Tfeb磷酸化抑制剂及其应用的制作方法

Tfeb磷酸化抑制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及TFEB磷酸化抑制剂。这种分子在所有需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体系统的疾病中有治疗应用，所述疾病例如溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
【专利说明】TFEB磷酸化抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及TFEB磷酸化抑制剂。这种分子在所有需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体系统的疾病中有治疗应用，所述疾病例如溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
[0002]背景和现有技术
[0003]自体吞噬是依赖于两个不同类型细胞器(自噬体和溶酶体)的协同作用的分解代谢过程(I)。饥饿期间，细胞的两个细胞器(compartment)膨胀以促进降解和再循环过程。
[0004]所述溶酶体维持细胞内稳态和调节多种生理过程，包含细胞清除、脂质内稳态、能量代谢、质体膜修复、骨重塑和抵御病原体。所有这些过程需要溶酶体对环境信号的获得性和动态反应。事实上，生理信号(例如衰老和禁食)和病理病症(包含溶酶体贮积症(LSD)、神经退行性疾病)、损伤和感染可以产生所述溶酶体的获得性反应(34、35、36)。
[0005]对调解溶酶体功能和潜在的溶酶体适应机制的理解仍然处在初始阶段。调解溶酶体生物发生的主要作用物是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)亮氨酸拉链转录因子一 TFEB (2)。鉴定的TFEB转录靶标有参与底物降解的溶酶体水解酶，调解溶酶体与其他细胞结构的相互作用的溶酶体膜蛋白，和参加溶酶体酸化的液泡H+-ATP酶(νΑΤΡ酶)复合物的组成(37，2)。
[0006]W02010/092112涉及在所谓清除元件(CLEAR element)上起作用以增强细胞降解通路的分子；其中有TFEB。
[0007]W02010/044885 涉及 mTOR 调节剂。

【发明内容】

[0008]本 申请人:显示了在饥饿中，细胞活化控制自体吞噬通路的主要步骤的转录程序，所述自体吞噬通路包含自噬体形成、自噬体一溶酶体融合和底物降解。预先鉴定为溶酶体生物发生的主要基因的所述转录因子EB(TFEB) (2)通过驱动自体吞噬和溶酶体基因的表达来调整这种程序。TFEB是对饥饿的转录反应的主要作用物，并且通过体外和体内阳性调节自噬体形成和自噬体一溶酶体融合来控制自体吞噬。
[0009]本 申请人:发现特异性丝氨酸磷酸化调节TFEB的核定位和活性。与饥饿相似，基于药理或基因突变对特异性磷酸化的抑制通过活化TFEB来诱导自体吞噬。这些数据公开了通过控制两种协同细胞器的生物发生和合作而参与调节溶酶体一自体吞噬通路的新的、激酶依赖性机制。
[0010] 申请人:发现TFEB磷酸化的药物抑制能用于体内活化细胞的溶酶体和自体吞噬系统，并且因而其代表了治疗不同病症的工具。
[0011]TFEB活性和其核移位与其磷酸化状态有关。特别地，当营养存在时，由mTORCl的TFEB磷酸化抑制TFEB的活性。相反，药物抑制mTORCl，以及饥饿和溶酶体破坏，通过提高其核移位来活化TFEB。另外，对mTORCl的溶酶体破坏或药物抑制的溶酶体和自体吞噬基因的转录反应在TFEB-/-细胞中被抑制。[0012]从Peila-Lopis等的观点来看上述发现甚至更令人惊讶，Peia-Lopis等发现mTOR能磷酸化TFEB但是结论相反(38)，这指示了 mTOR介导的TFEB磷酸化促进核移位，并且因此抑制mTOR造成抑制TFEB活性。
[0013]最后， 申请人:显示了能利用TFEB调节网络的药理学活化以促进由于毒性分子积累造成的疾病中的细胞清除，所述疾病例如溶酶体贮积症和常见的神经退行性疾病。
[0014]因而，本发明的目的是TFEB磷酸化抑制剂在医学中的应用。优选根据本发明的TFEB磷酸化抑制剂作用在TFEB磷酸化通路的激酶上，更优选所述激酶是mTOR和/或PI3K。这种抑制剂的示例是表4第I部分PI3K-mT0R通路中列举的化合物。
[0015]在另一个实施方式中，抑制剂抑制直接磷酸化TFEB分子的激酶，所述激酶优选丝氨酸特异性胞外调节激酶(ERK)，更优选ERK2激酶。这种抑制剂的示例是表4第2部分Ras-ERK通路中列举的化合物。
[0016]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制促分裂原活化蛋白激酶。这种抑制剂的示例是表4第3部分促分裂原活化蛋白激酶中列举的化合物。
[0017]在另一个实施方式中,所述抑制剂抑制极光(Aurora)激酶。这种抑制剂的示例是表4第4部分极光激酶中列举的化合物。
[0018]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制受体酪氨酸激酶。这种抑制剂的示例是表4第5部分受体酪氨酸激酶中列举的化合物。
[0019]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制Polo样激酶。这种抑制剂的示例是表4第6部分Polo样激酶中列举的化合物。
[0020]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制JAK-STAT通路的激酶。这种抑制剂的示例是表4第7部分JAK-STAT通路中列`举的化合物。
[0021]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制细胞周期蛋白依赖性激酶。这种抑制剂的示例是表4第8部分细胞周期蛋白依赖性激酶中列举的化合物。
[0022]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制Wnt信号转导通路的激酶。这种抑制剂的示例是表4第9部分Wnt信号转导通路中列举的化合物。
[0023]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制Src家族激酶。这种抑制剂的示例是表4第10部分Src家族激酶中列举的化合物。
[0024]在另一个实施方式中，所述抑制剂抑制蛋白激酶C家族的激酶。这种抑制剂的示例是表4第11部分蛋白激酶C家族中列举的化合物。
[0025]上述TFEB磷酸化抑制剂用于治疗需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体系统的疾病中有优势，优选用于治疗任意下列病变:溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
[0026]溶酶体贮积症的示例是:激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积病、α -甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、高歇病(包含I型、II型和III型)、GMl神经节苷脂沉积病(包含婴儿型、晚婴型/青少年型、成年型/慢性)、I细胞疾病/黏脂沉积症II型、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(包含婴儿发病、迟发性)、异染性脑白质营养不良、假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积症IIIA型、MPS I型贺勒综合征、MPS I型施艾氏综合症、MPS I型贺勒氏-施艾氏综合征、MPS II型亨特综合征、A型沙费利波综合征/MPS IIIA型、B型沙费利波综合征/MPS IIIB型、A型莫奎欧氏症/MPS IVA型、B型莫奎欧氏症/MPS IVB型、MPS IX型透明质酸酶缺乏症、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积病(包含CLN6病、非典型晚婴型、迟发型变异、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏病/晚婴型CLN2/TPP1病、Kufs/成人发病型NCL/CLN4病、北方癫痫/异晚婴型CLN8和神经元蜡样脂褐质沉积症/婴儿型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷贮积病、庞培氏病/11型糖原贮积病、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病型/GM2神经节苷脂累积病、婴幼儿山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病、青少年山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、多发性硫酸酯酶缺乏症。
[0027]肝病的示例是:α I抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
[0028]肌肉疾病的示例是:自体吞噬液泡肌病和过度自噬X连锁肌病。
[0029]代谢疾病的示例是:高胆固醇血症和脂肪肝病。
[0030]神经退行性疾病的示例是:阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特_雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)和脊髓性小脑萎缩症。
