免疫诱导剂的制作方法
【专利摘要】提供了作为癌的治疗剂和/或预防剂等有用的新颖的免疫诱导剂。所述免疫诱导剂含有选自以下(a)、(b)和(c)的多肽类且具有免疫诱导活性的至少一种多肽、或包含编码该多肽的多核苷酸且在活体内能表达该多肽的重组载体作为有效成分，即，(a)包含序列表中序列号4、2、8、10、12所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸的多肽，(b)与上述(a)的多肽具有85％以上的序列同一性、且包含7个以上氨基酸的多肽，和(c)包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列的多肽。
【专利说明】免疫诱导剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及作为癌的治疗剂和/或预防剂等有用的新颖的免疫诱导剂。
【背景技术】
[0002]癌症是占全部死亡原因的第一位的疾病，当前所实施的治疗主要是手术疗法，其与放射线疗法和化学疗法联合实施。尽管近年来开发了新的手术法和发现了新的抗癌剂，但是现状是，除了一部分癌之外，癌的治疗成绩仍未改善。近年来，随着分子生物学和癌免疫学的发展，已经鉴定了对癌起反应的细胞毒T细胞所识别的癌抗原和编码癌抗原的基因，并且对抗原特异性免疫疗法的期望提高。
[0003]在免疫疗法中，为了减轻副作用，需要作为其抗原被识别的肽或蛋白质基本上不存在于正常细胞、但特异地存在于癌细胞。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等人通过使用自身癌细胞株和癌反应性T细胞的cDNA表达克隆法，分离了 CD8阳性T细胞识别的人黑素瘤抗原MAGEl (非专利文献I)。此后，报导了采用基因表达克隆法鉴定由抗体识别的肿瘤抗原的SEREX(通过重组表达克隆法对抗原的血清学鉴定)法，其中所述的抗体是癌患者身体内对自身癌反应而产生的抗体(专利文献1、非专利文献2)，根据该方法分离了若干癌抗原。此外，已经开始了靶向一部分所述癌抗原的癌免疫疗法的临床试验。
[0004]另一方面，如同人的情况，犬和猫也已知会患乳腺肿瘤、扁平上皮癌等多种肿瘤，并且犬和猫在疾病统计中也是排名靠前。但是，当前没有用于犬或猫的癌的有效治疗剂、预防剂和诊断剂。大部分犬或猫的肿瘤是，肿瘤在进行、大部分情形是饲养主直至肿瘤变大才注意到，通过医院外科手术切除肿瘤，即使施用人用药物(抗癌剂等)也已为时过晚，多数在处置后不久死亡。在这样的现状下，如果对犬或猫有效的癌治疗剂和预防剂是可获得的，则可以期待其应用于犬癌症。
[0005]剑蛋白p60亚基A样I (KATNAL1)鉴定为具有微小管结合结构域的蛋白质(专利文献2、非专利文献3)。但是，还没有报导KATNAL1蛋白对癌细胞具有免疫诱导活性，由此该蛋白质对于癌的治疗和预防是有用的。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:美国专利第5698396号
[0009]专利文献2:特开2004 — 8216号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Bruggen P.等人，Science, 254:1643-1647 (1991)
[0012]非专利文献2:Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:11810-11813 (1995)
[0013]非专利文献3:Rigden DJ.等人 FEBS Lett.Mar 4; 583 (5): 872-8 (2009)
[0014]发明概述
[0015]发明欲 解决的课题
[0016]本发明的目的是，发现作为癌的治疗剂和/或预防剂等有用的新颖多肽、提供该多肽作为免疫诱导剂的用途。
[0017]用于解决课题的手段
[0018]本申请的
【发明者】们深入研究的结果是，通过使用犬精巢衍生的cDNA文库和荷癌犬血清的SEREX法，获得了编码蛋白质的cDNA，所述蛋白质与来自荷癌活体的血清中存在的抗体结合，并且基于该cDNA，他们制备了具有序列号2所示氨基酸序列的犬剑蛋白p60亚基A样I (以下记载为KATNAL1)的多肽。另外，基于所获得的基因的人和小鼠同源性基因，制备了具有序列号4和6所示氨基酸序列的人和小鼠KATNAL1。然后，他们发现这些KATNAL1多肽在乳腺癌、脑肿瘤、肛门周围腺癌、成神经细胞瘤、肥大细胞瘤、肝脏癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺癌或白血病的组织或细胞中特异地表达。进一步地，他们发现通过向活体内施用这些KATNAL1，能够在活体内诱导针对KATNAL1的免疫细胞和表达KATNAL1的活体内肿瘤的退缩。此外，他们发现能够表达编码KATNAL1的多肽或其片段的多核苷酸的重组载体针对表达KATNAL1的癌诱导了活体内的抗肿瘤效果。
[0019]进一步地，他们发现KATNAL1的多肽具有被抗原呈递细胞呈递、使对该肽特异的细胞毒T细胞活化和增殖的能力(免疫诱导活性)，由此该多肽对于癌的治疗和/或预防是有用的；另外，与该多肽接触了的抗原呈递细胞、以及与该抗原呈递细胞接触了的T细胞对于癌的治疗和/或预防是有用的，从而完成了本发明。
[0020]因此，本发明具有以下特征。 [0021](I)免疫诱导剂，其含有选自以下(a)至(C)的任一多肽类且具有免疫诱导活性的至少一种多肽、或包含编码该多肽的多核苷酸且在活体内能表达该多肽的重组载体作为有效成分，
[0022](a)包含序列表中序列号4、2、8、10、12所记载的氨基酸序列中连续7个以上氨基酸的多肽，
[0023](b)与上述(a)的多肽具有85%以上的序列同一性、且包含7个以上的氨基酸的多肽，
[0024](c)包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列的多肽。
[0025](2) (I)中所记载的免疫诱导剂，其中上述具有免疫诱导活性的多肽是具有序列表中序列号4、2、8、10、12所记载的氨基酸序列的多肽。
[0026](3)⑴或⑵中所记载的免疫诱导剂，其是抗原呈递细胞的处理剂。
[0027](4)⑴或⑵中所记载的免疫诱导剂，其是癌的治疗剂和/或预防剂。
[0028](5)⑷中所记载的免疫诱导剂，其中上述癌是表达KATNAL1的癌。
[0029](6) (4)或(5)中所记载的免疫诱导剂，其中上述癌是乳腺癌、脑肿瘤、肛门周围腺癌、成神经细胞瘤、肥大细胞瘤、肝脏癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺癌或白血病。
[0030](7)⑴~(6)中任一项所记载的免疫诱导剂，其还包含免疫增强剂。
[0031](8) (7)中所记载的免疫诱导剂，其中上述免疫增强剂选自由弗氏不完全佐剂、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白细胞介素12、白细胞介素18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素Υ和Flt3配体组成的组中的至少之一。
[0032]发明的效果
[0033]本发明提供了对癌的治疗和/或预防等有用的新颖免疫诱导剂。如下文实施例中具体描述的那样，向活体施用本发明中所用的多肽能够在活体内诱导免疫细胞，进而能使已存在的癌缩小或退缩。因此，该多肽对癌的治疗和预防是有用的。
附图简述
[0034]图1是显示鉴定的KATNAL1基因在犬正常组织和肿瘤组织或者癌细胞株中的表达模式的图。参照编号1:犬KATNAL1基因在犬的各组织和细胞株中的表达模式；参照编号2:犬GAPDH基因在犬的各组织和细胞株中的表达模式。
[0035]图2是显示鉴定的KATNAL1基因在人正常组织和肿瘤组织或者癌细胞株中的表达模式的图。参照编号3:人KATNAL1基因在人的各组织和细胞株中的表达模式；参照编号4:人GAPDH基因在人的各组织和细胞株中的表达模式。
