进粒系造血祖细胞的增殖。本发明的第三方面，提供一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示，所述融合蛋白用于制备预防和/或治疗白细胞减少症的药物。本发明的第四方面，提供一种体外促进粒系祖细胞增殖的方法，在粒系祖细胞的 培养基添加100ng/mL 5iig/mL的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示。其中，所述粒系祖细胞为粒系造血祖细胞。本发明的第五方面，提供一种药物组合物，包含融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示；以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的药物组合物是无毒的，并且剂型稳定。在另一优选例中，所述药物组合物在放疗或化疗之前、之中、和/或之后使用。在另一优选例中，所述药物组合物还包括环磷酰胺。本发明的第六方面，提供第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备促进粒系 造血祖细胞增殖的药物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图1为各组小鼠不同时间白细胞数(WBC)数的变化图。图2显示化疗用药后第10天各组的骨髓有核细胞数。图3显示化疗用药后第10天各组的脾系数。图4显示化疗用药后第10天各组的细胞集落数。图5显示化疗用药后第10天各组的骨髓有核细胞数中⑶34比例。图6显示化疗用药后第10天各组的骨髓有核细胞数中⑶45比例。
具体实施例方式本申请的发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现本发明所用的融合蛋白具 有促进粒系造血祖细胞增殖的作用，不仅能够有效预防而且能够有效治疗放疗、化疗等引起的造血功能下降及白细胞的减少。在此基础上，完成了本发明。
融合蛋白
本发明所用的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所示。蛋白单链分子量约13_15kD，经复性后该活性蛋白为二聚体，分子量约为25-30kD。本发明所用的融合蛋白，具有良好的活性和稳定性，并提高其表达，促进蛋白复性时正确折叠，延长生物半衰期，增加其在体内的使用效果，且易复性、易分离、活性高及适宜产业化生产和应用。
融合蛋白的应用
本发明的融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示)的用途，能够用于制备(i)刺激骨髓间充质干细胞向造血干/祖细胞分化的药物；或
(ii)促进粒系造血祖细胞增殖的药物。
所述药物用于
(I)预防和/或治疗化疗引起的造血功能低下；
(2)预防和/或治疗放疗引起的造血功能低下；或
(3)预防和/或治疗白细胞减少症。
在另一优选例中，所述药物用于预防和/或治疗白细胞减少症。
所述药物在放疗或化疗之前、之中、和/或之后使用。
实验研究显示，本发明的融合蛋白能促进化疗药物/放疗导致的造血功能低下的恢复。
该融合蛋白对化疗引起的造血损伤有有效的治疗作用。融合蛋白的促造血作用， 主要是作用于骨髓基质细胞，改善造血微环境，从而影响造血干/祖细胞的增殖和分化。骨髓有核细胞数、骨髓粒系集落的检测是最直接反映骨髓增生的证据。CD34细胞和CD45细胞检测则是最直接反映造血干/祖细胞增殖和分化的证据。
经腹腔注射本发明的融合蛋白后，能促进注射化疗药物环磷酰胺造成的小鼠骨髓有核细胞数和外周血白细胞数的恢复，并且与环磷酰胺对照组相比差别显著，表明本发明的融合蛋白以促进粒系造血为主。因此，本发明的融合蛋白可认为是一种有效的促造血因子，在促进粒细胞造血方面具有临床应用前景。
此外，造血微环境是恢复正常造血的先决条件之一，本发明的融合蛋白在体内通过刺激骨髓间充质干细胞增殖，改善造血微环境，促进自然发生或诱发的骨髓抑制或损伤的造血功能恢复，并能刺激骨髓移植后的造血重建。
本发明为造血功能低下、白细胞减少症等提供了一种有效的预防/治疗的药物。
药物组合物
本发明的药物组合物包括本发明的融合蛋白。
本发明所述的药物组合物具有提高造血干/祖细胞的增殖活性、促进造血功能恢复的功能，可用于治疗放、化疗引起或自然发生的骨髓损伤造成的造血功能低下。
与目前临床上普遍使用的重组人粒系集落刺激因子rhG-CSF和rhGM-CSF相比较， 本发明的融合蛋白促增殖作用温和，加快外周血细胞恢复，因而有临床应用的广泛前景。另外融合蛋白不易造成免疫原性。
可按制药领域已知的常规方法，将本发明的融合蛋白或药物组合物制成适合临床上特定给药方式的药物。例如可在本发明的融合蛋白或药物组合物中加入适当的载体或稀释剂，如水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液以制成可经肠胃道以外途径给药的注射剂。也可加入淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、脂质体、明胶、甘露醇等赋形剂或载体。
本发明的融合蛋白或药物组合物可通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等常规途径给药。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例I
融合蛋白的制备
I.重组载体的构建
用全基因合成方式合成DNA序列(SEQ ID NO: I) 通过酶切后将其插入载体 PBV220中。得到优化的表达质粒，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。
2.工程菌的构建、验证和保存
采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用步骤2所得的表达质粒进行转化大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30°C的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时， 在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15%的浓度，分装后在_80°C冰箱保存。