[0031]本发明的另一个目的是使用上述TFEB磷酸化抑制剂以增加细胞生成内源或重组溶酶体酶的产量。
[0032]本发明的另一个目的是生`成溶酶体内源或重组酶的方法，所述方法包含:(I)细胞中使上述TFEB磷酸化抑制剂与自体吞噬/溶酶体系统接触；(2)诱导所述自体吞噬/溶酶体系统；和(3)增加所述溶酶体酶的产量。
[0033]本发明的另一个目的是治疗疾病的方法，所述方法通过给予患者治疗有效量的上述TFEB磷酸化抑制剂。优选由诱导细胞自体吞噬/溶酶体系统能缓解所述疾病。更优选所述疾病选自:溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。上面提供了这种疾病的示例。
[0034]在优选实施方式中，根据本发明治疗疾病的方法包含如下步骤:(I)给予上述抑制剂；(2)在细胞中诱导自体吞噬/溶酶体系统；和(3)增强细胞清除。
[0035]在实施例和非限定示例中描述本发明。
【专利附图】

【附图说明】
[0036]图1:TFEB诱导自体吞噬。(A)稳定地过量表达TFEB的HeLa细胞用GFP-LC3质粒转染，并且如所示来处理。各实验分析大约100个细胞，重复三次。图显示了 GFP阳性囊泡的定量。(B-F)在TFEB-3xf lag稳定过量表达(+)和对照细胞(-)中LC3的Western印迹分析(B)。图表示了使用imagej软件从三个独立印迹中分析LC3II的表达(相对于肌动蛋白);(C)就指定时间(h=小时)使用血清和氨基酸饥饿(Starv)的TFEB稳定过量表达细胞的Western印迹分析，(D-F)在⑶正常培养基、(E)饥饿培养基或者(F)补充有巴伐洛霉素的饥饿培养基(4h;400nM)中培养的TFEB-RNAi和杂乱RNAi (对照(ctr))处理的对照细胞中分离的细胞裂解液。图表示三个独立印迹中LC3II表达的定量(相对于肌动蛋白)，并且条带浓度使用imagej软件分析定量。(G) TFEB mRNA水平通过qPCR分析，使用从靶向TFEB的3种不同siRNA寡核苷酸(寡核苷酸#1、#2、#3)或者用杂乱siRNA寡核苷酸(对照(ctr))转染的细胞中制备的cDNA。(H)用空(对照)或TFEB载体转染的稳定表达GFP-mRFP-LC3的固定HeLa细胞的代表性共聚焦照片。最少计数2000个细胞，并且所述值表示获自三个独立实验的囊泡的平均数值(相对于对照，％)。AL(自噬溶酶体)=mRFP阳性/GFP阴性囊泡；总体:mRFP阳性囊泡。(所有误差线代表标准偏差。T检验(未配对)p值O〈0.05，O <0.01)
[0037]图2:饥饿调节TFEB的核移位和活性。(A)散点图显示不同条件下培养的HeLa细胞中51个自体吞噬相关基因的相对表达水平中倍数变化差异的对数值。X轴=对照组。Y轴=处理组。圆圈表示增加(红色)或降低(绿色)的倍数变化的基因。如指示进行比较。(B)染色质免疫沉淀(ChIP)分析。柱状图显示了 qPCR试验检测的免疫沉淀的DNA的量。数值对进样标准化，并且对模拟对照的相对富集作图。实验重复三次。(C)在正常、饥饿和TFEB-siRNA饥饿细胞中TFEB靶基因表达的qPCR分析。GAPDH和HPRT表示持家基因，而ATG10、ATG9A和ATG4D表示对照基因(非TFEB靶标基因)。(D-F)稳定过量表达TFEB的HeLa细胞不处理或者营养饥饿4h。(D)就TFEB核定位分析各包含50-100个细胞的5个区域。P值O=〈0.01。(E)细胞使用核/胞质分级分离，并用Flag抗体印迹。H3和微管蛋白分别用作核和胞质的标记。(F)核部分用Flag和H3(加样对照)抗体印迹。(G)核提取物中Flag、微管蛋白和H3的Western印迹分析，所述核提取物从正常、饥饿和饥饿/正常培养基刺激Ih (正常)或者培养基刺激前用AP-2 (AKT抑制剂)、雷帕霉素(mTOR抑制剂)和U0126(MEK抑制剂)处理Ih的细胞中制备。总提取物用于确证抑制剂的效率。(H)用组成型活性MEK (caMEK)质粒或用空载体转染的TFEB siRNA或TFEB杂乱对照细胞中溶酶体和自体吞噬基因的qPCR分析。如图所示进行饥饿。(所有误差线代表标准偏差。T检验(未配对)P 值 O〈0.05，O <0.01)
[0038]图3:丝氨酸磷酸化调节TFEB活性。(A)表达突变型TFEB_3xFlag的HeLa细胞中的TFEB亚细胞定位，用F lag抗体免疫染色。分析来自三个独立实验的各自包含50-100个细胞的5个区域。⑶用空、正常和突变TFEB质粒转染后24小时，TFEB靶标基因表达的qPCR分析。(C，D)蛋白提取物中LC3II(C)和Lampl (D)的Western印迹分析，蛋白提取物来自等量的空(pCDNA)、TFEB-3xFlag或TFEBS142A_3xFlag载体转染的HeLa细胞。如图所示加入巴伐洛霉素。实验重复三次，并且对肌动蛋白水平标准化蛋白水平的定量。(E)稳定表达GFP-mRFP-LC3和用pcDNA、Tfeb或Ser-Tfeb转染24h的HeLa细胞中的自噬溶酶体分析(AL=RFP阳性/GFP阴性)。如图1H所述定量。(F)HeLa细胞中使用抗Erk抗体的Western印迹分析，所述HeLa细胞用HA_Erk2和/或TFEB_3xFlag转染，在全血清中维持或营养饥饿4h，并且用抗Flag抗体免疫沉淀。裂解液用抗FLAG免疫沉淀，并且用抗Erk抗体印迹。(G)体外激酶试验。在ATP- Y 32P以及TFEB蛋白的氨基酸120 - 170的肽(TFEB-S-142)或丝氨酸142用丙氨酸取代的相似的肽(TFEB-A-142)存在下培养重组激酶。以所述肽整合的放射性的量来测量磷酸化效率(“磷酸化灵敏度” )。(H)过量表达TFEB的HeLa稳定克隆用ERK1/2特异性siRNA寡核苷酸或者对照siRNA转染。48h后，细胞不处理、血清饥饿或者血清和氨基酸(a.a.)饥饿4h，收集并进行核分离和Flag免疫印迹。总裂解液用ERK抗体探测。所有误差线代表标准偏差。P值O =〈0.05。
[0039]图4 =TFEB介导的自体吞噬诱导的体内分析。(A)在进食的、16h禁食和24h禁食的小鼠中GFP阳性囊泡的免疫荧光分析。图中显示了囊泡的定量。(B)来自进食和禁食动物的肝样品中TFEB靶标基因表达的qPCR分析(n=3;误差线代表标准偏差。P值O〈0.05)。Gapdh和Hprt用作参照基因。(C，D)在用AAV2/9Tcfeb_HA感染并且处死前禁食16h的2个月龄的野生型小鼠中TFEB亚细胞定位的分析。(C)HA免疫荧光分析。图显示了核HA信号的定量。就各个肝计数100个转导的细胞。n=3小鼠/组。*=〈0.001。
(D)在用于核分级分离的肝样品中的HA、微管蛋白(Tubulin)和H3的Western印迹分析。总肝裂解液用HA抗体探测以确证进食和禁食动物中相似的转基因表达。(E)注射有AAV2/9Tcfeb-HA的小鼠的肝提取物中LC3、肌动蛋白、p-ERKl/2和ERK1/2的Western印迹分析。(F)来自2月龄GFP-LC3转基因小鼠的冻存的肝切片中GFP Western印迹分析和DAPI染色，所述转基因小鼠用AAV-Tcfeb-HA或用盐水溶液(对照组)注射，并且处死前自由进食或禁食24h。图中显示了 GFP阳性囊泡的定量。(G)从条件型Tcfeb-3xFLAG转基因小鼠(Tcfeb-3Xflag; AlbCRE)分离的肝样品中自体吞噬和溶酶体TFEB靶标基因表达的qPCR分析，其中转基因表达由肝特异性CRE重组酶(即白蛋白-CRE)驱动。(H)来自Alb-CRE、Tcfeb-3xFlag和Tcfeb_3xFlag; Alb-CRE小鼠的肝蛋白提取物中LC3和肌动蛋白的Western印迹分析。
[0040]图5 =TFEB瞬时过量表达诱导自体吞噬。(A)用编码flag标签的TFEB蛋白的质粒瞬时转染HeLa细胞。转染后48h，细胞收集、裂解，并且就LC3、Flag和肌动蛋白免疫反应性分析IOmg蛋白样品。实验重复三次，并且使用imagej软件分析定量条带浓度。(误差线代表标准偏差。P值O〈0.05) (B)用空载体或用TFEB-3xFlag载体瞬时转染C0S-7细胞。24小时后，细胞用溶酶体抑制剂(抑胃酶肽/E64，lOyg/ml，西格玛公司(SIGMA))处理4h。10 μ g细胞裂解液用于LC3和肌动蛋白免疫印迹。
[0041]图6:在过量表达TcFEB的MEF中自体吞噬的诱导。(A，B)用表达TcFEB的慢病毒感染的MEF和对照细胞的电子显微镜照片。(a)在TcFEB表达上观察到自体吞噬结构，其包含自噬体(AV)和自噬溶酶体(AL)。(B)早期自噬体的形成。电子密集细胞质材料周围的膜(箭头)的分离。(C)自体吞噬结构(AV和AL)和⑶早期自噬体的数目的定量。分析至少30个细胞/组。误差线表示SE`M;P值(*)<0.05; (***)<0.0OOl0
[0042]图7 =TFEB促进自噬体的形成。(A)对照和稳定过量表达TFEB的细胞用巴伐洛霉素(baf;12h400nM)处理，收集并且用于LC3I1、Flag和肌动蛋白免疫印迹。(B)对照和稳定过量表达TFEB的细胞不处理或用IOy g/ml溶酶体抑制剂抑胃酶肽/E64处理4h，裂解并且用于LC3、Flag和肌动蛋白免疫印迹。实验重复三次，并且使用imagej软件分析定量条带强度。(误差线代表标准偏差。P值O〈0.05)
[0043]图8 =TFEB增加了溶酶体水解。在正常或饥饿条件下，在过量表达TFEB、TFEB消耗和对照细胞中长寿命蛋白降解的速率。如图所示加入3-甲基腺嘌呤(3MA)。(误差线代表标准偏差。P值O〈0.05)
[0044]图9:自体吞噬基因亚组的启动子区域中TFEB推定结合元件的分布。数字指示结合元件距离转录起始位点(TSS)的距离。
