补体因子b类似物及其用途
【专利摘要】本发明提供包含补体因子B类似物的多肽。本发明还提供各种补体因子B类似物和相关方法、核酸和载体，所述各种补体因子B类似物包括包含游离半胱氨酸的突变的补体因子B类似物。这些补体因子B类似物和相关方法、核酸和载体可用于调节补体途径或用于研究和/或治疗与补体途径相关的各种状况或疾病。
【专利说明】补体因子B类似物及其用途
【背景技术】
[0001]补体系统是先天免疫和适应性免疫系统的组件(Volanakis，J.E.的综述，1998.第 2 章.In The Human Complement System in Health and Disease.由 J.E.Volanakis和Μ.M.Frank主编.Marcel Dekker, Inc., New York9_32页)。补体在微生物杀灭和免疫复合物的转运和清除方面起重要作用。补体系统的许多激活产物还与促炎症或免疫调节功能相关。所述补体系统由血浆和膜相关蛋白组成，所述膜相关蛋白以三种酶促激活级联来组织:经典途径、凝集素途径和替代途径(图1)。所有三种途径都可以导致终末补体复合物(TCC)和生物活性产物阵列的形成。
[0002]在某些情况下，补体激活通过特定的抗体识别以及与各种病原体和外源分子结合而启动，和/或通过补体蛋白与外源物质的直接相互作用而启动。一旦激活，这些途径引起蛋白酶复合物，C3-转化酶的形成。经典途径C3-转化酶(C4b2a)和替代途径C3-转化酶(C3bBb)都能够切割C3的α链，产生C3b。C3b具有与生物表面共价结合的潜力。C3b结合导致被多形核细胞和巨噬细胞吞噬的调理素作用。当可以获得另外的C3b时，C3-转化酶可以起C5-转化酶作用，切割C5，启动TCC的组装，或膜攻击复合物(MAC)的组装，所述膜攻击复合物通过将孔形成蛋白复合物插入靶细胞膜来介导细胞裂解。
[0003]在如图1A所示的经典途径中，Clq，第一组分(Cl)的胶原亚成分，与在免疫复合物内的免疫球蛋白结合，其相关的丝氨酸蛋白酶，Clr和Cls，被激活。该补体级联通过之后对C4和C2的切割、随后C3激活来启动。产生的C3b片段不仅充当调理素还以裂解途径导致膜攻击复合物(MAC)的形成。在先天性免疫中，被命名为甘露糖-结合凝集素(MBL)相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)的由识别分子(凝集素)和丝氨酸蛋白酶组成的复合物，在与微生物表面上的糖类结合时通过凝集素途径激活C4和C2。该结合在不存在免疫球蛋白时发生。在有颌脊椎动物中发现的凝集素途径的识别分子是MBL和纤维胶凝蛋白(ficolin)，它们的特征在于存在胶原样结构域(例如Clq)和对GIcNAc具有共同结合特异性的糖类结合结构域。MASPs和Clr/Cls共有相同的结构`域组织，并形成丝氨酸蛋白酶的亚家族。
[0004]先天性免疫中的凝集素补体途径与适应性免疫中的经典补体例如在它们的组分的结构和功能方面密切相关。两种途径通常通过由甘露糖-结合凝集素(MBL)相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)/Clr/Cls家族的胶原性蛋白和丝氨酸蛋白酶组成的复合物启动。据推测在进化上经典途径在凝集素途径之后出现。
[0005]如图1B中所示，替代补体途径的激活，通常在C3b蛋白(或C3i)与细胞和例如微生物表面等其它表面的组分结合时开始。C3b还能够与免疫球蛋白G(IgG)抗体结合。然后替代途径因子B蛋白与C3b蛋白结合，从而形成C3bB。之后因子D蛋白将结合的因子B蛋白分割成Bb和Ba片段，形成C3bBb。然后备解素与Bb结合从而形成C3bBbP，所述C3bBbP起能够将通常数以百计的C3分子酶促分割成C3a和C3b的C3转化酶的作用。一些C3b然后与一些C3bBb结合从而形成C3bBbC3b，该C3bBbC3b是能够将C5分子分割成C5a和C5b的C5转化酶。
[0006]由于C3b在血浆中是游离的，其能够与宿主细胞或病原体表面结合。为了防止补体激活在宿主细胞上进行，存在破坏补体激活过程的数种不同的调节性蛋白。补体受体I (CRl或⑶35)和DAF(也称为⑶55)与因子B竞争与细胞表面上C3b的结合，并且甚至能够从已形成的C3bBb复合物中除去Bb。当被称为因子I的血浆蛋白酶将C3b切割成其失活形式iC3b时，还可以防止C3转化酶的形成。因子I与诸如CRl和蛋白水解的膜辅因子(MCP或CD46)等C3b结合蛋白辅因子一起作用。另一补体调节性蛋白是因子H，其与因子B进行竞争，从蛋白酶中替换Bb，充当因子I的辅因子，或者优先与结合至脊椎动物细胞的C3b结合。
[0007]补体系统的精密功能依赖于其调节，因为补体级联的激活导致许多促成炎症的蛋白的产生。当有助于宿主防御时这是有益的，但是如果在自身组织上激活则是有害的。通常，血液中C3的激活保持在低水平，并且C3b沉积限制在病原体的表面。