[0036]图3是显示鉴定的KATNAL1基因在小鼠正常组织和肿瘤组织或者癌细胞株中的表达模式的图。参照编号5:小鼠KATNAL1基因在小鼠的各组织和细胞株中的表达模式；参照编号6:显示小鼠GAPDH基因在小鼠的各组织和细胞株中的表达模式。
[0037]用于实施发明的实施方案
[0038]可以列举以下作为本发明免疫诱导剂中的有效成分而含有的多肽。另外，在本发明中，“多肽”是多个氨基酸通过肽键形成的分子，不仅包含构成的氨基酸数多的多肽分子，也包含构成的氨基酸数少的低分子量分子(寡肽)和全长蛋白质；在本发明中，也包含具有序列号2、4、8、10、12中所示氨基酸序列的KATNAL1全长蛋白质。
[0039](a)由具有序列表中序列号4、2、8、10、12中所示氨基酸序列的多肽中的连续7个以上氨基酸组成、且具有免疫诱导活性的多肽，
[0040](b)与(a)的多肽具有85%以上的序列同一性、且包含7个以上的氨基酸的具有免疫诱导活性的多肽，
[0041](c)包含(a)或(b)的多肽作为部分序列、且具有免疫诱导活性的多肽。
[0042]另外，在本发明中，“具有氨基酸序列”是指氨基酸残基以这样的顺序排列。因此，例如“具有序列号2所不氣基酸序列的多妝”是指持有序列号2中所不的Met Asn LeuAla...(中略)...Glu Phe Gly Ser Ala的氨基酸序列的、大小为490个氨基酸残基的多肽。另外，例如有时将“具有序列号2所示氨基酸序列的多肽”略写为“序列号2的多肽”。对于“具有碱基序列”的表述也是同样的。在这种情况下，用语“具有”与表述“包含”也可以互换。
[0043]在本文中，“免疫诱导活性”是指诱导活体内分泌干扰素等细胞因子的免疫细胞的能力。
[0044]上述多肽是否具有免疫诱导活性可以通过例如公知的ELISP0T测定法等确认。具体而言，例如如后述的实施例中所记载的那样，从施用了需要评价免疫诱导活性的多肽的活体获得外周血单个核细胞等细胞，将该细胞与该多肽共存培养，通过使用特异抗体测定由该细胞产生的细胞因子量，能够测定该细胞中的免疫细胞数，由此能够评价免疫诱导活性。
[0045]另外，如后述的实施例中所记载的那样，将上述(a)~(C)的重组多肽施与荷癌活体，通过其免疫诱导活性也能够使肿瘤退缩。由此，上述免疫诱导活性也能够以抑制癌细胞增殖或使癌组织(肿瘤)缩小或消减的能力(下文中称为“抗肿瘤活性”)来评价。多肽的抗肿瘤活性例如如后述的实施例中具体记载的那样，能够通过研究实际施用了该多肽的荷癌活体中肿瘤是否缩小等来确认。
[0046]或者，也能够通过研究用该多肽刺激的T细胞(即，与呈递该多肽的抗原呈递细胞接触的T细胞)是否显示体外对肿瘤细胞的细胞毒活性，来评价多肽的抗肿瘤活性。T细胞与抗原呈递细胞的接触可以如后述那样，将两者在液体培养基中共存培养而实施。细胞毒活性的测定可以例如如Int.J.Cancer, 58:p317, 1994中所记载的称为51Cr释放测定法的公知方法来实施。在将上述多肽用于癌的治疗和/或预防用途中的情形时，不特别地限制评价方法，但优选以抗肿瘤活性作为指标来评价免疫诱导活性。 [0047]本发明公开的序列表中序列号2、4、8、IO、12分别显示的氨基酸序列是KATNALI蛋白质的氨基酸序列，其是通过使用犬精巢衍生的cDNA文库和荷癌犬血清的SEREX法，分离与来自荷癌犬的血清中特异存在的抗体结合的多肽和所述多肽的人、牛、马、鸡同源因子而获得的(参照实施例1)。在作为犬KATNAL1的人同源因子一人KATNAL1中，序列同一性是碱基序列95%、氨基酸序列98% ;在作为犬KATNAL1的牛同源因子一牛KATNAL1中，序列同一性是碱基序列91 %、氨基酸序列97% ;在作为犬KATNAL1的马同源因子一马KATNAL1中，序列同一性是碱基序列87%、氨基酸序列88% ;在作为犬KATNAL1的鸡同源因子一鸡KATNALI中，序列同一性是碱基序列81 %、氨基酸序列90%。
[0048]上述(a)的多肽是具有序列号2、4、8、10、12所示氨基酸序列的多肽中的连续7个以上、优选地连续8、9或10个以上的氨基酸的多肽、且具有免疫诱导活性。更优选地，该多肽包含与序列号4所示氨基酸序列的序列同一性为85%以上的氨基酸序列的多肽；特别优选地，该多肽具有序列号2、4、8、10、12所示的氨基酸序列。另外，如本领域公知的那样，如果是约7个氨基酸残基以上的多肽，则能够发挥抗原性和免疫原性。因此，只要是序列号2、4的氨基酸序列中的连续7个氨基酸残基以上的多肽，由于其具有免疫诱导活性，因此能够用于本发明的免疫诱导剂的制备中。
[0049]另外，作为通过施用癌抗原多肽来免疫诱导的原理，已知的是，多肽被抗原呈递细胞摄入，然后在该细胞内被肽酶分解成为较小的片段，呈递在该细胞表面上，细胞毒T细胞等对其识别，选择性杀死呈递该抗原的细胞。抗原呈递细胞的表面上呈递的多肽大小是比较小的，氨基酸数为7~30个左右。因此，从呈递在抗原呈递细胞上这点出发，作为上述(a)的多肽，序列号2、4、8、10、12所示氨基酸序列中的连续7~30个氨基酸左右的多肽是优选实施方案之一，更优选地，8~30个或9~30个左右的氨基酸组成的多肽是足以呈递在抗原呈递细胞上的。有时也有比这些尺寸相对小的多肽不被摄入抗原呈递细胞内，而是直接呈递在抗原呈递细胞上的细胞表面的情形。
[0050]另外，被抗原呈递细胞摄入的多肽在该细胞内受到肽酶在随机位置处的切断，产生多种多肽片段。由于这些多肽片段呈递在抗原呈递细胞表面上，如果施用序列号2、4、8、
10、12的全长区域这样大尺寸的多肽，则通过抗原呈递细胞内的分解而必然产生抗原呈递细胞介导的有效免疫诱导的多肽片段。因此，即使对于抗原呈递细胞介导的免疫诱导，能够优选使用大尺寸多肽，也可以是氨基酸数为30个以上、更优选地100个以上、更优选地200个以上、更优选地250个以上、更优选地序列号2、4、8、10、12的全长区域多肽。
[0051]上述(b)的多肽是在上述(a)的多肽中置换、缺失和/或插入少数(优选地一个或几个的)氨基酸残基的多肽，是与原始序列具有90%以上、优选地95%以上、更优选地98%以上、进一步优选地99%以上或99.5%以上的序列同一性、且具有免疫诱导活性的多肽。一般地，在蛋白质抗原中，即使在该蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或插入少数氨基酸残基的情形，本领域技术人员广泛已知的是存在有时与原始蛋白质具有几乎相同的抗原性的情形。因此，上述(b)的多肽由于也能发挥免疫诱导活性，所以能够用于本发明免疫诱导剂的制备。另外，上述(b)的多肽也优选的是在序列号2、4、8、10、12所示氨基酸序列中置换、缺失和/或插入I个至几个氨基酸残基的多肽。本说明书中的“几个”表示2~10的整数、优选地2~6的整数、进一步优选地2~4的整数。
[0052]在本文中，氨基酸序列或碱基序列的“序列同一性”是指在使需要比较的2个氨基酸序列(或碱基序列)的氨基酸残基(或碱基)尽可能多地一致下将两个氨基酸序列(或碱基序列)比对，用百分率来表示一致的氨基酸残基数(或一致的碱基数)除以总氨基酸残基数(或总碱基数)。进行上述比对时，根据需要在所比较的2个序列的一方或双方中合适地插入空位。这样的序列比对能够使用例如BLAST、FASTA, CLUSTALff等周知的程序进行。在插入空位的情形，上述总氨基酸残基数变为将I个空位作为I个氨基酸残基来计数的残基数。由此，计数的总氨基酸残基数在所比较的2个序列间是不同的情形下，序列同一性(％)是以一致的氨基酸残基数除以序列较长一方的总氨基酸残基数而算出的。
[0053]另外，构成天然蛋白质的20种氨基酸能够按具有类似性质的氨基酸来分组为具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly，He, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn, Gin, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性氨基酸(Asp, Glu)、碱性氨基酸(Arg, Lys, His)、芳香族氨基酸(？1^，了71'，1'印)，已知如果是在它们内部的置换，多数情况下多肽的性质不变化。因此，对本发明上述(a)的多肽中的氨基酸残基置换的情形，由于它们各组内部的置换能够维持免疫诱导活性的可能性高，所以是优选的。