[0045]图10:饥饿增强TFEB活性。荧光素酶报导试验使用载有四个TFEB结合位点串联拷贝的构建物。正常和TFEB过量表达的HeLa细胞用有TFEB结合位点的人工启动子转染。当饥饿条件下培养时，两种细胞类型显示了增加的反式激活潜能。(误差线代表标准偏差P O〈0.05)[0046]图11:饥饿通过MAPK诱导TFEB的核移位。(A)饥饿诱导胞质TFEB迁移率改变和核移位。正常培养基；饥饿培养基(4h);饥饿+正常，指示了细胞在禁食培养基中培养(4h)，并且收集前Ih用正常培养基培养补充。胞质和核部分用于Flag免疫印迹。(B)如图2G所示处理的HeLa细胞中通过免疫荧光的TFEB细胞定位分析。图显示了有TFEB核定位的细胞的百分比。误差线代表标准差。P值(*)=〈0.05。
[0047]图12 =TFEB 核移位依赖于 S142 磷酸化。(A)表达 TFEB_3xFlag、S142A_3xFlag、S332-3xFlag或S423_3xFlag蛋白的HeLa细胞用于核蛋白分离。等量的核蛋白用丽春红染色确证。(B)在正常和饥饿条件下，表达TFEB-3xFlag、S142A_3xFlag和S142D_3xFlag蛋白的HeLa细胞用于核蛋白分离。(C)从表达TFEB_3xFlag和TFEB_S142A_3xFlag的HeLa细胞分离的胞质蛋白的Flag免疫印迹显示了在正常培养基中相较野生型(WT)TFEB，S142A迁移条带分子量(MW)更低，而在饥饿条件下这种变化不再明显。(D)从表达TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag和S142D_3xFlag的饥饿HeLa细胞分离的胞质蛋白的Flag免疫印迹显示了TFEB-S142D的变化较小。
[0048]图13:S142A TFEB突变显示了增强的活性。稳定过量表达GFP-LC3的HeLa细胞用等量的空、TFEB-3xFlag或S142A-TFEB-3xFlag质粒转染，并且定量自噬体的数目。各点分析至少10个区域(包含4-10个细胞)。实验重复三次。误差线代表标准偏差。P值O〈0.05。
[0049]图14:有TFEB旁系同源物(paralogue)、MITF和相关TFEB有关家族成员的TFEB-人(human) S142磷酸化位点的多个序列的比对。通过ExPASy蛋白组学服务器上的UniProtKB数据库的BLAST检索(2.2.17)鉴定TFEB_human同源物。 申请人:去除含“推定的”、“未鉴定的”和“cDNA”关键词的结果以及不含基因名称的结果。下一步，发明人用ClustalW(l.82)比对剩余的同源物。由Seaview生成多个序列的比对。图显示了与来自TFEB, MITF, TCFEB, TFE3和TCFE3家族的其他蛋白比对的仅20个氨基酸长的TFEB_HUMAN序列片段。“sp”表示SwissProt输入条目，而“tr”表示Tremble输入条目。P19484是UniProrKB登录代码。TFEB_HUMAN分别指示了基因名称和物种名称。
[0050]图15:体内TcFEB过量表达的策略。(A)用抗HA抗体免疫染色的冻存肝切片的代表性图片(以确证病毒转导效率)。(B)来自Tcfeb-HA注射的和对照小鼠的肝蛋白提取物用HA和肌动蛋白抗体免疫印迹。(C)生成TcFEB条件型过量表达的转基因小鼠系。顶部显示了 CRE重组酶之前和之后的转基因载体图。左侧显示同窝幼畜的代表性基因型，而右侧显示小鼠n4中相应的肝特异性TFEB过量表达。
[0051]图16 =TFEB过量表达增加MEF、NSC、HeLa和C0S-7细胞的培养基中溶酶体酶的释放。在培养基和用空载体或TFEB表达载体转染的细胞中测定溶酶体酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β_己糖胺酶的活性。根据生产商方案，使用PolyFect转染试剂(凯杰公司(Qiagen))或 lipofectamine2000 试剂(英杰公司(Invitrogen))转染 HeLa、Cos7 细胞和来自小鼠模型MLIV(S7)、MPSIIIA(S7)和MSD的小鼠胚胎成纤维细胞。前面描述了TFEB-3xFLAG HeLa稳定细胞系(CF7) (2)。图显示了释放的酶活性相较总活性的百分比。[0052]图17:TFEB正向控制溶酶体的胞外分泌。MPSIIIA MEF细胞维持在补充有10%FBS和青霉素/链霉素(正常培养基)的DMEM中。根据生产商方案，亚融合细胞使用LipofectamineTM2000(英杰公司)转染。使用编码有标签的硫酸胺酶(SGSH3XFlag)的质粒和空质粒或编码TFEB的质粒共转染MPS-1IIA MEF0转染后一天，培养基用DMEM0.5%FBS置换。转染后两天，收集条件培养基和球团用于硫酸胺酶活性测量，并且计算释放到培养基中的酶的百分比。
[0053]图18:溶酶体应激诱导TFEB核移位。蛋白免疫印迹，所述蛋白提取自用氯喹(CQ)或水杨酰胺A (Salicylihalamide A) (SalA)处理的表达TFEB-3x Flag的HeLa细胞，并进行核/胞质分级分离以及用FLAG抗体印迹以检测TFEB。组蛋白3 (H3)和微管蛋白分别用作核和胞质的标记。印迹是三个重复实验的代表。
[0054]图19:mT0RCl调节TFEB。(A)溶酶体应激抑制mTOR信号转导。如所示，从处理过夜的HeLa细胞中分离的蛋白提取物的免疫印迹。膜用p-T202/Y204_ERKl/2、ERK1/2、P-T389-S6K和S6K抗体探测以测量ERK和mTORCl活性。(B) Torinl诱导TFEB去磷酸化和核移位。从没有氨基酸的培养基中培养并且如所示后续刺激至少3h的TFEB - 3x FLAGHeLa细胞分离的胞质和核部分的FLAG免疫印迹。用H3和微管蛋白抗体确证正确的亚细胞分级分离。(C，D) ERK和mTOR抑制剂对TFEB核移位的影响和剂量反应曲线。TFEB - GFPHeLa细胞在384孔板上接种，培养12h，并用10种不同浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torinl和Torin2处理，所述浓度的范围是2.54ηΜ_50 μ Μ。在37°C包含各个化合物的RPMI培养基中3h后，细胞洗涤、固定，并用DAPI染色，并且使用共聚焦自动显微镜(Opera高含量系统，帕金埃尔默 公司(Perkin Elmer))照相。(C)各化合物的测试浓度的代表性图片。标尺条代表30ym。(D)图显示了各化合物的10个不同浓度下核移位的百分比(以浓度的对数计)。使用Prism软件计算各化合物的EC50 (详细参见材料和方法)。
(E)氨基酸诱导TFEB分子量变化。从ΗΕΚ-293Τ细胞分离的蛋白提取物的免疫印迹，所述ΗΕΚ-293Τ细胞用TFEB-3XFLAG或空载体转染，并且营养饥饿和用氨基酸(a.a.)刺激50分钟。抗体使用p-T389-S6K、S6K和FLAG。(F) Rag敲减诱导TFEB核移位。稳定表达Flag - 3xTFEB的HeLa细胞用编码靶向萤光素酶(对照)或者RagC和RagD mRNA的短发夹(Sh_) RNA的慢病毒感染。转染96h后，细胞不处理(N=正常培养基)、饥饿(S=饥饿培养基)或者用Torinl (T=Torinl)处理4h,并且用于核/胞质分级分离。用FLAG抗体检测TFEB定位,而微管蛋白和H3分别用作胞质和核部分的对照；S6K磷酸化水平用于测试RagC和RagD敲减效率。(G)mT0RC2不影响TFEB磷酸化。从Sinl-/-或对照胚胎(E14.5)分离的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用编码TFEB - 3xFLAG的逆转录病毒转染；转染后48h，细胞用Torinl (T)处理4h，如所示用于核/胞质分级分离并且用FLAG、微管蛋白和H3免疫印迹。
[0055]图20:mT0RCl 在丝氨酸 142 (S142)磷酸化 TFEB。(A) Torinl 诱导 S142 去磷酸化。HeLa细胞如所述处理，并且总体和核提取物用TFEB p_S142磷酸化抗体和抗FLAG抗体探测。(B)TFEB蛋白结构示意图显示预测的mTORCl磷酸化位点和其在脊椎动物中的保守性。根据人同种型I编号。(C)所述磷酸化位点的序列保守性评分，以及mTOR共有基序和TFEB磷酸化位点附近序列之间的定量一致性。⑶S142和S211调节TFEB定位。表达TFEB - 3xFlag的丝氨酸-向-丙氨酸突变体的HeLa细胞中TFEB亚细胞定位的Flag免疫染色。用DAPI对核进行染色。数值是包含至少50个转染细胞的五个区域的平均。学生t检验(未配对)***P〈0.001。标尺条代表30 μ m。
[0056]图21:溶酶体通过TFEB调节基因表达。(A)氯奎处理抑制原代肝细胞中mTORCl的活性。从 2 月龄 Tcfebflox/flox (对照)和 Tcfebflox/flox; Alb-Cre (Tcfeb-/-)小鼠分离的原代肝细胞不处理或用Torinl、U0126或氯奎处理过夜。随后，细胞裂解，并且蛋白提取物用所示抗体免疫印迹。(B，C)TFEB调节对氯奎和Torinl的转录反应。来自对照(f lox/f 1x)和Tcfeb-/-(f lox/f lox; alb-Cre)小鼠的原代肝细胞中TFEB靶标基因的定量PCR(qPCR)。细胞用氯奎(左)和Torinl(右)处理。表达水平显示为所述处理对比相应不处理样品的表达增加％。指数表示三个独立的肝细胞制备(三只小鼠/基因型)的平均值土s.d.。学生t检验(双尾)*P值< 0.05。
[0057]图22用Torinl及其类似物Torin2处理降低了来自多种硫酸酯酶缺乏症小鼠模型(MSD)的神经干细胞(NSC)中糖胺聚糖的积聚。从MSD小鼠分离的分化的神经干细胞(NSCs)用DMSOUOnM的Torinl或IOnM的torin2处理。24小时后，GAG含量用阿辛蓝(AB)染色来测定。相较DMSO处理的细胞，两种torin都能降低MSD处理细胞中的GAG染色。最下面图显示了 WT NSC中GAG染色的代表性图片。