[0008]人野生型补体因子B蛋白是由5个蛋白结构域组成的764个氨基酸的单链糖蛋白(约 93-kDa) (Mole 等，1984The J.Biol Chem, 259: 6，3407-3412)。人野生型补体因子 B蛋白(fB)通常与N-末端25个氨基酸的信号肽一起表达，例如参见SEQ ID NO:1。人野生型补体因子B蛋白的氨基末端区(Ba)主要由三个短共有重复组成。中间区域是与冯.维勒布兰德因子(von Willebrand factor)中发现的结构域相似的A型结构域(Colombatti等，Blood(1991)77(ll):2305-15)。羧基末端是丝氨酸蛋白酶(SP)结构域(Perkins和Smith, Biochem J.(1993) 295 (Ptl): 109-14; Hourcade 等，JBC (1998) 273 (40): 25996-6000;Hourcade 等，J Immunol.(1999) 162 (5): 2906-11; Xu 等，J BiolChem.2000275 (I): 378-85;Milder 等.Nat Struct Mol Biol (2007) 14 (3):224—8)。
[0009]补体因子B类似物及其用于抑制补体和治疗补体介导的疾病的用途描述于PCT第W008/106644号公开和美国专利US20100120665号公开中。例如，人补体因子B蛋白类似物，hfB3 (描述于美国专利20100120665号公开)，是有效地抑制替代补体(AP)活性的显性负向人因子B蛋白变体。hfB 3蛋白(SEQ ID NO:4)与人野生型因子B蛋白(SEQ ID NO:1)相比具有5个氨基酸改变。所述5个氨基酸改变使hfB3蛋白与野生型因子B蛋白相比能够⑴与C3b蛋白更紧密地结合，(ii)抵抗因子D蛋白的C3b依赖性切割，和(iii)与因子D蛋白更紧密地结合。hfB3蛋白与C3b蛋白和因子D蛋白的更紧密结合，封合在失活C3转化酶(hfB3)中的替代补体途径(ACP)的两个必需组分，阻断AP活性。由于C3b-结合的hfB3蛋白不能被因子D蛋白切割，不发生hfB3蛋白的构象变化，并且不激活hfB3蛋白的C末端处的丝氨酸蛋白酶。
[0010]人野生型补体因子B蛋白和hfB3都含有23个半胱氨酸。它们的“活性”形式使所有的半胱氨酸与其它半胱氨酸中的一个形成二硫键，例外是对应于SEQ ID NO:1的C292的半胱氨酸。hfB3和野生型因子B的“活性形式”的C292是游离半胱氨酸(Parkes等，1983Biochem J.213，201-209)，并且在各种哺乳动物物种中高度保守，例如参见以下表1。
[0011]本文参考文献的引用或讨论不应解释为承认它们是本发明的现有技术。
【发明内容】
[0012]本发明提供包含补体因子B类似物的多肽。本发明还提供各种补体因子B类似物。在某些实施方式中，补体因子B类似物包含游离半胱氨酸的突变。本发明还提供包含编码本发明的多肽和补体因子B蛋白类似物的核苷酸序列的核酸和病毒载体。本发明的某些实施方式提供细胞，其中所述细胞包含编码本发明的补体因子B蛋白类似物的核酸，并且其中所述细胞表达补体因子B蛋白类似物。
[0013]另外，本发明提供药物制品，所述药物制品包含本发明的多肽或补体因子B蛋白类似物、本发明的核酸、本发明的病毒载体或者它们的任意组合。
[0014]本发明还提供的是治疗补体介导的疾病的方法，所述方法包含对患者施用本发明的药物制品，本发明的多肽、本发明的补体因子B蛋白类似物、本发明的核酸、本发明的病毒载体或者它们的任意组合。
[0015]本发明还提供生产包含补体因子B蛋白类似物的多肽的方法，所述方法包括:在细胞中表达本发明的补体因子B蛋白类似物，和纯化所述补体因子B蛋白类似物。
[0016]本发明的多肽、本发明的补体因子B类似物、编码它们的核酸和载体能够用于调节补体途径，并且用于研究和/或治疗各种与补体途径相关的状况或疾病。
[0017]本发明基于以下发现:游离半胱氨酸的突变或去除(i)提高了活性和/或正确折叠的补体因子B蛋白类似物的产量(例如参见实施例9和10) ；(ii)增强了补体因子B蛋白类似物的热稳定性(例如参见实施例13和14);和/或(iii)减少了补体因子B蛋白类似物的聚集(例如参见实施例6)。[0018]该
【发明内容】
不必描述本发明的所有特征或必需特征。本发明还可以在于所述特征的亚组合。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了说明本发明的目的，在附图中描述了本发明的一些实施方式。但是，本发明不限于附图中所述实施方式的精确排列和手段。
[0020]图1A描述了经典补体途径和凝集素补体途径。经典途径是通过Cl启动，而凝集素途径通过甘露糖结合凝集素(MBL)启动。C4bC2a是将C3切割成C3a和C3b的蛋白酶，被称为C3转化酶。类似地，C4bC2aC3b将C5切割成C5a和C5b，被称为C5转化酶。C3a、C4a和C5a具有炎症性质，并且吸引吞噬细胞。C5b6-9形成膜攻击复合物(MAC)，其创造了不仅杀死感染源而且能够损害宿主细胞的膜孔。MASP是甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶。
[0021]图1B描述了替代补体途径。该途径通过C3的自发性切割而具有低水平的组成性活性。在存在适当表面时，C3b与补体因子B (fB)结合。该复合物然后被补体因子D (fD)切害I]，从而产生C3bBb。数分钟内该复合物的自发性解离(“衰变”)导致其失活，而备解素发挥的稳定化作用产生了切割C3的复合物，即，C3转化酶。数种减弱补体途径的因子通过促进C3和C5转化酶的衰变而减弱补体途径。C3b参与C3转化酶，以产生另外的C3b，由此如大箭头所示形成正反馈环。C3bBb是C3转化酶。C3bBbC3b是C5转化酶。