[0054]上述(c)的多肽包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列、且具有免疫诱导活性的多肽。即，上述(C)的多肽是在(a)或(b)的多肽一端或两端添加了其他氨基酸或多肽且具有免疫诱导活性的多肽。这样的多肽也能够用于本发明的免疫诱导剂的制备中。
[0055]上述多肽能够根据例如Fmoc法(荷甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。另外，也能够利用各种市售的肽合成仪按照常规方法来合成。此外，通过使用公知的基因工程技术，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸掺入表达载体，导入宿主细胞中，在该宿主细胞中生产多肽，能够得到目的多肽。
[0056]编码上述多肽的多核苷酸能够使用公知的基因工程技术或市售的核酸合成仪根据常规方法容易地制备。例如，具有序列号I的碱基序列的DNA，能够通过使用犬染色体DNA或cDNA文库作为模板，用设计的一对能够扩增序列号I中所记载的碱基序列的引物进行PCR来制备。如果是具有序列号3的碱基序列的DNA，能够使用人染色体DNA或cDNA文库作为上述模板同样地制备。能够适当地设定PCR反应条件，能够例举例如，以由94°C 30秒(变性)、55°C 30秒~I分钟(复性)、72°C 2分钟(延伸)组成的反应行程为I个循环，进行例如30个循环后，72°C反应7分钟的条件等，但不限于此。另外，基于本说明书中的序列表的序列号1、3所示碱基序列和氨基酸序列信息，制备合适的探针或引物，通过使用它们来筛选犬或人等的cDNA文库，能够分离所需要的DNA。cDNA文库优选地从表达序列号2、4的蛋白质的细胞、器官或组织制备。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等操作是本领域技术人员已知的操作，例如能够根据MolecularCloning,第 2 版；Current Protocols in Molecular Biology 等中所记载的方法实施。自由此获得的DNA能够得到编码上述(a)的多肽的DNA。另外，由于公知编码各氨基酸的密码子，能够容易地确定编码特定氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列。因此，由于也能够容易地确定编码上述(b)或(C)的多肽的多核苷酸的碱基序列，所以这样的多核苷酸也能够容易地使用市售的核酸合成仪通过常规方法合成。
[0057]作为上述宿主细胞，只要是能够表达上述多肽的细胞，任一细胞均可，作为原核细胞的例子可以例举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以例举猴肾脏细胞C0S1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细胞、出芽酵母、分裂酵母、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，但不限于它们。[0058]使用原核细胞作为宿主细胞的情形，作为表达载体，使用具有在原核细胞中能够复制的起点、启动子、核糖体结合部位、DNA克隆部位、终止子等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，能够例示PUC系统、pBluescriptll、pET表达系统、pGEX表达系统等。能够将编码上述多肽的DNA掺入这样的表达载体，将该载体转化原核宿主细胞后，培养得到的转化体，使编码上述DNA的多肽在原核宿主细胞中表达。此时，该多肽也能够与其它的蛋白质作为融合蛋白质表达。
[0059]使用真核细胞作为宿主细胞的情形，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区域、多聚(A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这样的表达载体，能够例示pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 载体、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2 等。与上述同样地,能够将编码上述多肽的DNA掺入这样的表达载体，将该载体转化真核宿主细胞后,培养得到的转化体，使编码上述DNA的多肽在真核宿主细胞中表达。在使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作为表达载体的情形，能够使上述多肽作为添加了His标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质表达。
[0060]能够使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等周知的方法将表达载体导入宿主细胞。
[0061]为了从宿主细胞分离纯化目的多肽，能够组合公知的分离操作实施。可以例举例如尿素等变性剂或表面活性剂处理、超音波处理、酶消化、盐析或溶媒分级沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、反相层析法等，但不限于此。
[0062]在通过以上方法获得的多肽中，如上所述，也包含与其它的任意蛋白质融合的融合蛋白质形式的多肽。能够例示例如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或His标签融合的融合蛋白质等。这样的融合蛋白质形式的多肽也作为上述(c)的多肽包含在本发明的范围中。进一步地，转化细胞表达的多肽在翻译后，存在受到细胞内各种修饰的情形。这样的翻译后被修饰多肽只要具有免疫诱导活性也包含在本发明的范围中。作为这样的翻译修饰，能够例示N末端甲硫氨酸去除、N末端乙酰化、添加糖链、由胞内蛋白酶引起的有限分解、十四烷酰化、异戊二烯化、磷酸化等。
[0063]如后述实施例中具体记载的那样，向荷癌活体施用具有免疫诱导活性的上述多肽能使现存的肿瘤退缩。因此，本发明的免疫诱导剂能够作为癌的治疗剂和/或预防剂使用。另外，具有免疫诱导活性的上述多肽能够用于通过免疫诱导来进行癌的治疗和/或预防的方法中。
[0064]在本文中，用语“肿瘤”和“癌”意指恶性新生物，能够互换使用。[0065]在这种情形下，作为对象的癌，只要是表达编码序列号KATNAL1的多肽的基因的癌即可，不进行特别的限定，优选地是乳腺癌、脑肿瘤、肛门周围腺癌、成神经细胞瘤、肥大细胞瘤、肝脏癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺癌或白血病。
[0066]另外，作为对象的动物，优选地是哺乳动物，更优选地是包含灵长类、宠物动物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，特别优选地是人、犬或猫。
[0067]本发明的免疫诱导剂向活体的施用途径可以是经口施用，也可以是非经口施用，但优选肌内施用、皮下施用、静脉内施用、动脉内施用等非经口施用。在以治疗癌为目的使用该免疫诱导剂的情形，为了提高抗癌作用，如后述实施例中所记载的那样，也能够施用至成为治疗对象的肿瘤附近的所属淋巴结。施用量是对免疫诱导有效的量即可，例如用于癌的治疗和/或预防中时，对癌的治疗和/或预防有效的量即可。对癌的治疗和/或预防有效的量要根据肿瘤的大小和症状等合适地选择，但是通常对于对象动物，每天的有效量是
0.0001~1000 μ g、优选地0.001~1000 μ g，能够分成I次或数次施用。优选地，分数回、每隔数日至数月施用。如后述实施例中具体例示的那样，本发明的免疫诱导剂能够使现存的肿瘤退缩。因此，由于对发生初期的少数癌细胞也能够发挥抗癌作用，在癌的发病前或癌的治疗后使用，能够防止癌的发病或再发。即，本发明的免疫诱导剂对癌的治疗和预防两者都有用。