3.工程菌的培养
从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸出粉，5g/L NaCl ； 氨苄青霉素含量为100μ g/mL ;在30°C的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为I :10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH7. 0±0. 2，培养温度为30°C，搅拌速度180rpm，培养4小时。然后，升温至42°C进行诱导，继续培养6小时，培养结束后， 在7500rpm4±2°C条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在 15KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。
4.包涵体的提取和洗涤
将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按Ig =IOmL的比例混合，再按Ig lmg的比例， 与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在IOOOOrpm离心，收集沉淀，以Ig沉淀物20mL洗涤液的比例加入IM尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2°C离心收集沉淀物，再用0. 5%曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以Ig沉淀物20mlTris的比例，加入IOmM的 Tris (pH7. 5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；
5.包涵体的裂解、复性
以Ig包涵体IOmL裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mMPBS、IOmM DTT。在4±2°C下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速lOOOOrpm，离心温度为4±2°C，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为O. lmg/mL，复性10 天，复性液为 20mM Na2HPO4 · 12Η20、1· 5mMNaH2P04 · 2H20、140mM NaCl、5mM EDTA、lmM 谷胱甘妝等。
6.蛋白纯化
采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的融合蛋白二倍体。后在-30 7°C下冻干，得到融合蛋白，序列如 SEQ ID NO:2 所示。
经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95%，分子量约为30KD ；HPLC鉴定其纯度超过95%。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。
每批培养物的得率为7. 02mg/L融合蛋白。
实施例2
融合蛋白在化疗损伤模型中的促进造血作用
2. I本实施例的目的是观察融合蛋白对化疗引起的白细胞减少症的治疗作用，为治疗肿瘤患者化疗后骨髓损伤造血功能低下寻找安全有效的药物。其中，本实施例中使用实施例I制备的融合蛋白，序列如SEQ ID N0:2所示。
本实施例采用清洁级BALB/c小鼠，雄性，体重18 20g，随机分组，每组10只。小鼠共分为五组，如下
CTX组单独给予环磷酰胺(CTX)，剂量为100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L， 连续给药3天；第4天起每天注射100 μ L磷酸缓冲溶液(PBS),连续注射6天；
50 μ g组在连续3天给予环磷酰胺(100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L)后， 连续6天给予融合蛋白，剂量为50 μ g/鼠/天，注射体积为100 μ L ;
25 μ g组在连续3天给予环磷酰胺(100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L)后， 连续6天给予融合蛋白，剂量为25 μ g/鼠/天，注射体积为100 μ L ;
10 μ g组在连续3天给予环磷酰胺(100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L)后， 连续6天给予融合蛋白，剂量为10 μ g/鼠/天，注射体积为100 μ L0
正常组每天注射100 μ L磷酸缓冲溶液(PBS)，连续注射9天；
检测指标如下
(I)各组分别于第I天(未给药时)，第2-10天，连续检测外周血白细胞(WBC)数。 步骤如下用毛细管在小鼠右眼眼眶取血，每次取50yL，放在含有抗凝剂的试管中，然后用血细胞分析仪采用全血模式测试血液中白细胞数。
(2)第10天检测各组小鼠骨髓有核细胞数(BMNC)。步骤如下无菌环境下处死小鼠，在75%的酒精浸泡5min。剥开小鼠大腿的肌肉，取出股骨，用剪刀把股骨两端剪断，用 5mL的注射器吸取PBS，从股骨一端冲洗，然后用400目的无菌纱布过滤冲洗液，过滤后调整细胞浓度，然后用计数板在显微镜下计数。
(3)第10天检测各组小鼠胸骨和股骨骨髓中粒系细胞的变化，步骤如下处死小鼠，取出股骨和胸骨，在10%的甲醛溶液中浸泡48h后，做HE染色的石蜡切片，然后在显微镜下观察粒系细胞的变化。
(4)第10天检测各组小鼠脾系数的变化，步骤如下处死小鼠前，先测量每只小鼠的体重。处死后，取出脾脏称重，脾重与体重的比值即为脾系数。
(5)第10天检测各组小鼠骨髓细胞中⑶34+细胞比例的变化；