[0022]图2是hfB3_292S表达构建体。CMV-巨细胞病毒即早期启动子；IRES_内部核糖体进入位点；Neo-新霉素磷酸转移酶基因；SynPolyA-合成polyA ；Amp-氨节青霉素-抗性基因。SEQ ID N0:8是图2中所示的hfB3-292S表达构建体的核苷酸序列。
[0023]图3显示在细胞培养温育72小时(2xl06细胞/mL)后含有hfB3或hfB3_292S蛋白的粗细胞培养物上清液的蛋白质印迹分析。泳道1，充当阴性对照的、来自初始未转染的293FreeStyle细胞的I μ I细胞培养基；泳道2，充当阳性对照的、由血浆纯化的IOOng人野生型因子B (Quidel, Santa Clara, CA);泳道3，来自hfB3产生细胞的I μ I细胞培养基；泳道4，来自hfB3-292S产生细胞的1μ I细胞培养基。右侧示出以KDa为单位的分子量标记。
[0024]图4显示溶血性检测的结果。该结果证明了人替代补体途径溶血活性被粗hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白生产细胞培养基抑制。相对溶血活性通过因人替代补体途径活性而在rRBC溶血后释放出的血红蛋白进行评分。从左到右的X轴:补充有Oyg纯化人因子B蛋白的因子B-耗尽的人血清(对照，没有rRBC的裂解)；在每个反应中补充有0.5yg纯化人因子B蛋白和1.0μ g、0.5μ g、0.25μ g或0.125μ g的hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的混合物的因子B-耗尽的人血清，如上所述，所述hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白来自产生hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的细胞的培养基。注意:100%抑制表示没有rRBC的裂解。Y轴表示平均0D405和标准偏差(SD)。 [0025]图5A显示从三步色谱过程纯化、进行SDS-PAGE和银染色分析的hfB3蛋白(200ng)。图5B显示了人替代补体途径溶血活性被纯化hfB3蛋白抑制。从左到右的X轴:补充有Oyg纯化野生型人因子B蛋白(wt hfB)的因子B蛋白-耗尽的人血清(对照，没有rRBC的裂解)；在每个反应中补充有0.5 μ g纯化野生型人因子B蛋白和1.0 μ g、0.5 μ g、
0.3 μ g、0.2 μ g、0.1 μ g或0.05 μ g的如上所述的hfB3的混合物的因子B蛋白-耗尽的人血清。100%抑制表示没有rRBC的裂解。Y轴表示平均0D405和SD。
[0026]图6显示两种hfB3蛋白群体的生物活性。所显示的是来自峰I和峰II的疏水相互作用色谱(HIC)纯化的hfB3蛋白抑制人替代补体途径溶血活性的结果。从左到右的X轴:补充有Oyg纯化人因子B蛋白的因子B蛋白-耗尽的人血清(对照，没有rRBC的裂解)；在每个反应中补充有0.5 μ g纯化野生型人因子B蛋白和范围为1.0~0.05 μ g的各种量的hfB3蛋白的混合物的因子B蛋白-耗尽的人血清。100%抑制表示没有rRBC的裂解。Y轴表示平均0D405和SD。
[0027]图7显示在组织培养温育72小时(2xl06细胞/mL)后，含有hfB3蛋白或hfB3_292S
蛋白的粗细胞培养上清液的反相高压液相色谱(HPLC) Λ)将来自hfB3产生细胞(.........)，
hfB3-292S蛋白产生细胞(_)和初始293细胞(_)的上清液施加到Agilent
HPl IOOHPLC系统，所述系统使用使用窄孔Jupiter?C4柱(Phenomenex)，并用50分钟的含有0.1%TFA的水/乙腈(25%~70%乙腈)梯度液洗脱。用PDA检测器在215nm监视洗脱。还示出在所有三种样品中存在的热休克70蛋白(HSP70)的位置。B)图7A中显示的色谱的放大区，聚焦于含有hfB3蛋白的峰I和II以及含有包含hfB3-292S蛋白的峰的区域(25分钟~29分钟)。
[0028]图8显示hfB3_Fc蛋白表达的分析，该分析通过使含有hfB3_Fc蛋白的2μ I的细胞培养上清液进行非还原SDS-PAGE和蛋白印迹分析而进行(参见实施例12)。用左侧所示的以KDa为单位的分子量检测hfB3-Fc蛋白的两条带。
[0029]图9显示了小鼠的右前爪关节的石蜡切片的代表性H&E染色，所述小鼠来自如实施例16中所述的、就类风湿性关节炎在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)小鼠模型中测试hfB3-292S的研究。第I组是不接受胶原抗体鸡尾酒的载剂对照组。第2组是接受胶原抗体鸡尾酒的未处理组。第3组是接受胶原抗体鸡尾酒并用hfB3-292S处理的处理组。
[0030]图10显示来自如实施例16中所述的、就类风湿性关节炎在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)小鼠模型中测试hfB3-292S的研究中的关节肿胀测定。如该段落所述，这些组与图8中的组相同。与未处理组(第2组)相比，hfB3-292S引起具有统计学显著性(p< 0.0003)的关节肿胀的减少。
[0031]图11显示来自转染有hfB3_292SN480表达构建体的细胞的细胞培养基的蛋白印迹分析。该蛋白印迹分析使用对hfB3-292S具有特异性的单克隆抗体进行。左泳道含有hfB3-292S，右泳道是来自转染有hfB3-292SN480表达构建体的细胞的细胞培养基。该分析检测了来自hfB3-292SN480细胞系的细胞培养基的约55KDa的条带(右泳道)。