[0068]本发明的免疫诱导剂可仅由多肽构成，也可与适应于各施用形式的药理学容许的载体、稀释剂、赋形剂等添加剂适当混合来制剂。制剂方法和可以使用的添加剂是医药制剂领域周知的，能够使用任一 方法和添加剂。作为添加剂的具体例子，能够例举生理缓冲液这样的稀释剂；砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、甘氨酸等这样的赋形剂；糖浆、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、聚氯乙烯、黄蓍胶等这样的结合剂；硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石、硅石等润滑剂，但不限于此。作为制剂形式，能够例举片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等经口剂；吸入剂、注射剂、栓剂、液体剂等非经口剂等。这些制剂能够通过常规已知的制法制备。
[0069]本发明的免疫诱导剂能够与能在活体内强化免疫应答的免疫增强剂组合使用。免疫增强剂可以包含于本发明的免疫诱导剂中，也可以作为另一种组合物与本发明的免疫诱导剂联合施用给患者。
[0070]作为上述免疫增强剂，能够例举例如佐剂。佐剂通过提供抗原的储备库(细胞外或巨噬细胞内)、活化巨噬细胞、并且刺激特定组的淋巴细胞，能够强化免疫应答，由此提高抗癌作用。因此，特别地，当本发明的免疫诱导剂用于癌的治疗和/或预防的情形，免疫诱导剂优选地除了作为有效成分的上述多肽之外还包含佐剂。多种类型的佐剂是本领域周知的，可以使用任意佐剂。作为佐剂的具体例子，能够例举MPL(SmithKline Beecham)、纯化沙门氏菌属的明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)Re595的脂多糖类和酸水解后得到的同类物；QS21 (SmithKline Beecham);从阜树(Quillja saponaria)提取物纯化的纯 QA-21 皂苷；PCT 申请 W096/33739 (SmithKline Beecham)中记载的 DQS21;QS-7, QS-17, QS-18 和 QS-Ll (So 和另外 10 人，Molecules and Cells, 1997 年，第 7 卷，P.178 - 186);弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；维生素E ；Montanide ;明矾；CpG寡核苷酸(参见例如，Kreig和另外7人，Nature,第374卷、p.546 — 549);聚肌胞和其衍生物(聚ICLC等)；和从角鲨烯和/或生育酚这样的生物可分解性油制备的多种油包水乳液。其中优选弗氏不完全佐剂、Montanide、聚肌胞和其衍生物、以及CpG寡核苷酸。上述佐剂与多肽的混合比一般是约1:10~10:1，优选地约1:5~5:1，更优选地约1:1。但是，佐剂不限于上述例示，可以在施用本发明的免疫诱导剂时也使用本领域已知的上述以外的佐剂(参见例如，Goding 著，单克隆抗体:原理与实践(Monoclonal Antibodies !Principles andPractice)，第2版，1986年)。制备多肽和佐剂的混合物或乳液的方法是预防接种领域的技术人员周知的。
[0071]另外，作为上述免疫增强剂，除了上述佐剂之外，还可以使用刺激对象的免疫应答的因子。例如，具有刺激淋巴细胞或抗原呈递细胞的特性的多种细胞因子作为免疫增强剂能够与本发明的免疫诱导剂组合使用。本领域技术人员公知这样的可增强免疫应答的许多细胞因子，作为例子能够例举强化疫苗的防御作用的白细胞介素-12 (IL-12)、GM-CSF,IL-18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素Υ和Flt3配体，但不限于它们。这样的因子也能够作为上述免疫增强剂使用，能够包含于本发明的免疫诱导剂中，或者作为另一种组合物与本发明的免疫诱导剂联合施用给患者。 [0072]另外，通过将上述多肽与抗原呈递细胞体外接触，能够将该多肽呈递给抗原呈递细胞。即，上述(a)至(C)的多肽能够作为抗原呈递细胞的处理剂利用。在本文中，作为抗原呈递细胞，能够优选使用保有MHC I类分子的树状细胞或B细胞。多种MHC I类分子已经被鉴定并周知。人中的MHC分子称作HLA。作为HLA I类分子，能够例举HLA-A、HLA-B、HLA_C ;更具体地，能够例举 HLA-Al、HLA-A020U HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-Al1、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602 等。
[0073]保有MHC I类分子的树状细胞或B细胞能够通过周知的方法自外周血制备。例如，通过使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)从骨髓、脐带血或患者的外周血诱导出树状细胞，向该培养系统中添加肿瘤相关肽，能够诱导出肿瘤特异的树状细胞。
[0074]通过施用有效量的该树状细胞，能够诱导出癌的治疗中希望有的应答。使用的细胞能够是使用健康人提供的骨髓或脐带血、患者本人的骨髓或外周血等，但是使用患者本来的自体细胞的情形安全性高，也能够期待避免严重的副作用。外周血或骨髓可以是任一新鲜样品、低温保存样品和冷冻保存样品。外周血可以培养全血，也可以仅分离白细胞组分并培养，但从效率的观点看，优选后者。进一步地，从白细胞组分中也可以分离单个核细胞。另外，在以骨髓或脐带血为起源的情形时，可以培养构成骨髓的全部细胞，也可以从中分离单个核细胞并培养。外周血或其白细胞组分、骨髓细胞中包含作为树状细胞起源的单个核细胞、造血干细胞或未成熟树状细胞或CD4阳性细胞等。使用的细胞因子只要安全性和生理活性是经确认特性的细胞因子即可，不管是天然型或基因重组型等，也不管其生产方法，但优选地使用最小需要量的确保了医疗用品质的样品。不特别地限定添加的细胞因子的浓度，只要是诱导树状细胞的浓度即可，通常优选10至1000ng/ml左右、更优选20至500ng/ml左右的细胞因子总浓度。培养能够使用通常用于白细胞培养的熟知培养基进行。不特别地限定培养温度，只要可以增殖白细胞即可，但人体温度37°C左右是最优选的。另外，不特别地限定培养中的气体环境，只要可以增殖白细胞即可，但优选通气5%C02。此外，不特别地限定培养期间，只要是必需数目的细胞被诱导的期间即可，这通常以3日至2周的期间进行。适当的仪器能够用于细胞分离或培养，但优选此类仪器具有确认了医疗用安全性、且操作稳定和简便。特别地，细胞培养装置不限于培养皿、烧瓶和培养瓶等常见的容器，也可以使用分层型容器或多段式容器、滚瓶(roller bottle)、转瓶(spinner bottle)、袋式培养器、中空纤维柱等。
[0075]上述多肽与抗原呈递细胞在体外接触的方法本身能够通过周知的方法实施。例如，能够通过将抗原呈递细胞培养于含有上述多肽的培养液中来实施。不特别地限定培养基中的肽浓度，通常是I至100μ g/ml左右，优选地是约5至20μ g/ml左右。不特别地限定培养时的细胞密度，通常是IO3至IO7个细胞/ml左右，优选地是5X IO4至5X IO6个细胞/ml左右。优选在37°C于5%C02环境中根据常规方法进行培养。另外，能够呈递在抗原呈递细胞表面上的肽长度通常是最大30个氨基酸残基左右。因此，虽然没有特别地限定长度，在抗原呈递细胞与多肽在体外接触的情形，也可以制备该多肽的长度为约30个氨基酸残基以下。
[0076]通过在上述多肽共存下培养抗原呈递细胞，将肽掺入抗原呈递细胞的MHC分子并呈递在抗原呈递细胞表面。因此，能够用上述多肽制备含有该多肽与MHC分子的复合体的分离的抗原呈递细胞。这样的抗原呈递细胞能够在体内或体外呈递该多肽至T细胞、诱导并增殖对该多肽特异的细胞毒T细胞。