[0058]图23:Torin2处理降低了 MSD细胞中形成空泡。分化的NSC固定在戊二醛上，并且处理以用于标准电子显微镜。
[0059]图24:Torin2降低了 MSD小鼠肝中GAG的积聚。MSD小鼠用安慰剂(MSD_750)或torin2 (MSD_727)处理 10 天(口服；50%PEG400 中 0.3mg torin2/ 天 / 小鼠)。处理后，收集肝组织并且通过阿辛蓝染色(黑点)测定GAG的积聚。Torin2处理的小鼠显示了肝组织中GAG积聚的降低(n=3)。显示了用阿辛蓝染色的WT肝的代表性图片(WT_739)。
[0060]材料 和方法
[0061]细胞培养、培养基、药物和细胞处理
[0062]HeLa和COS以及HEK-293T细胞购自ATCC。细胞在下面培养基中培养:(正常)补充有10%FBS的DMEM高葡萄糖；(饥饿)补充有IOmM HEPES、有Ca和Mg的HBSS培养基；(血清)补充有20%FBS的EBSS ；(氨基酸培养基)无葡萄糖和无血清DMEM ;药物处理:雷帕霉素(2.5mg/ml，西格玛公司(SIGMA)) 2_4h，除非另有说明；巴伐洛霉素(400nM，西格玛公司)2_4h ;膜岛素(100ng/ml 西格玛公司)2h ;EGF、FGF (BD 生物科学(BD biosciences))；LIF(100ng/ml;ESGR0,密理博公司(Millipore) ) 2h ;PMA (I μ g/ml) 2h。U0126 (MEKi)在25mM(细胞信号转导公司(Cell Signaling))使用，API2 (AKT抑制剂)在ImM使用。溶酶体抑制剂是抑胃酶肽和E64(10mg/ml4h西格玛公司)。在图-21-2的实验中使用下列药物:雷帕霉素(2.5μΜ 5 μ Μ,除非另有说明)来自西格玛公司；Torinl (250ηΜ 250ηΜ,除非另有说明)，来自TOCRIS公司；υ0126(50μΜ 50 μ Μ)，来自细胞信号转导技术公司(Cell Signaling technology);氯奎(100 μ M 100 μ Μ),来自西格玛公司；水杨酰胺(Salicylihalamide)A (2 μ M 2μΜ)是 Jeff De Brabander (德克萨斯大学西南医学中心(UTSouthwestern))友情馈赠。
[0063]如下述生成原代肝细胞:2月龄小鼠用阿佛丁(240mg/kg)深度麻醉，先用补充有IOmM HEPES和0.5mM EGTA的25ml HBSS (西格玛公司H6648)灌注，然后用包含100U/ml胶原酶(Wako公司)和0.05mg/ml胰蛋白酶抑制剂(西格玛公司)的相似溶液灌注。肝在皮氏培养皿中分离，细胞球团在HBSS中洗漆，并且以浓度5x10s细胞/35mm培养涂板，以及在补充有10%FBS、2mM谷胺酰胺、0.1mM胰岛素、0.1mM地塞米松和青霉素/链霉素的William培养基E中培养。第二天，如本文所述处理细胞。如原先所述(53)生成Sinl-/-和对照MEF,并且在补充有10%FBS、谷胺酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中培养。[0064]生成Tcfebflox小鼠系
[0065] 申请人:使用公共可用的胚胎干细胞(ES)克隆(http://www.eucomm.0rg/),其中通过同源重组在外显子4和5靶向Tcfeb。重组ES细胞克隆注射到用于生成载有工程改造的等位基因小鼠系的胚泡中。肝特异性KO通过Flox/Flox小鼠与在白蛋白启动子下表达CRE的转基因系小鼠(ALB-CRE)杂交生成，所述转基因系小鼠获自杰克逊实验室(Jacksonlaboratory)。所有涉及小鼠的方法得到贝勒医学院动物护理和使用委员会的批准。
[0066]转染、质粒和siRNA
[0067]使用反向转染方法,用脂质转染胺(Iipofectamine) LTX(英杰公司)转染质粒和SiRNA0 48或72h后收集siRNA转染的细胞。siRNA TFEB在50nM(达马可公司(Dharmacon))使用，siRNA ERKI/2在100nM(细胞信号转导公司(Cell Signaling))使用。
[0068]根据生产商方法,使用脂质转染胺(Iipofectamine) 2000或LTX(英杰公司)将DNA 质粒 pRK5-mycPATl、pCEP4_TFEB_his、pClG2_TFEB 和 p3x FLAG-CMVTFEB 瞬时转染细胞。根据生产商(司查塔基公司(Stratagene))指示,进行定位诱变,通过测序证实正确的诱变。
[0069]Western 印迹
[0070]细胞或组织在补充有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(ROCHE))和磷酸酶抑制剂(西格玛公司)的RIPA缓冲液中溶解。10-30微克加载到4-12%Bis-Tris凝胶(NUPAGE，英杰公司)，转移到PVDF膜，并且使用ECL方法(皮尔斯公司(Pierce))通过免疫印迹分析。使用以下抗体:LC3(诺复斯生物制品公司)、FLAG、b-肌动蛋白、微管蛋白(西格玛公司)、HA(科文斯公司(Covance) )、H3、ERK1/2、p-ERKl/2、p_AKT、P-70S6K(细胞信号转导公司(Cell Signaling) )、ERK2 (圣克鲁兹公司(Santa Cruz))。使用Imagej软件分析定量蛋白水平。
[0071]核/胞质分级分离
[0072]在6孔板中以50%融合接种细胞，并且血清饥饿过夜(ON)。第二天在DMSO或激酶抑制剂存在下加入正常培养基。如原先所报导进行亚细胞分级分离。简单说，细胞在0.5曲通 X-100 裂解缓冲液(50mM Tris-HCl.0.5% 曲通、137.5mM NaCl、10% 甘油、5mM EDTA，补充有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中裂解。上清液代表胞质部分，而核球团洗涤两次，并在0.5曲通X-100缓冲液0.5%SDS中裂解并超声处理。
[0073]长寿命蛋白的降解
[0074]用L-U14C-丝氨酸培养亚融合细胞20h，并且用冷培养基追踪Ih以降解短寿命蛋白。随后细胞用正常培养基或饥饿培养基(最终存在3-MA)培养4h。从培养基中可溶放射活性与可酸性沉淀的细胞球团中不溶放射活性的比率来计算长寿命蛋白的降解速率。
[0075]RNA提取、逆转录、ChIP和定量PCR
[0076]使用TRIzol (英杰公司)从组织中或者使用RNAesy柱(凯杰公司)从细胞中提取总RNA。使用TaqMan反转录试剂(应用生物系统公司)进行逆转录。溶酶体和自体吞噬基因特异性引物以在先报道2。自体吞噬基因引物和小鼠引物购自SA生物科学公司(SABiosciences)。使用SA生物科学公司在线数据分析网站(http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)计算倍数变化,所述网站使用DDCt方法。简单说,最稳定的持家基因(GAPDH、ACTB、B2M、RPL13A、HPRT和亲环蛋白(Cyclophillin))的平均用作“标准化”基因以计算DCt值。然后，在“对照”组和“实验”组之间计算DDCt值。最后，使用2(_DDGt)计算倍数变化。分组生物学重复以使得计算倍数变化值。未配对T检验用于计算统计学显著性。图中星号指示P值〈0.05。
[0077]蛋白激酶预测
[0078] 申请人:使用五种方法，包含 CrPhos0.8、GPS_2.l、PhosphoMotifFinder、Networkin和PHOSIDA (15-19)，使用默认参数。根据其置信评分，进一步过滤CrPhos0.8和GPS-2.1预测。对前者而言，用假阳性率(FPR)等于或小于30%来考虑预测。对后者而言，用评分等于或大于5来考虑预测。计算GPS-2.1评分以作为实际评分和临界值之间的差异。从其他三种方法中获得所有预测。Networkin的示例中，结合Networkin和Networkin2的预测。各方法描述了在不同激酶分类中与S142位点相关的激酶，所述分类简单涉及四种层次水平:激酶组、激酶家族、激酶亚家族和激酶本身。为了在各层次水平获得一般共识，如果所述预测尚未以这四种层次水平分类，那么对各预测进行这种分类。在http://kinase, org/kinbase数据库的脊椎动物进化支和人物种下检索缺失分类。根据各分类中的主要得票发现各分类的一致性。
[0079]体外激酶实验
[0080]TFEB-S-142:Seq Id N0.2 的氨基酸(aa.) 117-166:
[0081 ] PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0082]和TFEB-A_142:Seq Id N0.4，对应 Seq Id N0.2 的氨基酸 117-166，其中 Serl42用Ala (粗体)取代:
[0083]PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNAPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0084]其通过GENESCRIPT公司`合成。所述测试肽TFEB-A-142和TFEB-S-142在50mMHEPES pH7中制成ImM。其似乎没有不溶解的问题。使用密理博公司标准放射性测量试验，所述激酶试验在室温下、在200 μ M ATP和100 μ M各个肽存在下进行40分钟。在其标准KinaseProf i Ier?试验浓度下使用所有蛋白激酶。培养之后，通过加入酸停止所有试验，并将等分样品点样在P30和Filtermat A上以分离产物。所有测试重复进行三次，并且包含各蛋白激酶的常见底物作为对照。
[0085]体内基因递送