[0032]图12显示来自转染如以下实施例19所述的有hfB3-292S/Fc_mono表达构建体的细胞的细胞培养基的蛋白印迹分析。通过来自该非还原SDS-PAGE的纯化的山羊抗人因子B抗体来检测约115KDa的条带。
[0033]图13显示来自表达hfB3_292SN480的细胞的细胞培养上清液以剂量依赖性方式抑制了人替代补体途径溶血活性。
[0034]图14显示来自表达hfB3-292S/FC-m0n0的细胞的细胞培养上清液以剂量依赖性方式抑制了人替代补体途径溶血活性。
[0035]序列说明
[0036]SEQ ID NO: 1-野生型人补体因子B的氨基酸序列。
[0037]SEQ ID NO:2-人补体因子B蛋白类似物hfB3_292S的氨基酸序列，其包含以下突变:K258A、R259A、K260A、D279G、N285D 和 C292S。
[0038]SEQ ID N O: 3 -人补体因子B类似物hfB3_292S_740N的氨基酸序列，相对于SEQID NO:1 其包含以下突变:K258A、R259A、K260A、D279G、N285D、D740N 和 C292S。
[0039]SEQ ID NO:4-人补体因子B类似物hfB3的氨基酸序列，相对于SEQ ID NO:1其包含以下突变:K258A、R259A、K260A、D279G 和 N285D。
[0040]SEQ ID NO: 5- hfB3表达构建体的核苷酸序列，其构建如实施例1所述。
[0041]SEQ ID NO:6-7 -定点诱变的引物。
[0042]SEQ ID NO:8 - hfB3_292S表达构建体的核苷酸序列，其构建如实施例2所述。
[0043]SEQ ID NO:9-14-分别来自人、小鼠、大鼠、猪、猴和绵羊的补体因子B蛋白的部分
氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO: 15-16 -定点诱变的引物。
[0045]SEQ ID NO: 17 -人补体因子B蛋白类似物hfB4的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO: 18 - hfB3_Fc表达构建体的核苷酸序列，其构建如实施例12所述。
[0047]SEQ ID NO: 19-20 -定点诱变的引物。
[0048]SEQ ID N0:21 -人补体因子B蛋白类似物hfB3_Fc的氨基酸序列。
[0049]SEQ ID NO:22 -人补体因子B蛋白类似物hfB3_292S_Fc的氨基酸序列。
[0050]SEQ ID NO: 23 -人补体因子B蛋白类似物hfB3-292S-740N_Fc的氨基酸序列。
[0051]SEQ ID NO: 24-用于表达hfB3_292SN480的表达构建体的核苷酸序列。
[0052]SEQ ID NO:25 -用于hfB3-292S/Fc_mono的核苷酸序列基因表达构建体。
[0053]SEQ ID NO:26 - hfB3-292S/Fc_mono 的氨基酸序列。
[0054]SEQ ID NO:27_Fc结构域的氨基酸序列。
【具体实施方式】[0055]除非另外指出，本发明的实施会使用作为本领域技术人员技能的细胞生物学、分子生物学、细胞培养和病毒学等的常规技术。这些技术在本文和/或现有文献中完全公开，例如 Sambrook, Fritsch 和 Maniatis eds.，"Molecular Cloning, A Laboratory Manual",第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Celis J.E."Cell Biology, ALaboratory Handbook^Academic Press,Inc.(1994)和 Bahnson 等,J.0f Virol.Methods, 54:131-143(1995)。
[0056]设想本文所述的任何方法、制品或组合物可以相对于本文所述的任何其它方法、制品或组合物执行。当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，单词“一种(a)”或“一个(an)”等的使用可以表示一种(个)，但其可以与“一种或多种”、“至少一种”和“一个或多于一个”的意思一致。在与列表一起使用时术语/词组“和/或”表示可以使用所列举项目中的一种或多种，例如，其不限于所述要素中的一个或全部。
[0057]在称为hfB3的补体因子B蛋白类似物(SEQ ID NO:4)的生产和纯化过程中，检测了两种补体因子B蛋白类似物的群体。例如参见图6和图7，一个群体具有补体因子B蛋白类似物的所需活性(峰I)，而另一群体具有实质上较低的所需活性(峰II)。来自两个群体的表征的结果表明，两个群体在其二硫键模式上是不同的。当将游离半胱氨酸(SEQ IDN0:4的292位)突变成丝氨酸时，未检测到峰II。图6显示:峰II级分展示了抑制补体/溶血活性的一定能力，但是与峰I级分相比每Ug蛋白的所述能力低得多。可能通过峰II表现出的补体/溶血抑制活性主要或仅是峰II包含一些具有在292位的游离半胱氨酸的hfB3的结果，这可能是未完全相互分离的峰I和峰II的结果。