步骤按检测指标(2)的方法取出骨髓细胞，调整细胞浓度为5X IO6个/mL，用抗体稀释液洗涤，离心弃上清液，加10μ LCD34抗体，4°C孵化半小时，加抗体稀释液洗去多余的抗体，离心弃上清液，加抗体保存液调整细胞浓度为IX IO6个/mL，采用流式细胞仪检测。
(6)第10天检测各组小鼠骨髓细胞中⑶45+细胞比例的变化；
步骤按检测指标(2)的方法取出骨髓细胞，调整细胞浓度为5X IO6个/mL。
用抗体稀释液洗涤，离心弃上清液，加10 μ IXD45抗体，4°C孵化半小时，加抗体稀释液洗去多余的抗体，离心弃上清液，加抗体保存液调整细胞浓度为I X IO6个/mL，采用流式细胞仪检测。
(7)第11天检测CFU-GM集落数的变化
步骤在无菌环境下处死小鼠，在75%的酒精浸泡5min。剥开小鼠大腿的肌肉，取出股骨，用剪刀把股骨两端剪断，用注射器吸取5mL PBS，从股骨一端冲洗，然后用400目的无菌纱布过滤冲洗液，过滤后的液体调整浓度为I X 105/mL。在无菌环境下，离心ImL冲洗液，加入100 μ L的DMEM培基，吹打均匀成细胞悬浮液。取一个细胞冻存瓶，里面加入ImL 甲基纤维素培养基，再加入10 μ L细胞悬浮液，用移液枪吹打均匀。在24孔细胞培养板中每孔加入500 μ L均匀混合的含细胞的甲基纤维素培基。然后放到恒温培养箱中培养两周， 显微镜下数CFU-GM集落的个数(50个细胞以上为一个集落)。
2. 2本实施例研究融合蛋白对化疗损伤的预防治疗作用，其中使用实施例I制备的融合蛋白。实验分组如下
CTX组连续注射6天PBS，注射体积为100 μ L，然后再注射3天CTX，剂量为 100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L ；
联合用药组先连续6天腹腔注射融合蛋白，剂量为50 μ g/鼠/天，注射体积为 100 μ L，随后再连续注射3天环磷酰胺，剂量为100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L ;
对照组每天注射100 μ L PBS溶液，连续注射9天。
各组小鼠于第10天处死。
检测指标
各组小鼠与第I天，第8天，第10天检测外周血白细胞数，方法同实施例2. I。
2. 3本实施例研究融合蛋白与化疗药联合使用时对化疗引起的白细胞损伤的促恢复作用，其中使用实施例I制备的融合蛋白。实验分组如下
CTX组连续3天注射CTX，剂量为100mg/kg体重/天，注射体积为100 μ L。然后再连续3天注射与CTX等体积的PBS溶液；
联合用药组从第I天起同时给予融合蛋白(剂量为50 μ g/鼠/天)和CTX (剂量为100mg/kg体重/天)，注射体积均为100 μ L ;三天后停用CTX，融合蛋白再继续注射3天， 注射体积为100 μ L ;
对照组每天注射100 μ L PBS溶液，连续注射六天。
各组小鼠于第7天处死。
检测指标
各组小鼠与第I天，第4天，第7天检测外周血白细胞数，方法同实施例2. I。
统计学处理
各项数据均以x±s表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析或t检验。
结果
表I显示了实施例2. I自实验开始第10天，各组小鼠胸骨骨髓细胞中粒系细胞的变化情况。
表I
权利要求
1.一种融合蛋白的用途，其特征在于，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :4所示，用于制备 (i)刺激骨髓间充质干细胞向造血干/祖细胞分化的药物；或 (ii)促进粒系造血祖细胞增殖的药物。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述药物用于 (1)预防和/或治疗化疗引起的造血功能低下； (2)预防和/或治疗放疗引起的造血功能低下；或 (3)预防和/或治疗白细胞减少症。
3.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述药物在放疗或化疗之前、之中、和/或之后使用。
4.一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所示，其特征在于，用于促进粒系造血祖细胞的增殖。
5.一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所示，其特征在于，用于制备预防和/或治疗白细胞减少症的药物。
6.一种体外促进粒系祖细胞增殖的方法，其特征在于，在粒系祖细胞的培养基添加100ng/mL飞ii g/mL的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示。
7.—种药物组合物，其特征在于，包含 融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示；以及 药学上可接受的载体或赋形剂。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物在放疗或化疗之前、之中、和/或之后使用。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括环磷酰胺。
10.如权利要求7所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备促进粒系造血祖细胞增殖的药物。
全文摘要
本发明公开了一种融合蛋白的应用，用于刺激骨髓间充质干细胞向造血干/祖细胞分化的药物；或粒系造血祖细胞增殖的药物，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示。且所述药物可以用于预防和/或治疗(i)化疗引起的造血功能低下；(ii)放疗引起的造血功能低下；或(iii)白细胞减少症。
文档编号A61P7/06GK102973922SQ201210553208
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者刘昌胜, 邢万里, 王靖, 钱江潮, 梁婧 申请人:华东理工大学