[0077]如上述制备的含有上述多肽与MHC分子的复合体的抗原呈递细胞通过与T细胞在体外接触，能够诱导并增殖对该多肽特异的细胞毒T细胞。这可以通过在液体培养基中将上述抗原呈递细胞与T细胞共存培养实施。例如，能够通过将抗原呈递细胞悬浮于液体培养基中、将所得悬浮液置于微量平板的孔等容器中、向其添加T细胞并培养来实施。不特别地限定共存培养时抗原呈递细胞与T细胞的混合比率，就细胞数的比率而言，它通常是1:1至1:100左右、优选地是1:5至1:20左右。另外，不特别地限定悬浮于液体培养基中的抗原呈递细胞的密度，它通常是100个至1000万个细胞/ml左右、优选地是10000个至100万个细胞/ml左右。共存培养优选地根据常规方法在37°C于5%C02环境中进行。不特别地限定培养时间，它通常是2日至3周、优选地是4日至2周左右。另外，共存培养优选地在IL-2、IL-6、IL-7和IL-12这样的白细胞介素中的I种或多种白细胞介素存在下进行。在这种情况下，IL-2和IL-7的浓度通常是5~20U/ml左右、IL-6的浓度通常是500~2000U/ml左右、IL-12的浓度通常是5~20ng/ml左右，但不限于这些浓度。上述的共存培养也可以追加新鲜的抗原呈递细胞、重复一次至几次实施。例如，共存培养后弃去培养上清，添加新鲜的抗原呈递细胞悬液，然后进行共存培养，这样的操作可以重复一次至几次。各共存培养的条件可以与上述同样。
[0078]通过上述共存培养诱导和增殖对该多肽特异的细胞毒T细胞。因此，能够用上述多肽制备与该多肽和MHC分子的复合体选择性结合的分离的T细胞。
[0079]如后述实施例中所记载的那样，KATNAL1基因在乳腺癌细胞、乳腺癌组织、脑肿瘤细胞、脑肿瘤组织、肛门周围腺癌组织、肛门周围腺癌细胞、肥大细胞瘤组织、肥大细胞瘤细胞、成神经细胞瘤细胞、肝脏癌细胞、肝脏癌组织、前列腺癌细胞、前列腺癌组织、肺癌细胞、肺癌组织、甲状腺癌细胞、甲状腺癌组织和白血病细胞中特异地表达。因此，认为在这些癌种类中，KATNAL1较正常细胞显著多地存在。因此，癌细胞内存在的KATNAL1多肽的一部分呈递至癌细胞表面上的MHC分子，当将如上述制备的细胞毒T细胞施用至活体内时，细胞毒T细胞以其作为标志物，能够破坏癌细胞。另外，由于呈递KATNAL1多肽的一部分的抗原呈递细胞在活体内也能够诱导并增殖对该多肽特异的细胞毒T细胞，所以施用该抗原呈递细胞至活体内也能够破坏癌细胞。即，使用上述多肽制备的上述细胞毒T细胞或者上述抗原呈递细胞作为癌的治疗剂和/或预防剂也如本发明的免疫诱导剂同样地有用。
[0080]在上述分离的抗原呈递细胞或分离的T细胞施用至活体的情形，为了避免在活体内将此类细胞作为异物攻击而致活体内的免疫应答，优选此类分离的细胞是将自接受治疗的患者采样的抗原呈递细胞或T细胞如上所述用上述(a)至(C)的多肽制备的。 [0081]包含抗原呈递细胞或分离的T细胞作为有效成分的癌的治疗剂和/或预防剂的施用途径优选地是静脉内施用或动脉内施用这样的非经口施用。另外，根据症状或施用目的等适当地选择施用量，通常是I个~10兆个、优选地100万个~10亿个细胞用于施用，并且此类细胞优选地每几日或几月施用一次。制剂可以例如是生理缓冲食盐水中的细胞悬液，它也可以联合其他抗癌剂或细胞因子等使用。另外，可以添加制剂领域中熟知的I种或2种以上添加剂。
[0082]另外，也通过在对象动物的体内表达编码上述(a)至(C)的多肽的多核苷酸，能够在该活体内诱导抗体生产或细胞毒T细胞，获得与施用多肽同等的效果。即，本发明的免疫诱导剂可以包含编码上述(a)至(C)的多肽的多核苷酸的、能够在活体内表达该多肽的重组载体作为有效成分。如后述的实施例中所示，可以表达抗原多肽的这种重组载体也称作基因疫苗。
[0083]不特别地限定用于制备基因疫苗的载体，只要它可以在对象动物细胞内(优选地哺乳动物细胞内)表达即可，它可以是质粒载体，也可以是病毒载体，可以使用基因疫苗领域中公知的任意载体。另外，编码上述多肽的DNA或RNA等的多核苷酸能够如上所述根据常规方法容易地制备。另外，所述多核苷酸可以通过使用本领域技术人员熟知的方法掺入载体。
[0084]基因疫苗的施用途径优选地是肌内施用、皮下施用、静脉内施用、动脉内施用等的非经口施用途径；可以根据抗原种类等适当地选择施用量，施用量通常是就每Ikg体重而言，0.1μ g~IOOmg左右、优选地1μ g~IOmg左右的基因疫苗重量。
[0085]作为使用病毒载体的方法，能够例举将编码上述多肽的多核苷酸掺入例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等RNA病毒或DNA病毒，并用其感染对象动物的方法。其中特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等的方法。
[0086]作为其他方法，能够例举将表达质粒直接施用至肌内的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、Lipofectin法、显微注射法、磷酸|丐法、电穿孔法等，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。
[0087]对于本发明中所用的编码上述多肽的基因实际上作为医药品发挥作用，有将基因直接导入体内的体内(in vivo)方法和自对象动物采样某种细胞、体外将基因导入该细胞、并将所述细胞返回体内的离体(ex vivo)方法(Nikkei Science, 1994年4月，第20-45页；月刊药事，1994年，第36卷，第I号，p.23 - 48 ;实验医学增刊，1994年，第12卷，第15号；以及它们的引用文献等)，更优选体内方法。
[0088]在通过体内方法施用的情形，可以根据治疗目的的疾病、症状等通过适当的施用途径施与。例如，可以静脉、动脉、皮下、肌内等实施施用。在通过体内方法施用的情形，例如可以采用液体剂等的制剂形式，通常采用含有编码本发明上述肽的DNA作为有效成分的注射剂等，根据需要可以添加常用的运载体。另外，含有该DNA的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)可以采取混悬剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形式。
[0089]另外，在本发明中，在谈及“序列号I所示的碱基序列”的情形，除了指序列号I实际上显示的碱基序列之外，还包含与之互补的序列。因此，在谈及“具有序列号I所示碱基序列的多核苷酸”的情形，包含具有序列号I实际上所示碱基序列的单链多核苷酸、具有与之互补的碱基序列的单链多核苷酸、和由它们组成的双链多核苷酸。在制备编码本发明中所用多肽的多核苷酸的情形，选择适当的任意核苷酸序列，本领域技术人员能够容易地进行这种选择。
实施例
[0090]以下基于实施例更具体地说明本发明。
[0091]实施例1:通过SEREX法获得新颖的癌抗原蛋白
[0092](I) cDNA文库的制作
[0093]通过酸-胍-酌-氯仿法(Acidguanidium — Phenol — Chloroform 法)从犬的精巢提取总RNA,使用01igotex-dT30 mRNA纯化试剂盒(宝酒造株式会社制),根据试剂盒所附的方法纯化聚腺苷酸RNA。
[0094]使用该获得的mRNA(5 μ g)合成cDNA噬菌体文库。使用cDNA合成试剂盒、Zap-cDNA 合成试剂盒、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning 试剂盒(STRATAGENE 公司制)，根据试剂盒所附的方法制备cDNA噬菌体文库。制备的cDNA噬菌体文库的大小是I X 106pfu/ml。
[0095](2 )通过血清筛选cDNA文库
[0096]使用上述制备的cDNA噬菌体文库实施免疫筛选。具体地，感染宿主大肠杆菌(XLl-Blue MRF’)，在Φ90χ15πιπι的NZY琼脂糖平板产生2340个克隆，在42°C培养3至4小时以形成噬菌斑，该平板以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纤维素膜(Hybond C Extra:GE Healthecare Bio-Science公司制)在37°C覆盖4小时以诱导并表达蛋白质，将蛋白质转移到该膜上。此后，将该膜回收，浸泡在含有0.5%脱脂粉乳的TBSaOmMTris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)中于4°C振摇过夜以抑制非特异性反应。使该滤膜与500倍稀释的患病犬血清在室温反应2至3小时。