[0058]对应于SEQ ID NO:1的292位的半胱氨酸在不同哺乳动物物种的补体因子B蛋白中是高度保守的(例如参见表1)。高度保守序列通常对于蛋白的功能是重要的。“分子进化的中性学说论述了氨基酸的突变以随机恒定方式发生，只要所述突变对基因产物的功能没有影响即可[Kimura M:The neutral theory of molecular evolution.SciAml979, 241 (5):98-100, 102，108各章节]。另一方面，对于蛋白质功能和结构重要的氨基酸在不对蛋白活性造成有害影响的情况下不能突变。因此，在给定蛋白家族中这些氨基酸在进化过程中会非常缓慢地变化。“(``Liu等.BMC Bioinformatics2006, 7:37)
[0059]表1.补体因子B蛋白中的保守性半胱氨酸
[0060]
【权利要求】
1.一种多肽，所述多肽包含补体因子B蛋白类似物，其中，所述补体因子B类似物包含游离半胱氨酸的突变。
2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述突变包含所述游离半胱氨酸的取代。
3.如权利要求2所述的多肽，其中，所述游离半胱氨酸被多于一个的氨基酸取代。
4.如权利要求1所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物是SEQID N0:4的类似物，所述补体因子B蛋白类似物具有形成二硫键的半胱氨酸，并且游离半胱氨酸已经被另一种氨基酸取代。
5.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述游离半胱氨酸被选自由丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组中的氨基酸取代。
6.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，人补体因子B类似物与天然补体因子B的结合相竞争。
7.如权利要求1所述的多肽，其中，所述突变包含所述游离半胱氨酸的缺失。
8.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物是人补体因子B蛋白类似物。
9.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述游离半胱氨酸对应于SEQID NO:1的292位氨基酸。
10.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的突变的至少一个突变，所述SEQ ID NO:1的突变选自由K258A、R259A、K260A、D279G、N285D 和 D740N 组成的组。
11.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含对应于 SEQ ID NO:1 的 K258A、R259A、K260A、D279G 和 N285D 的突变。
12.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的D740N的突变。
13.如权利要求1所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含SEQID NO:2的26~480位氨基酸。
14.如权利要求1所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物不包含SEQID NO:2的481~764位氨基酸。
15.如权利要求1~9中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物与相应的天然补体因子B蛋白相比具有升高的C3b结合亲和性，并且所述补体因子B蛋白类似物包含: (i)与相应的天然补体因子B蛋白相比降低的蛋白酶活性； (?)与相应的天然补体因子B蛋白相比降低的被因子D蛋白切割的能力；或 (iii)与相应的天然补体因子B蛋白相比降低的蛋白酶活性和与相应的天然补体因子B蛋白相比降低的被因子D蛋白切割的能力。
16.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含在所述C3b结合域中的突变，并且所述补体因子B蛋白类似物与相应的天然补体因子B蛋白对C3b的结合亲和性相比展示了升高的对C3b的结合亲和性。
17.如权利要求16所述的多肽，其中，在所述C3b结合域中的突变包括:(i)与SEQ ID NO:1的279位氨基酸对应的天冬氨酸的取代或缺失，和/或与SEQ IDNO:1的285位氨基酸对应的天冬酰胺的取代或缺失；或 (?)紧邻所述天冬氨酸或所述天冬酰胺的至少一个氨基酸的插入。
18.如权利要求17所述的多肽，其中，所述天冬氨酸和/或所述天冬酰胺被一个或多个氨基酸取代。
19.如权利要求17或18所述的多肽，其中，所述天冬氨酸被甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺取代。
20.如权利要求17、18或19所述的多肽，其中，所述天冬酰胺被甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸取代。
21.如权利要求17所述的多肽，其中，所述取代包括将所述天冬氨酸替换为甘氨酸，和将所述天冬酰胺替换为天冬氨酸。