[0086]小鼠在贝勒医学院的转基因小鼠设施中饲养(美国德克萨斯州休斯顿)。GFP-LC3转基因小鼠是N.Mizushima的友情馈赠。除非另有说明，使用C57B6雌性小鼠(4周龄)。所述AAV载体由TIGEM AAV载体中心实验室生成。简单说，通过取代GFP序列，把小鼠TFEB (TcFEB)编码序列克隆到pAAV2.1-CMV-GFP质粒中，并与HA标签融合到框架中。然后将所得的PAAV2.1-CMV-TcFEB-HA与pAd-Helper和pack2/9包被质粒三重转染到亚融合293细胞中。重组AAV2/9载体通过两轮CsCl纯化。表达为基因组拷贝(GC/mL)的载体滴度通过使用TaqMan (马萨诸塞州沃森姆的帕金埃尔玛公司，生命和分析科学)PCR定量和点印迹分析来评价。各小鼠用1.25χ10η病毒颗粒眼窝窦后注射，并且3周后杀死。分析基因表达时，饥饿小鼠禁食16h，或者分析GFP-LC3点数目时，禁食24h。
[0087]组织学和免疫荧光
[0088]收集肝样品，并且在4%多聚甲醛的PBS固定过夜。在10和30%蔗糖的PBS中冷冻保存后，样品在OCT (加利福尼亚州托兰斯SF公司(Sakura Finetech))中冷冻，并且切片成30μm厚度。在Axioplan2(纽约州桑伍德的Zeiss公司)上照相。对免疫荧光而言，切片在室温下2.5%BSA的PBS+0.1%曲通X-1OO中封闭2h。封闭后，样品用一抗培养20h，氮后在PBS+0.05%TX-100中洗涤三次，用偶联到Alexafluor 488或Alexafluor 555 (英杰公司)的二抗培养3h。对HA的免疫组织化学分析，使用亲和素-生物素复合物(ABC)方法(Vectastain Elite ABC试剂盒)。抗GFP来自阿柏堪穆公司(Abcam);(稀释1:500)。
[0089]电子显微术
[0090]对照和TFEB过量表达细胞用PBS洗涤，并且在溶解在0.2M Hepes缓冲液(ρΗ7.4)中的1%戊二醛中室温下固定30min。细胞然后在0s04中再固定2h。在梯度乙醇脱水后，细胞在Epon812(伏路卡公司(Fluka))中包埋，并且在60°C聚合72h。在Leica EM UC6中切薄切片，所述薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅复染。使用装备有ULTRA VIEW CCD照相机(荷兰艾恩德霍芬的飞利浦公司(Philips))的Philips Tecna1-12电子显微镜，从薄切片获得EM图片。使用AnalySIS软件(德国明斯特的软图像系统(Soft Imaging Systems) GmbH)进行空泡形成定量。选择用于定量的细胞是基于其对体视学(stereologic)分析的适应性，即仅仅分析通过其中心区域的细胞切片(基于存在高尔基膜的检测)。
[0091]动物模型
[0092]所有涉及小鼠的方法得到贝勒医学院动物护理和使用委员会的批准。GFP-LC3转基因系如原先所述。如下生产Tcfeb的组织特异性过量表达:在CAGCAT盒[鸡肌动蛋白启动子(CAG)后接氯霉素乙酰转移酶(CAT)cDNA (侧接21oxP位点)]后插入Tcfeb_3xFlagcDNA，并且用于生成转基因小鼠(贝勒医学院转基因中心)。小鼠然后与白蛋白-CRE(获自杰克逊实验室)系杂交。对48饥饿方案而言，小鼠禁食22h，随后进食2h，并且杀死前再禁食 24h。
[0093]酶活性
[0094]使用合适的荧光测定或比色测定底物测量溶酶体酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和己糖胺酶的活性。SGSH活性按照Fraldi等Hum Mol Gen2007 (33)所述测量。
[0095]免疫印迹和抗体
[0096]小鼠抗TFEB单克隆抗体购自MB公司(My Biosource)目录号MBS120432。为了生成抗pS142特异性抗体，用下列偶联到KLH的肽免疫兔子:AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后，杀死兔子，并且收集血清。使用循环通过包含非磷酸化抗原的柱来除去血清中非磷酸化特异性的抗体。然后使用包含磷酸化肽的柱来纯化磷酸化特异性抗体。
[0097]用包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(西格玛公司)的M-PER缓冲液(赛默飞公司(Thermo))裂解细胞；如上述分离核/胞质部分。蛋白通过SDS - PAGE (英杰公司；还原NuPAGE4 - 12%Bis_tris凝胶，MES SDS缓冲液)分离。如需要，所述凝胶使用20mllmperial蛋白染色(塞摩费舍尔公司(Thermo Fisher))在室温染色lh，并且用水脱色。通过用1-Blot (英杰公司)把蛋白转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹分析。所述膜用5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液(含0.05%吐温20的TBS)封闭，并且用一抗抗体抗FLAG和抗微管蛋白(西格玛公司；1:2000)、抗H3(细胞信号转导公司；1:10000)在室温培养2h，而下列抗体在5%BSA 中培养过夜(ON):抗 TFEB (MB 公司;1:1000)、抗 P TFEB (1:1000) ERK1/2、p-ERKl/2、p-P70S6K、P70S6K (细胞信号转导公司；1:1000)。所述膜用TBS-T缓冲液洗涤三次，并且用碱性磷酸酶偶联的IgG (普洛麦格公司；0.2mg/ml)室温处理lh。所述膜用TBS缓冲液洗涤三次，并且表达的蛋白通过加入IOml Western Blue稳定底物(普洛麦格公司)观察。
[0098]高含量核移位试验
[0099]TFEB-GFP细胞在384孔板中接种，培养12小鼠，并且用10个不同浓度(50000nM、16666.66ηΜ、5555.55ηΜ、1851.85ηΜ、617.28ηΜ、205.76ηΜ、68.58ηΜ、22.86ηΜ、22.86ηΜ、
7.62ηΜ和2.54ηΜ)的ERK抑制剂U0126 (西格玛奥德里奇公司)或mTOR抑制剂雷帕霉素(西格玛奥德里奇公司)、Torinl和Torin2处理。3小时后，37°C下RPMI培养基中，细胞被洗涤、固定并且用DAPI染色。为了获得图像，通过使用聚焦自动显微镜(Opera高含量系统，帕金埃尔默公司)，对384孔板的各孔照10张照片。开发专门的脚本以进行不同图像中TFEB定位的分析(Acapella软件，帕金埃尔默公司)。所述脚本计算来自核TFEB-GFP荧光平均强度除以TFEB-GFP荧光胞质平均强度的比值。所得结构使用相同板中的阴性(RPMI培养基)和阳性(HBSS饥饿)对照样品来标准化。数据通过使用Prism软件(GraphPad软件)的各化合物不同浓度的核移位百分比来表示。使用非线性回归拟合(Prism软件)计算各化合物的EC50。相同方法用于筛选145个激酶抑制剂库。
[0100]溶酶体贮积症实验的细胞和小鼠模型的方法
[0101]细胞培养
[0102]从WT和MSD幼鼠(PO)的皮层中分离神经元祖细胞，所述分离使用神经组织分离试剂盒通过组织勻质化和使用表达干细胞标记普罗敏蛋白(Prominin)-1细胞的磁性分选分离(MBS公司(MiltenyiBiotecSrl))。神经元祖细胞在存在EGF和FGF2生长因子(PT公司(Pr印otech))的ESGRO完全培养基(海克隆公司(Hyclone))中培养。如所示，神经干细胞(NSC)由除去生长因子而分化，并且在包含2%血清的ESGRO培养基中培养至少48h。
[0103]小鼠处理
[0104]多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)小鼠用安慰剂(n=3)或torin2(n=3)处理10天(口服强饲；50%PEG400中0.3mg torin2/天/小鼠)。处理期间，监测和称重处理的小鼠(处理后没有观察到重量的变化)，并且所有处理的小鼠都存活。处理后，手机肝组织并且通过阿辛蓝染色测定GAG的积聚。
[0105]NSC的阿辛蓝染色
[0106]通过使用标准方法从WT和MSD幼鼠(PO)的皮层中分离神经元祖细胞神经干细胞(NSC)室温下在甲氧乙酰苯胺(Methacarn) (60%甲醇；10%乙酸；30%氯仿)固定15min。洗涤后，细胞在1%阿辛蓝PH2.5中染色3小时，用0.3%乙酸和水淋洗，并且100%安装已用于观察。
[0107]组织样品的阿辛蓝染色
[0108]石蜡包埋的肝组织切片用1%阿辛蓝(西格玛-奥德里奇公司)染色，并且用核固红(Nuclear-Fast red)(西格玛-奥德里奇公司)复染。
[0109]电子显微术
[0110]细胞用PBS洗涤，在0.05%戊二醛中固定，并且室温下在0.2M Ifepes缓冲液(PH7.4)中溶解30min。细胞然后在0s04中再固定2h。在梯度乙醇脱水后，细胞在Epon812 (伏路卡公司(Fluka))中包埋，并且在60°C聚合72h。在Leica EM UC6中切薄切片，所述薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅复染。
[0111]结果[0112]TFEB诱导自体吞噬
[0113](巨)自体吞噬是进化保守的机制，其把胞质内材料靶定到溶酶体，因而在营养饥饿期间提供能量供应(3)。饥饿期间自体吞噬活性由mTOR调节，mTOR活性依赖于细胞能量需要。