[0097]使用对患有肛门近位肿瘤的患病犬采样的血清作为上述患病犬血清。将这些血清保存在_80°C，在紧邻使用前进行前处理。血清的前处理方法根据以下方法进行。即，用未插入外来基因的λ ZAP表达噬菌体感染宿主大肠杆菌(XLl-BLue MRF’ )后，在NZY平板培养基上于37°C过夜培养。随后，添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3 pH8.3的缓冲液至该平板，4°C静置15小时后，回收上清作为大肠杆菌/噬菌体提取液。随后，将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液流经NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制)，并将大肠杆菌/噬菌体来源的蛋白质固定在该柱上。使患病犬血清流经固定有蛋白质的该柱并反应，从血清中除去吸附至大肠杆菌和噬菌体的抗体。将已经流过柱的血清级分用含有0.5%脱脂粉乳的TBS稀释500倍，将其用作免疫筛选材料。
[0098]已经印迹了所述处理血清和上述融合蛋白质的膜用TBS-T(0.05%吐温20/TBS)洗涤4次，使得已经用含有0.5%脱脂粉乳的TBS稀释5000倍的作为二次抗体的山羊抗犬IgG (山羊抗犬IgG-h+I HRP缀合的:BETHYL Laboratories公司制)与该膜在室温反应I小时，检测通过使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)的酶显色反应实施，从Φ 90x15mm的NZY琼脂糖平板上取出与显色反应阳性部位相对应的菌落，溶解于500 μ I SM缓冲液(IOOmMNaCl, IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01%明胶ρΗ7.5)。以与上文所述相同的方法重复二次、三次筛选直至显色反应阳性菌落呈现单一化，筛选了与血清中IgG反应的9110个噬菌体克隆，分离到I个阳性克隆。[0099](3)分离的抗原基因的序列同一性检索
[0100]为了将通过以上方法分离的I个阳性克隆供碱基序列分析，实施自噬菌体载体转变成质粒载体的操作。具体地，调节至吸光度0D_为1.0的宿主大肠杆菌(XLl-BlueMRF’ )而制备的200 μ I溶液与100 μ I纯化的噬菌体溶液和I μ I ExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE公司制)混合，37°C反应15分钟后，添加3ml LB培养基，37°C进行2.5至3小时的培养，此后立即在70°C水浴中保温20分钟，然后4°C、1000Xg离心15分钟，将上清作为噬菌粒溶液回收。随后，调节至吸光度0D_为1.0的噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)而制备的200 μ I溶液与10 μ I纯化的噬菌体溶液混合后，37°C反应15分钟，将50 μ I所得物铺在含有氨苄青霉素(终浓度:50μ g/ml)的LB琼脂培养基，37°C过夜培养。挑取转化的SOLR的单菌落并且在含有氨苄青霉素(终浓度:50 μ g/ml)的LB琼脂培养基中于37°C培养后，使用QIAGEN质粒小量制备试剂盒(QIAGEN公司制)纯化具有目的插入物的质粒DNA。
[0101]使用序列号13所记载的T3引物和序列号14所记载的T7引物，通过引物步行法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。通过所述序列分析获得序列号I所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列和氨基酸序列，实施序列同一性检索程序BLASTSearch (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),进行与已知基因的序列同一性搜索，结果表明获得的基因是KATNAL1基因。犬KATNAL1与作为人同源因子的人KATNAL1的序列同一性是碱基序列95%、氨基酸序列98% ;与作为小鼠同源因子的小鼠KATNAL1的序列同一性是碱基序列85%、氨基酸序列94% ;与作为牛同源因子的牛KATNAL1的序列同一性是碱基序列91 %、氨基酸序列97% ;与作为马同源因子的马KATNAL1的序列同一性是碱基序列87%、氨基酸序列88% ;与作为鸡同源因子的鸡KATNAL1的序列同一性是碱基序列81%、氨基酸序列90%。人KATNAL1的碱基序列示于序列号3、氨基酸序列示于序列号4 ;小鼠KATNAL1的碱基序列示于序列号5、氨基酸序列示于序列号6 ;牛KATNAL1的碱基序列示于序列号7、氨基酸序列示于序列号8 ;马KATNAL1的碱基序列示于序列号9、氨基酸序列示于序列号10 JlKATNALl的碱基序列示于序列号11、氨基酸序列示于序列号12。
[0102](4)在各组织中的表达分析
[0103]通过RT_PCR(逆转录-PCR)法研究以上述方法得到的基因在犬、人和小鼠的正常组织和各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(Invitrogen公司制)，按照其所附的方案从50至IOOmg各组织和各细胞株5至IOxlO6个细胞中提取总RNA。使用用于RT-PCR的Superscript第一链合成系统(Invitrogen公司制)根据所附的方案，利用该总RNA合成cDNA。对于人正常组织(脑、海马、精巢、结肠、胎盘)的cDNA，使用GenePool cDNA(invitrogen 公司制)、QUICK — Clone cDNA(Clonetech 公司制)和 Large —Insert cDNA Library (Clonetech公司制)。使用对所获得基因特异的引物(犬引物是序列号15和16所不、人引物是序列号17和18所不、小鼠引物是序列号19和20所不)，如下实施PCR反应。即，添加0.25 μ I通过逆转录反应制备的样品、使上述引物各2 μ M、0.2mM各dNTP、0.65U ExTaq聚合酶(宝酒造社制)的各试剂和所附的缓冲液至25 μ I总量，使用Thermal Cycler (BIO RAD 公司制)，将 94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C I 分钟的循环重复 30次。出于比较对照的目的，同时使用GAPDH特异性引物(犬和人GAPDH引物是序列号21和22所示、小鼠GAPDH引物是序列号23和24所示)。结果如图1所示，犬KATNAL1基因在健康犬组织中的大部分组织没有观察到表达；另一方面，在犬肿瘤组织中观察到强表达。人和小鼠KATNAL1基因的表达也与犬KATNAL1基因同样，在人和小鼠正常组织中几乎不能确认到表达；在癌细胞的大部分细胞株中检测到表达(图2、3)。
[0104](5)各组织中的定量表达分析 [0105]通过定量RT-PCR (逆转录-PCR)法研究由上述方法获得的基因在人正常组织中的表达。人正常组织和癌组织的cDNA使用Tissue scan Real Time cancer survey Panel I(ORIGENE 公司制)。另外，使用 BIO RAD 公司制的 CFX96Real Time Cystem - ClOOOThermalCycler实施定量RT-PCR。使用对所获得基因特异的引物(序列号17和18中所记载)，如下实施PCR反应。即，添加5μ I cDNA样品、上述引物各2yM、2XSYBR Premix Ex TaqII聚合酶(宝酒造株式会社制)的各试剂和所附的缓冲液至20 μ I总量，将94°C 30秒、55°C 30秒、72°C I分钟的循环重复30次。结果是，与各正常组织比较，KATNAL1基因在乳腺癌、大肠癌、甲状腺癌、肝脏癌、前列腺癌、肺癌中表达全部提高5倍以上。本结果表明，以人KATNAL1为标的的抗肿瘤剂在正常组织中的副作用完全不用担心，能期待药剂的药效与副作用的大背离。