22.如权利要求15所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包括所述补体因子D切割位点中的改变，其中所述改变减少或消除了因子D蛋白对所述补体因子B蛋白类似物的切割。
23.如权利要求22所述的多肽，其中，所述因子D切割位点中的改变包括: (i)与SEQ ID NO:1 的259位氨基酸对应的精氨酸的取代或缺失，与SEQ ID NO:1的258位或260位氨基酸对应的一个或两个赖氨酸的取代或缺失，或者所述精氨酸和两个赖氨酸的取代或缺失；或 (?)紧邻所述精氨酸、紧邻所述一个或两个赖氨酸或者紧邻所述精氨酸和一个或两个所述赖氨酸的插入。
24.如权利要求23所述的多肽，其中，与SEQID NO:1的258~260位氨基酸对应的所述氨基酸各自被丙氨酸替换。
25.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含丝氨酸蛋白酶结构域的活性位点中的突变，其中与相应的天然补体因子B蛋白相比，所述突变降低或消除了所述补体因子B蛋白类似物切割补体因子C3的能力。
26.如权利要求25所述的多肽，其中，所述突变包含与SEQID NO:1的740位氨基酸对应的天冬氨酸的缺失或取代。
27.如权利要求26所述的多肽，其中，与SEQID NO:1的740位氨基酸对应的所述天冬氨酸被丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸或谷氨酸取代。
28.如权利要求26所述的多肽，其中，所述取代包括用天冬酰胺取代所述天冬氨酸。
29.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述人补体因子B蛋白类似物与SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 或 SEQ ID NO:26 具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性。
30.如权利要求1~28中任一项所述的多肽，其中，所述人补体因子B蛋白类似物与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 的 26 ~764 位氨基酸具有至少 90%、至少 95%、至少98%或至少99%的同一性；与SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23的26~990位氨基酸具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性；与SEQ ID NO: 2的26~480位氨基酸具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性；或者与SEQ ID NO: 26的26~1003位氨基酸具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性。
31.如权利要求1所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含SEQID N0:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26，或者包含 SEQ ID N0:2的 I~480位氨基酸。
32.如权利要求1所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物包含SEQID NO:2的26~764位氨基酸、SEQ ID NO: 3的26~764位氨基酸、SEQ ID NO: 2的26~480位氨基酸、SEQ ID NO:22的26~990位氨基酸、SEQ ID NO:23的26~990位氨基酸或SEQ IDNO:26的26~1009位氨基酸。
33.如权利要求1所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物基本上由SEQID NO:2的26~764位氨基酸、SEQ ID NO: 3的26~764位氨基酸、SEQ ID NO: 2的26~480位氨基酸、SEQ ID NO:22的26~990位氨基酸、SEQ ID NO:23的26~990位氨基酸或SEQ IDNO:26的26~1009位氨基酸组成。
34.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽包含免疫球蛋白Fe结构域。
35.如权利要求34所述的多肽，其中，所述Fe结构域在所述补体因子B类似物的C末端。
36.如权利要求34或35所述的多肽，其中，所述Fe结构域在所述Fe结构域序列中具有一个或多个半胱氨酸突变，其中一个或多个所述的突变抑制二聚体的形成。
37.如权利要求34~36中任一项所述的多肽，其中，Fe结构域包含与SEQID NO:27的17或20位氨基酸对应的一个或多个半胱氨酸的突变。
38.如权利要求36~37中任一项所述的多肽,其中,所述一个或多个半胱氨酸被选自由组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组的氨基酸取代。
39.如权利要求34或35所述的多肽，其中，所述Fe结构域包含选自由SEQID NO: 21的766~990位氨基酸、SEQ ID NO:26的766~1003位氨基酸、SEQ ID NO:26的786~1003位氨基酸、SEQ ID NO:27的I~238位氨基酸组成的组的氨基酸序列。