[0114]由于自体吞噬是自噬体和溶酶体紧密关联的结果(1)， 申请人:测试了 TFEB是否调节自体吞噬，TFEB是控制溶酶体生物发生的转录因子。因为TFEB对溶酶体生物发生和功能(2)以及溶酶体的胞外分泌正向控制(图16和17)，应该预测到由于TFEB通过溶酶体而增加降解，TFEB过量表达应该降低自噬体数目。令人惊讶的是，HeLa细胞中稳定的TFEB过量表达显著增加了自噬体数目，如使用LC3标记所测定，所述LC3标记特异性结合自噬体(4-7)(图la, b)。通过HeLa和Cos细胞中瞬时过量表达TFEB获得相似数据(图5)。在过量表达TFEB的慢病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，通过电子显微镜也检测到自噬体数目的增加(图6)。这种增加在用自噬体的溶酶体抑制剂/LC3II降解巴伐洛霉素和抑胃酶肽/E64(8)处理的细胞中持续进行，指示了 TFEB活化自噬体的形成(图1a和7)。在TFEB过量表达的细胞中营养饥饿没有再增加自噬体数目(图la，c)，指示了 TFEB过量表达对自体吞噬的饱和效应，并增加了 TFEB可以是饥饿诱导的自体吞噬的重要调节物的可能性。
[0115]与这些发现一致，HeLa细胞中TFEB的RNA干扰(RNAi)造成了正常和饥饿条件、有或没有巴伐洛霉素存在下时LC3II水平的降低(图ld-f)。显然，LC3II的降低与不同RNAi寡核苷酸造成的TFEB水平的 下调有关，显示了试验的特异性(图1g)。这些功能获得和功能丧失的数据指示了自卩遼体和溶酶体的生物发生(biogeneses)是由TFEB共同调节。 申请人:然后使用RFP-GFP串联标签的LC3蛋白测量了自噬体向溶酶体运输的速率(9)，所述标签的LC3蛋白区分早期溶酶体细胞器(GFP-阳性/mRFP-阳性)与酸化的自噬溶酶体(GFP-阴性/mRFP-阳性)，因为GFP信号(但不是mRFP)在酸性细胞器内淬灭(9)。发现了 TFEB过量表达细胞中自噬溶酶体的数目高于对照细胞，这指示了 TFEB提高自噬体一溶酶体融合，因而促进了溶酶体流动(图lh)。TFEB调节自体吞噬作用的功能证据来自TFEB过量表达能增强长寿命蛋白的降解，并且TFEB敲减则降低。自体吞噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)消除这种增强(10)(图8)。
[0116]为了测试TFEB是否调节自体吞噬基因的表达， 申请人:分析了报导参与自体吞噬通路数个步骤的一组51个基因的mRNA水平(1，12，13)。观察到过量表达TFEB的细胞中自体吞噬基因表达水平的提高与饥饿期间所得的提高非常相似(HeLa细胞在EBSS培养基中4h)(皮尔逊(Pearson)相关:r值=0.42; p值=0.001)，而其在TFEB沉默之后下调(图2a 与表 1.2 和 2)。其中，UVRAG、ffIP1、MAPLC3B、SQSTMl、VPS11、VPS18 和 ATG9B 的表达受TFEB过量表达的影响最显著(表1，2)。已知这些基因在自体吞噬的不同步骤中起作用，并且似乎是TFEB直接靶标，因为其在启动子中载有至少一个CLEAR位点⑵(图9)。另外，在这四个基因中，通过定量染色质免疫沉淀试验(QChip)确证了 TFEB与靶标序列的结合(图2b)。有趣的是，VPSl1、VPS18和UVRAG在自噬体运输到溶酶体中起作用(14)，这与TFEB过量表达细胞中溶酶体一自噬体融合的显著增强一致。
[0117]这些数据指示TFEB参与饥饿诱导的自体吞噬的转录调节。这个结论受下面观察的强烈支持。首先，营养饥饿诱导TFEB与溶酶体和自体吞噬基因启动子结合的增加，如QChIP所测量(图2b)。第二，萤光素酶报导试验(2)显示了饥饿增强TFEB对靶标基因转录的影响(图10)。第三，TFEB直接靶标的表达在饥饿细胞中上调，并且这种上调受TFEB沉默的抑制(图2a，c)。
[0118]饥饿调节TFEB的核移位和活性。
[0119]为了鉴定TFEB的饥饿诱导活化的机制， 申请人:分析了其在饥饿细胞中的亚细胞定位和转录后修饰。在正常条件下，TFEB定位到胞质(2)。观察到营养饥饿(EBSS培养基)快速降低TFEB核移位(图2d，e)，以及饥饿细胞的胞质TFEB看来有比正常进食细胞TFEB更低的分子量，如western印迹分析所示(图1la)。这个分子量位移快速并短暂地发生，并且在向饥饿细胞中再加入正常培养基后I小时内消除，同时核TFEB降低(图1la)。通过提供有血清、氨基酸或者生长因子(即胰岛素或EGF)的EBSS培养基， 申请人:观察到相较仅用饥饿培养基，TFEB核移位的显著抑制(图2f)。当使用补充有细胞因子(即INF或LIF)的EBSS时，几乎没有影响(图2f)，指示了 TFEB活化是由对营养和生长因子敏感的信号转导机制调节的过程。 申请人:用补充有抑制mT0R(雷帕霉素)、PI3K-AKT(曲西立滨)和MEK(U0126)激酶的药物的正常培养基刺激饥饿的细胞。MEKi抑制生成了与饥饿类似的TFEB核定位，而AKT和mTOR抑制没有影响(图2g和图1lb)。这些数据指示了 TFEB活性受MAP激酶调节，揭示了这 个信号转导通路在调节饥饿诱导的自体吞噬中有出乎意料的作用。此外，HeLa细胞中组成型活性MEK(caMEK)的表达在饥饿期间造成TFEB靶标基因表达的下调，因而模拟了 TFEB敲减的效果(图2h)，而TFEB消耗细胞中caMEK过量表达对TFEB靶标基因的表达没有影响(图2h)。
[0120]丝氨酸磷酸化调节TFEB活性
[0121]为了更详细分析MAPK信号转导和TFEB之间的关系， 申请人:进行了质谱分析，并且鉴定了至少三个丝氨酸(即S142、S332和S402)在营养富集培养基中被磷酸化，但是在饥饿培养基中则没有。把三个丝氨酸各自突变成丙氨酸以消除磷酸化。在HeLa细胞中表达各突变的TFEB蛋白，并且分析TFEB核移位。所述TFEB(S142A)突变显示了比TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)显著增加的核定位(图3a和图12a)。相反，磷酸模拟突变(TFEB S142D)在营养饥饿中不能移位到核(图12b)。所述S142A TFEB突变在正常培养基中在更小分子量处迁移，但是在饥饿培养基中则不是，而所述S142D突变在饥饿培养基中显示了比WT TFEB的变化更小(图12c，d)，这进一步证明了 S142在正常培养基中磷酸化，但是在在饥饿培养基中则没有。相较TFEB (WT) ,TFEB (S332A)和TFEB (S402A)，TFEB (S142A)的表达造成TFEB靶标基因表达水平的增加(图3b)。一致地，相较wt TFEB, TFEB(S142A)产生自体吞噬/溶酶体系统的更强的诱导，如自噬体(图3c和图13)、溶酶体(图3d)和自噬溶酶体(图3e)数目增加所显示。因此，TFEB核移位和活化受丝氨酸142磷酸化的调节。
[0122]为了鉴定负责丝氨酸142磷酸化的特异性激酶， 申请人:进行生物信息学分析，所述分析使用基于在一组实验确证的磷酸化位点基础上构建的计算模型的方法(15-19)(详细见方法)。与前面结果一致，鉴定了丝氨酸特异性胞外调节激酶(ERK)作为丝氨酸142磷酸化的一流(top-ranking)候选(表3)。有趣地是,丝氨酸142在其他HLH-亮氨酸拉链基因家族成员中高度保守，例如小眼畸形(Microphthalmia)转录因子(MITF)(图14)中发现是由ERK2磷酸化(20)。ERK2介导TFEB磷酸化的其他证据来自在正常培养中ERK2-TFEB免疫共沉淀(图3f)，但是在饥饿培养中则没有。此外，SiRNA介导的ERK1/2蛋白敲减诱导与营养饥饿相似程度的TFEB核移位(图3h)。
[0123]TFEB介导的自体吞噬诱导的体内分析。
[0124] 申请人:分析了在GFP-LC3转基因小鼠体内溶酶体/自体吞噬通路的TFEB介导控制的生理相关性(11)。由于已报导肝中观察到营养消耗后的自体吞噬反应，他们关注肝的研究。肝中，GFP阳性囊泡的数目在禁食24h后开始增加，并且在48h达到峰值(48h饥饿方案见材料和方法)(图4a)，而禁食16h后，自体吞噬和溶酶体TFEB靶标基因的转录诱导明显(图4b)。因此，转录活化先于自噬体的体内形成。重要地是，禁食16h时，TFEB亚细胞定位全部在核中(图4c，d)，并且ERK磷酸化水平比喂养动物降低(图4e)，表明饥饿调节体内TFEB活性，这与培养细胞中观察到的相似。
[0125] 申请人:使用病毒和转基因介导的TFEB过量表达来评价TFEB是否足够诱导体内自体吞噬。用包含HA表位标签的鼠TcfebcDNA的腺关联病毒(AAV)载体(AAV2/9 - Tcfeb-HA)全身(systemically)注射GFP-LC3转基因小鼠(11)(图15a，b)。来自Tcfeb注射动物的肝样品显示了 GFP阳性囊泡的显著增加，并且这种增加由饥饿进一步增强(图4e，f)。另外，来自条件Tcfeb-3xFLAG转基因小鼠的肝样品(其中转基因表达由肝特异性CRE重组酶驱动(即白蛋白-CRE)(图15c))显示了溶酶体和自体吞噬基因表达和自噬体数目相较对照同胞仔的显著增加(图4g，h)。总之，这些数据表明TFEB在饥饿诱导自体吞噬的转录调节中的重要作用。
[0126]TORCl调节TFEB亚细胞定位
[0127]然后在HeLa和HEK-293T细胞中分析TFEB亚细胞定位，所述细胞用TFEB - 3xFLAG质粒瞬时转染，并且用溶酶体功能抑制剂处理过夜。这些处理包含使用氯奎(溶酶体pH梯度抑制剂)和水杨酰胺A(SalA) (ν-ΑΤΡ酶选择性抑制剂)(39)。核/胞质分级分离后进行的免疫印迹显示了溶酶体应激也诱导外源表达的TFEB的核移位，并且TFEB核积聚也与TFEB - 3x FLAG向更低分子量变化有关，指示了溶酶体应激可以影响TFEB磷酸化状态(图18)。
[0128]基于mTORCl位于溶酶体膜和其活性依赖营养和溶酶体功能(40，41)， 申请人:假定溶酶体应激对TFEB核移位的影响可以由mTORCl介导。与这个观点一致，氯奎或SalA抑制mTORCl活性，如P-P70S6K (已知mTORCl底物)水平所测量(图19A，41)。mTOR的参与看来与原先已知mTOR抑制剂雷帕霉素不影响TFEB活性的观察相反。然而，近期数据指示雷帕霉素是mTOR的部分抑制剂，因为在这种药物存在下，一些底物仍然被有效地磷酸化(42)。因此， 申请人:使用激酶抑制剂Torin I和Torin 2 (属于靶向mTOR催化位点的新分子类型)因而完全抑制mTOR活性(42，46，47)。