[0106]实施例2:分析KATNAL1在活体内的癌抗原性
[0107](I)制备在活体内表达KATNAL1的重组载体
[0108]基于序列号5的碱基序列，按照以下方法制备在活体内表达KATNAL1的重组载体。PCR是自实施例1中观察到表达的小鼠癌细胞株N2a(购自ATCC)制备cDNA。添加cDNAl μ 1、使各0.4 μ M的包含HindIII和XbaI限制性酶切序列的2种引物(序列号25和26中记载)、
0.2mM dNTPU.25U PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造株式会社制)的各试剂和所附缓冲液至50 μ I 总量，使用 Thermal CyclerCBIO RAD 公司制)，将 98°C 10 秒、55。。15 秒、72。。4 分钟的循环重复30次。另外，上述2种引物是扩增编码序列号5的氨基酸序列全长区域的引物。PCR后，用I %琼脂糖凝胶电泳扩增的DNA，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)纯化了约1500bp的DNA片段。
[0109]将纯化的DNA片段连接入克隆载体pCR-Blunt (Invitrogen公司制)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒，通过测序确认扩增的基因片段与目的序列一致。用HindIII和XbaI限制性酶处理与目的序列一致的质粒，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化后，将目的基因序列插入用HindII1、XbaI限制性酶处理的哺乳类表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen公司制)。通过使用这种载体能够在哺乳类的细胞内产生KATNAL1蛋白。
[0110]向100 μ g上述制备的质粒DNA添加50 μ g金粒子(Bio Rad公司制)、亚精胺100 μ KSIGMA公司制)、IM CaCl2 100 μ 1(SIGMA公司制)，涡旋搅拌，室温静置10分钟(下文称作“金-DNA粒子”)。3000转/分钟离心I分钟后，弃去上清，用100%乙醇(WAK0社制)洗涤3次。添加6mll00%乙醇至金-DNA粒子，通过涡旋彻底搅拌后，将金-DNA粒子流入Tefzel Tubing (Bio Rad公司制)，使沉淀在壁面。将附着有金-DNA粒子的Tefzel Tubing中的乙醇风干，切成适用于基因枪的长度。
[0111](2)通过DNA疫苗法的KATNAL1的抗肿瘤效果
[0112]对10只的A/J小鼠(7周龄，雄性，购自日本SLC社)和Balb/c小鼠(7周龄，雄性，购自日本SLC社)，将上述制备的管状物固定在基因枪上，使用纯氦气以400psi压力将DNA疫苗每7日总共3次经皮施用至剃毛小鼠的腹腔(使得质粒DNA接种量是2 μ g/只)后，分别移植1 X 1O6个小鼠成神经细胞瘤细胞株N2a细胞、大肠癌细胞株CT26，评价抗肿瘤效果(预防模型)。另外，作为对照，在各模型中各10只小鼠施用没有插入KATNAL1基因的质粒DNA。
[0113]以肿瘤的大小(长径X短径2/2)和生存小鼠的比例评价抗肿瘤效果。本研究的结果是，在使用成神经细胞瘤细胞株的预防模型中，43天后对照组和KATNAL1质粒施用组分别变为2886mm3、659mm3，观察到KATNAL1质粒施用组中肿瘤的显著退缩。另外，观察生存经过的结果是，在使用成神经细胞瘤细胞株的预防模型中，对照组在施用后76天全部死亡，与之相反，在KATNAL1质粒施用组中，60 %的小鼠生存下来。由以上结果可见，KATNALI质粒施用组与对照组相比较具有显著的抗肿瘤效果。同样地，在使用大肠癌细胞株的预防模型中也是35天后对照组和KATNAL1质粒施用组分别变为2598mm3、763mm3，观察到KATNAL1质粒施用组中肿瘤的显著退缩。另外，观察生存经过的结果是，对照组在施用后50天全部死亡，与之相反，在KATNAL1质粒施用组中，50%的小鼠生存下来。由以上结果可见，KATNALI质粒施用组与对照组相比较具有显著的抗肿瘤效果。
[0114]实施例3:人重组KATNAL1蛋白的制备和免疫诱导能力的评价
[0115](1)人重组KATNALI蛋白的制备
[0116]基于序列号3的基因，根据以下方法制备人KATNAL1的重组蛋白质。PCR如下进行:添加自实施例1中制备的各种组织和细胞cDNA通过RT-PCR法能够确认表达的cDNAl μ 1、使包含EcoRI和XhoI限制性酶切序列的2种引物(序列号27和28记载)各0.4μ M、0.2mMdNTP、l.25U PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制)的各试剂和所附缓冲液至50 μ I总量，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，将98°C 10秒、55°C 15秒、72°C 4分钟的循环重复30次。另外，上述2种引物是扩增编码序列号4的氨基酸序列全长区域的引物。PCR后，用I %琼脂糖凝胶电泳扩增的DNA，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)纯化约1500bp 的 DNA 片段。
[0117]将纯化的DNA片段连接入克隆载体pCR-Blunt (Invitrogen公司制)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒，通过测序确认扩增的基因片段与目的序列一致。用EcoRI和XhoI限制性酶处理与目的序列一致的质粒，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化后，将目的基因序列插入用EcoR1、XhoI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)。使用这种载体能够产生His标签融合型的重组蛋白质。将所述质粒转化到表达用大肠杆菌BL21(DE3)中，用ImM IPTG进行表达诱导以在大肠杆菌内表达目的蛋白质。
[0118](2)重组KATNALI蛋白的纯化
[0119]将上述获得的表达序列号4的重组大肠杆菌在含有1ΟΟμ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中在37°C培养直至在600nm的吸光度变成大约0.7后，添加异丙基-β _D_1_硫代吡喃半乳糖苷至终浓度ImM，再于37°C培养4小时。此后，4800转/分钟离心10分钟收集细菌。菌体沉淀悬浮在磷酸缓冲化生理食盐水中，再4800转/分钟离心10分钟，洗涤菌体。
[0120]将该菌体悬浮在50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，进行冰上超声波破碎。将大肠杆菌超声波破碎液以6000转/分钟离心20分钟分离，所得的上清作为可溶性级分，沉淀物作为不溶性级分。
[0121]将不溶性级分悬浮在50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，6000转/分钟离心15分
钟。重复本操作2次，进行脱蛋白酶操作。
[0122]将该残渣悬浮于含有6M盐酸胍、0.15M氯化钠的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，4°C静置20小时，使蛋白质变性。该变性操作后，6000转/分钟离心30分钟，将得到的可溶性级分添加至根据常规方法制备的镍螯合柱(载体:Chelateing Sepharose (商标)Fast Flow (GE Health Care公司);柱容量:5ml ;平衡缓冲液:含有6M盐酸胍、0.15M氯化钠的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，再于4°C静置过夜，进行对镍螯合化载体的吸附。将该柱载体于1500转/分钟离心5分钟，回收上清，将柱载体用磷酸缓冲化生理食盐水悬浮后，再充填柱。