40.如权利要求1~3或34~39中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物的氨基酸序列对应于补体因子B的片段。
41.如权利要求40所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含与因子B的N末端截短对应的截短。
42.如权利要求40或41所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含与因子B的C末端截短对应的截短。
43.如权利要求42所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含C-末端截短，所述C-末端截短对应于在以下氨基酸C末端的截短:与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4 的 407、427、457、477、480、484、487、507 或 527 位氨基酸对应的氨基酸。
44.如权利要求42所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含截短，所述截短对应于位于以下氨基酸处的C末端的截短:与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的407~487、470~495或477~487位氨基酸对应的氨基酸之间的氨基酸。
45.如权利要求40~42中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物不包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:4 的 408 ~764、428 ~764、458 ~764、478 ~.764,481~764、485~764、488~764、508~764、528~764位氨基酸对应的氨基酸。
46.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含对应于与衰变加速因子相互作用的补体因子B中的氨基酸的氨基酸突变。
47.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含与SEQIDNO:1的290、291、323、363、364或407位氨基酸对应的氨基酸的一个或多个突变。
48.如权利要求47所述的多肽，其中，所述一个或多个突变是取代或缺失。
49.如权利要求48所述的多肽，其中，所述一个或多个突变对应于SEQID ΝΟ:1的K290A、K291A、K323E、Y363A、S364A 或 D407N 中的一个或多个。
50.如权利要求49所述的多肽，其中，所述补体因子B类似物包含以下突变组合中的一种，所述突变组合对应于 SEQ ID NO:1 的 K290A/K291A、Y363A/S364A 或 K290A/K291A/Y363A/S364A。
51.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述补体因子B蛋白类似物相对于总蛋白的纯度为至少90%、至少93%、至少95%、至少98%、至少99.5%或至少99.9%。
52.如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽抑制或降低补体活性。
53.如权利要求52所述的多肽，其中，所述多肽抑制替代补体途径。
54.一种核酸，所述核酸包含编码前述权利要求中任一项所述的多肽的核苷酸序列。
55.—种病毒载体,所述病毒载体包含权利要求54所述的核酸。
56.如权利要求55所述的病毒载体,其中,所述病毒载体选自由逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、疱疫病毒载体、肝炎病毒载体、SV40病毒载体、AAV载体、EBV载体和NDV载体组成的组。
57.如权利要求56所述的病毒载体，其中，所述慢病毒载体是BIV、HIV、EIAV,SIV或FIV载体。
58.如权利要求57所述的病毒载体，其中，所述病毒载体包含衰变加速因子。
59.一种药物制品，所述药物制品包含权利要求1~53中任一项所述的多肽、权利要求54所述的核酸、权利要求55~58中任一项所述的病毒载体或它们的任何组合。
60.如权利要求59所述的药物制品，所述药物制品包含选自由组氨酸、MgCl2、海藻糖、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20、蔗糖、精氨酸和脯氨酸组成的组中的至少一种成分。
61.—种抑制补体活性的方法，其中，所述方法包括: 将权利要求1~53中任一项所述的多肽、权利要求54所述的核酸、权利要求55~58中任一项所述的病毒载体、权利要求59~60中任一项所述的药物组合物或它们的任何组合以足以抑制所述补体活性的量引入或施用至所述补体活性的位点，其中所述多肽抑制所述补体活性。
62.如权利要求61所述的方法，所述方法包括对患者施用所述多肽、所述核酸、所述病毒载体、所述药物组合物或它们的任何组合。
63.如权利要求61或62所述的方法，其中，所述多肽与天然补体因子B竞争结合。