[0129] 申请人:用补充有Torin 1(250nM)、雷帕霉素(2.5 μ Μ)或ERK抑制齐[JUO126 (50 μ Μ)的富含氨基酸培养基刺激饥饿细胞，在所述细胞中TFEB被磷酸化并且定位到核。仅用营养刺激饥饿细胞诱导TFEB分子量的显著变化，并且重新定位到胞质中(图19Β)。在浓度为50 μ M的ERK抑制剂U0126存在下，营养刺激仅诱导部分TFEB分子量变化，表明ERK磷酸化对TFEB胞质定位起部分作用。用2.5 μ M雷帕霉素处理也造成部分分子量变化，但是不影响TFEB的亚细胞定位(图19Β)。然而，Torin I (250ηΜ)处理完全防止营养诱导的分子量变化，继而造成大量TFEB核积聚。[0130]因为Torin I抑制mTORCl和mT0RC2复合物， 申请人:然后评价了各复合物对TFEB的调节作用。下面三个观察指示了 TFEB主要由mTORCl调节:(I)用氨基酸刺激饥饿细胞(所述氨基酸活化mTORCl但是不活化mT0RC2)，诱导广泛的TFEB分子量变化，所述分子量变化强烈暗示了磷酸化事件(图19E) ; (2)敲减向mTORCl介导氨基酸信号的RagC和RagD，甚至在全营养培养基培养的细胞中造成TFEB核积聚(图19F) ; (3)在mT0RC2信号破坏的细胞中(Sinl-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)) (52-54)中，TFEB在Torin I处理后经历与对照细胞相似的分子量变化和核移位(图19G)。
[0131]mTORCl通过S142磷酸化控制TFEB亚细胞定位
[0132]为了测试mTORCl是否在S142磷酸化TFEB， 申请人:生成了仅识别S142磷酸化的TFEB磷酸特异性抗体。使用这种抗体， 申请人:观察到在稳定过量表达TFEB - 3xFLAG并且在营养耗尽培养基中培养的HeLa细胞中，TFEB不再有S142磷酸化，这与上面报导的 申请人:的结果一致(图20A)。
[0133]然后，分析了在补充有含或不含Torin I或雷帕霉素的正常培养基的饥饿细胞中的S142磷酸化水平。当Torin I清楚地减弱营养诱导的S142磷酸化时，雷帕霉素却没有这效果，表明S142表示雷帕霉素抗性mTORCl位点(图20A)。这些结果清楚地表明TFEB是mTOR底物，并且S142是mTOR对TFEB磷酸化的关键残基。
[0134]近期的发现指示了 mTORCl在多个位点磷酸化其靶标蛋白(43，44，45)。为了鉴定其他可以被mTOR磷酸化的丝氨酸残基， 申请人:检索了 TFEB编码序列中mTORCl的共有磷酸受体基序(43)(图20B和C)。将 推定为mTORCl靶标的所有TFEB氨基酸残基突变成丙氨酸。然后测试了各个突变对TFEB亚细胞定位的影响，并且发现与S142A相似，位点211的丝氨酸-丙氨酸突变(S211A)造成TFEB的组成型核定位(图20D)。其他丝氨酸残基突变与野生型TFEB的表现相似(图20D)。
[0135]总之，这些数据指示了除S142以外，S211也在TFEB亚细胞定位中起作用，并且表明S211表示mTORCl的其他靶位点。
[0136]溶酶体调节TFEB中的基因表达
[0137]因为TFEB与mTORCl的相互作用控制TFEB核移位， 申请人:测试了 TFEB调节基因表达的能力是否受这种相互作用的影响。在来自肝中删除TFEB的条件敲除小鼠系(Tcfebflox/flox;alb-CRE)和对照小鼠系(Tcfebflox/f1x)的原代肝细胞中测试TFEB靶标的数个溶酶体/自体吞噬基因的表达(37)。细胞用氯奎或Torinl处理，或不处理。这些处理抑制mTOR，如p-S6K水平所测量的，而p_ERK的水平没有受影响(图21A)。相较对照肝细胞，从TFEB条件敲除小鼠中分离并且在常规培养基中培养的原代肝细胞在数个TFEB靶标基因的表达水平上没有显示显著差异。然而，虽然TFEB靶标基因的表达在来自用氯奎处理后的对照小鼠肝细胞中上调，但是这种上调在TFEB条件敲除小鼠的肝细胞中显著减弱(图21B)。相似地，对Torinl处理的转录反应在TFEB条件敲除小鼠的肝细胞中显著降低(图21C)。总之，这些结果指示了 TFEB在通过mTOR的溶酶体诱导的转录反应中起重要作用。
[0138]鉴定诱导胞质TFEB向核移动的其他激酶抑制剂
[0139]为了发现其他能诱导TFEB从胞质向核移位的小分子， 申请人:开发了基于使用稳定过量表达融合到绿色荧光蛋白的TFEB (TFEB-GFP)的HeLa细胞的高含量试验。在这个试验中，通过自动共焦显微镜(OPERA系统)获得处理细胞的图像，并且用Acapella图像软件分析这些图像以计算胞质和细胞核之间TFEB-GFP的平均荧光强度(详细见材料和方法)。为了验证所述试验，作者测试了 ERK抑制剂U0126和mTOR抑制剂雷帕霉素、torinl和torin2(图19C)。各抑制剂测试了 10个浓度。活化TFEB核移位的最有潜能的化合物是Torinl (EC50; 147.9nM)以及其类似物Torin 2 (EC50; 1666nM)。部分mTOR抑制剂雷帕霉素和ERK抑制剂U016的EC50分别是104.3 μ M和80.4 μ M(图19D)。使用Torinl作为参照化合物以筛选145个化合物的激酶抑制剂库(SC公司(SelleckChem) )。TFEB-GFP细胞在384孔板中接种，培养12h，并用各化合物范围是50 μ Μ-2.54ηΜ的10个不同浓度处理。在含各个化合物的RPMI培养基中37°C 3h后，细胞洗涤、固定，并用DAPI染色，并且使用共聚焦自动显微镜照相。作为4次运行的结果，使用Prism软件从剂量效应曲线中计算各化合物的EC50。活性化合物在表4中分组。所得结果清晰显示了活性化合物最富集的种类是PI3K-mT0R通路抑制剂(表1，黑体)，表明这个通路代表了调节TFEB从胞质向核移动中的主要作用物。除了这个种类， 申请人:发现选中了蛋白酪氨酸激酶受体抑制剂(EGFR、VEGFR、PDGFR.Met.1GFR,ALK)和参与细胞分裂的激酶抑制剂(CDK、极光和polo-样激酶)。其他代表性分类是P38激酶JAK2、JNK、GSK3、PKC和MAPK抑制剂(表4)。下表4中，“A”指EC50等于或小于7000nM的化合物；“B”指EC50大于7000但是小于或等于15000的化合物；“C”指EC50大于15000的化合物。
[0140]表4:诱导胞质TFEB向核移动的激酶抑制剂
[0141]l.PI3K_mT0R 通路 MC Mendoza 等，The Ras-ERK and PI3K_mT0Rpathways: cross-talk and compensation (“Ras-ERK 和 PI3K-mT0R 通路:交互作用和补偿，，)(2011) Trends in Biochemical Sciences36 (6): 320
[0142]`
【权利要求】
1.一种用于医学应用的TFEB磷酸化抑制剂。
2.如权利要求1所述的TFEB磷酸化抑制剂，其特征在于，所述抑制剂作用于TFEB磷酸化通路的激酶。
3.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是mTOR和/或PI3K。
4.如权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第I部分PI3K-mT0R通路中列举的化合物。
5.如权利要求1或2所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂作用于直接磷酸化TFEB分子的激酶。
6.如权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂抑制丝氨酸特异性胞外调节激酶(ERK)。
7.如权利要求6所述的抑制剂，其特征在于，所述ERK激酶是ERK2激酶。
8.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第2部分Ras-ERK通路中列举的化合物组。
9.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是促分裂原活化蛋白激酶。
10.如权利要求9所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第3部分促分裂原活化蛋白激酶中列举的化合物组。
11.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是极光激酶。
12.如权利要求11所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第4部分极光激酶中列举的化合物组。
13.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是受体酪氨酸激酶。
14.如权利要求13所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第5部分受体酪氨酸激酶中列举的化合物组。
15.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是Polo-样激酶。
16.如权利要求15所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂属于表4第6部分Polo-样激酶中列举的化合物组。
17.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶属于JAK-STAT通路。