[0123]用柱容量10倍量的含有0.5M氯化钠的0.1M乙酸缓冲液(pH4.0)实施柱未吸附级分的洗净操作后，立即用含有0.5M氯化钠的0.1M乙酸缓冲液(pH3.0)洗脱作为纯化级分，以后将该纯化级分作为施用试验用的材料。另外，各洗脱级分中的目的蛋白质通过根据常规方法进行的考马斯染色确认。
[0124]将通过上述方法获得的纯化样品置换为反应用缓冲液(50mM Tris-HCl, IOOmMNaCl, 5mM CaCl2 (ρΗ8.0))后，使用 FactorXa Cleavage Capture Kit (Novagen 公司制)，按照所附的方案，通过因子Xa蛋白酶切去His标签，并进行目的蛋白质的纯化。随后，将通过上述方法得到的纯化样品12ml使用超滤NAN0SEPIOK OMEGA (PALL社制)，并使用生理用磷酸缓冲液(日水制药社制)置换之后，用HT Tuffryn Acrodisc 0.22 μ m (PALL社制)进行无菌过滤，将所得物用于实验。
[0125](3)对人重组KATNAL1蛋白反应性的⑶8阳性细胞毒T细胞的诱导
[0126]从健康人分离外周血，覆以淋巴细胞分离介质(Organonp Teknika, Durham, NC),以500转/分钟室温离心分离20分钟。回收含有外周血单个核细胞(PBMC)的级分，在冷的磷酸盐缓冲液中洗净3次(或者3次以上)，得到PBMC。将得到的PBMC悬浮于20ml AIM-V培养基(LifeTechnololgies, Inc.，美国纽约州 Grand Island)中，于 37°C >5% CO2 条件下在培养瓶(Falcon)中贴壁2小时。非贴壁细胞用于T细胞制备、贴壁细胞用于制备树状细胞。
[0127]另一方面，将贴壁细胞在AM-V培养基中于IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)存在下培养。6天后，回收得到的非贴壁细胞群体，以10 μ g/ml的浓度添加人重组KATNAL1蛋白，于37°C、5% CO2条件下培养4小时。培养后交换为添加了 IL-4 (1000U/ml )、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6 (1000U/ml、Genzyme，Cambridge, MA)> IL-1 β (lOng/ml、Genzyme,Cambridge, MA)和 TNF- a (10ng/ml、Genzyme, Cambridge, MA)的 AIM-V 培养基，再培养 2天后得到的非贴壁细胞群体作为树状细胞使用。
[0128]将制备的树状细胞以细胞密度I X IO6个细胞/ml悬浮于AIM-V培养基中，再次以10 μ g/ml的浓度添加人重组KATNAL1蛋白，使用96孔平板在37°C、5%C02条件下培养4小时。培养后，所述细胞用X射线照射(3000rad)，用AIM-V培养基洗净，悬浮于含有10%人 AB 血清(Nabi, Miami, FL) > IL-6 (1000U/ml)和 IL-12 (lOng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的AM-V培养基中，分别以IXlO5个细胞/孔的量添加至24孔平板中。进一步地，以I X IO6个细胞/孔的量添加制备的T细胞群体，于37°C、5%C02条件下培养。7天后弃去各培养上清，与上述同样地用人重组蛋白质处理后且X射线照射过的树状细胞悬浮于含有 10% 人 AB 血清(Nabi, Miami, FL)、IL-7 (10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)和 IL-2 (IOU/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的AM-V培养基中(细胞密度:I X IO5个细胞/ml)，将所述细胞分别以IxlO5个细胞/孔的量添加至24孔平板，再进行培养。每7天进行同样的操作，重复4~6次后，回收刺激的T细胞，通过流式细胞术确认⑶8阳性T细胞的诱导。
[0129]另外，作为阴性对照，使用具有本发明范围之外的序列的蛋白质(序列号29)。
[0130]接下来，研究了用本多肽刺激的⑶8阳性T细胞是否能破坏表达KATNAL1的肿瘤细胞。
[0131]已确认了表达KATNAL1的恶性脑肿瘤细胞株T98G (Stein GH等人，J.CellPhysiol.，99:43-54 (1979)，购自ATCC)105个细胞收集于50ml容量离心管中，添加100 μ Ci铬51并在37°C孵育2小时。此后，所述细胞用含有10%人AB血清的AIM-V培养基洗涤3次并以IO3个细胞/孔的量添加至96孔V形底平板；进一步地，此后分别添加用包含10%人AB血清的AM-V培养基悬浮的105、5x104、2.5x104和1.25xl04个已经用人重组KATNAL1蛋白刺激过的⑶8阳性T细胞，于37°C、5% CO2的条件下培养4小时。培养后，使用Y计数器测定培养上清中从受到破坏的肿瘤细胞释放出的铬51的量，由此算出人重组蛋白质刺激的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。
[0132]结果表明，人重组蛋白质刺激的⑶8阳性T细胞具有对T98G的细胞毒活性。另一方面，使用阴性对照蛋白质(序列号29)诱导的CD8阳性T细胞没有显示细胞毒活性。因此，明确了本发明使用的人重组蛋白质具有诱导能够破坏肿瘤细胞的CD8阳性细胞毒T细胞的能力。
[0133]另外，细胞毒活性显示的是，如上述刺激诱导的IO5个⑶8阳性T细胞与摄入了铬51的IO3个恶性脑肿瘤细胞株T98G混合，培养4小时，培养后测定培养基中释放的铬51的量，通过式I算出的⑶8阳性T细胞针对T98G的细胞毒活性。
[0134]式1:细胞毒活性(％)=添加了⑶8阳性T细胞时来自T98G的铬51游离量(cpm) +来自添加了 IN盐酸的标的细胞的铬51游离量(cpm) xlOO。
[0135]产业上的利用 可能性
[0136]由于本发明提供了包含对各种癌发挥抗肿瘤活性的多肽的免疫诱导剂，因此对癌的治疗和/或预防是有用的。
【权利要求】
1.免疫诱导剂，其含有选自以下(a)至(C)的任一多肽类且具有免疫诱导活性的至少一种多肽、或包含编码该多肽的多核苷酸且在活体内能表达该多肽的重组载体作为有效成分， (a)包含序列表中序列号4、2、8、10、12所记载的氨基酸序列中连续7个以上氨基酸的多肽， (b)与所述(a)的多肽具有85%以上的序列同一性、且包含7个以上氨基酸的多肽， (C)包含所述(a)或(b)的多肽作为部分序列的多肽。
2.权利要求1所述的免疫诱导剂，其中所述具有免疫诱导活性的多肽是具有序列表中序列号4、2、8、10、12所记载的氨基酸序列的多肽。
3.权利要求1或2所述的免疫诱导剂，其是抗原呈递细胞的处理剂。
4.权利要求1或2所述的免疫诱导剂，其是癌的治疗剂和/或预防剂。
5.权利要求4所述的免疫诱导剂，其中所述癌是表达KATNAL1的癌。
6.权利要求4或5所述的免疫诱导剂，其中所述癌是乳腺癌、脑肿瘤、肛门周围腺癌、成神经细胞瘤、肥大细胞瘤、肝脏癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺癌或白血病。
7.权利要求1~6中任一项所述的免疫诱导剂，其还包含免疫增强剂。
8.权利要求7所述的免疫诱导剂，其中所述免疫增强剂选自由弗氏不完全佐剂、Montanide、聚肌胞和其衍生 物、CpG寡核苷酸、白细胞介素12、白细胞介素18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素Υ和Flt3配体组成的组中的至少之一。
【文档编号】A61K48/00GK103547284SQ201280024226
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年5月18日 优先权日:2011年5月19日
【发明者】栗原祥, 冈野文义 申请人:东丽株式会社