64.一种治疗患者中补体介导的疾病的方法，所述方法包括权利要求62或63所述的方法。
65.如权利要求64所述的方法，其中，所述补体介导的疾病是眼的疾病。
66.如权利要求65所述的方法，其中，对所述眼施用所述药物组合物。
67.如权利要求66所述的方法，其中，所述药物组合物通过玻璃体内注射、视网膜下注射、注射至眼的前房内、注射或局部施用至角膜、结膜下注射、眼球囊下注射进行施用，或通过滴眼剂进行施用。
68.如权利要求64~67中任一项所述的方法，其中，所述补体介导的疾病是黄斑变性、年龄相关的黄斑变性(AMD)、地图状萎缩、湿性AMD、心肌梗死、干性AMD、玻璃疣形成、关节炎、中风、缺血再灌注损伤、糖尿病性视网膜病、玻璃体视网膜病变、外伤性器官损伤、角膜炎症、角膜新生血管形成、葡萄膜炎、高眼压症或青光眼。
69.如权利要求64~67中任一项所述的方法，其中，所述补体介导的疾病选自由以下疾病组成的组:动脉粥样硬化、气道高反应、免疫相关疾病、自体免疫相关疾病、狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、关节炎、风湿性疾病、抗磷脂抗体综合征、肠和肾I/R损伤、哮喘、非典型溶血尿毒综合征、II型膜性增生性肾小球肾炎、非增生性肾小球肾炎、胎儿丢失、脑损伤、创伤后器官损伤、心肌梗死后器官损伤、血管炎、遗传性血管性水肿、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脑血管意外、阿尔茨海默氏病、移植排斥、感染、败血症、败血性休克、干燥综合症、重症肌无力、抗体介导的皮肤病、I型和II型糖尿病、胰岛素抵抗综合征、妊娠糖尿病、甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血、神经病变、多发性硬化、心肺旁路损伤、结节性多动脉炎、过敏性紫癜、血清病、古德帕斯彻病、系统性坏死性血管炎、链球菌感染后肾小球肾炎、特发性肺纤维化、膜性肾小球肾炎、急性休克肺综合征、成人型呼吸窘迫综合征和再灌注。
70.如权利要求64~69中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在施用所述药物组合物之前、同时或之后对患者施用补体抑制因子或抗血管生成因子。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述补体抑制因子选自由因子H、因子H样1、MCP、DAF、或MCP的可溶形式组成的组。
72.如权利要求70或71所述的方法，其中，所述抗血管生成因子选自由内皮抑素、VEGF结合分子、PEDF, T2-TrpRS、sFLT、阿柏西普和激肽原汀组成的组。
73.如权利要求64~72中任`一项所述的方法，其中，在施用所述药物组合物之前、同时或之后施用消炎药。
74.如权利要求73所述的方法，其中，所述消炎药 (i)与所述药物组合物同时施用；或 (?)所述药物组合物含所述消炎药。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中，对所述眼施用所述消炎药。
76.如权利要求73、74或75所述的方法，其中，所述消炎药选自由以下药物组成的组:地塞米松、地塞米松间磺基苯甲酸钠、地塞米松磷酸钠、氟米龙、溴芬酸、普拉洛芬、环孢菌素眼用乳剂、萘普生、糖皮质激素、酮咯酸、布洛芬、托美汀、非留体消炎药、留体消炎药、双氯芬酸、氟比洛芬、吲哚美辛和舒洛芬。
77.如权利要求62~64中任一项所述的方法，其中，大约每I个周、每I个月、每2个月、每3个月、每6个月、每9个月、每I年、每18个月、每2年、每30个月、每3年、每5年或每10年施用一次包含所述病毒载体的所述药物制品。
78.如权利要求64~77中任一项所述的方法，其中，在施用所述药物组合物之前、同时或之后施用抑制补体活性、T细胞活性、B细胞、肿瘤坏死因子(TNF)、雌激素、白介素-1或干扰素Y的化合物。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述化合物选自由英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、依那西普、阿巴西普和利妥昔单抗组成的组。
80.如权利要求62~64中任一项所述的方法，其中对所述患者仅施用一次包含所述病毒载体的所述药物制品。
81.一种细胞，所述细胞包含权利要求54所述的核酸，其中所述细胞表达所述多肽。
82.如权利要求81所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
83.如权利要求81所述的细胞，其中，所述细胞选自由293细胞、CHO细胞、PerC6细胞、或Vero细胞组成的组。
84.如权利要求81所述的细胞,其中,所述细胞是原核细胞。
85.如权利要求81所述的细胞，其中，所述细胞是大肠杆菌细胞。
86.—种生产包含补体因子B蛋白类似物的多肽的方法，所述方法包括: a.在细胞中表达权利要求1~53中任一项所述的多肽；和 b.纯化所述多肽。
【文档编号】A61K39/395GK103561765SQ201280021957
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月4日 优先权日:2011年5月5日
【发明者】陈昶宏, 迈克尔·卡尔考, 李蓓蓓, 罗天赐, J·A·米勒, 王瑞工 申请人:沃尔斯塔特免疫疗法公司