18.如权利要求17所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第7部分JAK-STAT通路中列举的化合物组。
19.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是细胞周期蛋白依赖性激酶。
20.如权利要求19所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第8部分细胞周期蛋白依赖性激酶中列举的化合物组。
21.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶属于Wnt信号转导通路。
22.如权利要求21所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第9部分Wnt信号转导通路中列举的化合物组。
23.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶是Src家族激酶。
24.如权利要求23所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第10部分Src家族激酶中列举的化合物组。
25.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述激酶属于蛋白激酶C家族。
26.如权利要求25所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂属于表4第11部分蛋白激酶C家族中列举的化合物组。
27.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂用于治疗需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体系统的疾病。
28.如权利要求27所述的抑制剂用于治疗任意下列病症:溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
29.如权利要求28所述的抑制剂，其特征在于，所述溶酶体贮积症属于下组:激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积病、α -甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、高歇病(包含I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积病(包含婴儿型、晚婴型/青少年型、成年型/慢性)、1细胞疾病/黏脂沉积症II型、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(包含婴儿发病、迟发性)、异染性脑白质营养不良、假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积症IIIA型、MPS I型贺勒综合征、MPS I型施艾氏综合症、MPS I型贺勒氏-施艾氏综合征、MPS II型亨特综合征、A型沙费利波综合征/MPS IIIA型、B型沙费利波综合征/MPS IIIB型、A型莫奎欧氏症/MPS IVA型、B型莫奎欧氏症/MPS IVB型、MPS IX型透明质酸酶缺乏症、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积病(包含CLN6病、非典型晚婴型、迟发型变异、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏病/晚婴型CLN2/TPPl病、Kufs/成人发病型NCL/CLN4病、北方癫痫/异晚婴型CLN8和神经元蜡样脂褐质沉积症/婴儿型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷贮积病、庞培氏病/11型糖原贮积病、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病型/GM2神经节苷脂累积病、婴幼儿山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病、青少年山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、家族黑蒙 性白痴/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、多发性硫酸酯酶缺乏症。
30.如权利要求28所述的抑制剂，其特征在于，所述肝病属于下组:αI抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
31.如权利要求28所述的抑制剂，其特征在于，所述肌肉疾病属于下组:自体吞噬液泡肌病和过度自噬X连锁肌病。
32.如权利要求28所述的抑制剂，其特征在于，所述代谢疾病属于下组:高胆固醇血症和脂肪肝病。
33.如权利要求28所述的抑制剂，其特征在于，所述神经退行性疾病属于下组:阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特-雅各布病和脊髓性小脑萎缩症。
34.如权利要求1- 26中任一项所述的抑制剂在增加细胞生成内源或重组溶酶体酶中的应用。
35.一种生成溶酶体内源或重组酶的方法，所述方法包含:(1)使如权利要求1-26中任一项所述的抑制剂与细胞中自体吞噬/溶酶体系统接触；(2)诱导所述自体吞噬/溶酶体系统；和(3)增加所述溶酶体酶的产量。
36.一种通过给予对象治疗有效量的如权利要求1-26中任一项所述的抑制剂以治疗疾病的方法。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述疾病通过诱导细胞自体吞噬/溶酶体系统来缓解。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述疾病选自下组:溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是代谢疾病，其中所述代谢疾病是高胆固醇血症或脂肪肝病。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是神经退行性疾病，并且所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特-雅各布病或脊髓性小脑萎缩症。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是溶酶体贮积症，并且其中所述溶酶体疾病是:激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积病、α -甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、高歇病(包含I型、II型和III型)、GMl神经节苷脂沉积病(包含婴儿型、晚婴型/青少年型、成年型/慢性)、1细胞疾病/黏脂沉积症II型、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(包含婴儿发病、迟发性)、异染性脑白质营养不良、假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积症IIIA型、MPS I型贺勒综合征、MPS I型施艾氏综合症、MPS I型贺勒氏-施艾氏综合征、MPS II型亨特综合征、A型沙费利波综合征/MPS IIIA型、B型沙费利波综合征/MPS IIIB型、A型莫奎欧氏症/MPS IVA型、B型莫奎欧氏症/MPS IVB型、MPS IX型透明质酸酶缺乏症、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积病(包含CLN6病、非典型晚婴型、迟发型变异、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏病/晚婴型CLN2/TPP1病、Kufs/成人发病型NCL/CLN4病、北方癫痫/异晚婴型CLN8和神经元蜡样脂褐质沉积症/婴儿型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷贮积病、庞培氏病/11型糖原贮积病、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病型/GM2神经节苷脂累积病、婴幼儿山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病、青少年山霍 夫氏病/GM2神经节苷脂累积病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、多发性硫酸酯酶缺乏症。
42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是肝病，并且所述肝病是α?抗胰蛋白酶缺陷或脂肪肝病。
43.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是肌肉疾病，并且所述肌肉疾病是自体吞噬液泡肌病或过度自噬X连锁肌病。
44.一种治疗疾病的方法，所述方法包括如下步骤:(I)给予如权利要求1-26中任一项所述的抑制剂；(2)在细胞中诱导自体吞噬/溶酶体系统；和(3)增强细胞清除。
【文档编号】A61P3/00GK103458970SQ201280012191
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月7日 优先权日:2011年3月7日
【发明者】C·塞滕布里, A·巴拉比奥, D·L·梅迪纳萨纳巴里 申请人:泰莱托恩基金会