在治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物的制作方法

在治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物。
【专利说明】在治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物
[0001]描述
[0002]本发明的主题是在预防或/和治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物，该组合物包含desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2或/和其药学可接受盐,和任选地药学可接受载体、佐剂、或/和辅助物质。
[0003]阿耳茨海默氏病
[0004]阿耳茨海默氏病(AD)是一种神经变性性病症，其导致皮层神经元损失，尤其是在联想新皮质和海马中，这继而导致认知功能的缓慢且进行性丧失，最终导致痴呆和死亡。疾病的主要标志是错折叠的蛋白质的聚集和沉积(Bertram等，2010;Mancuso等，2010): (I)作为胞外老年或神经炎性“斑”的聚集的β_淀粉状蛋白(Αβ)肽，和(2)作为胞内神经原纤维“缠结”(NFT)的超磷酸化τ蛋白。
[0005]在遗传上，AD分成两种形式:(I)早期发作家族性AD (小于60岁)，和(2)晚期发作散发性AD (大于60岁)。已知淀粉状蛋白前体蛋白(APP)、早老蛋白I (PSENl)、和早老蛋白2(PSEN2)基因中罕见的、引起疾病的突变导致早期发作家族性AD，而APOE(等位基因4)是晚期发作AD的单一的最重要的风险因素(Bertram等，2010)。
[0006]由蛋白质氧化和脂质过氧化表明的线粒体功能障碍和氧化应激是AD脑的特征。反应性氧类别(ROS)的生成与抗氧化剂对化学反应性类别的分解之间的不平衡导致氧化应激。Αβ具有直接的氧化效果，但是它也可以破坏线粒体氧化还原活性，导致自由基的增加。神经元不太能够防御ROS的增加，因为它们相对于其它哺乳动物细胞类型具有较低的抗氧化剂水平，并且如此认为对氧化应激是高度易感的。对原代神经元培养物添加Αβ导致对ATP酶的抑制、细胞电位变化、和Ca2+流入(Varadarajan等，2000;Higginsa等，2010)。
`[0007]目前没有针对此破坏性疾病的治愈，并且得到美国食品和药品管理局(FDA)批准的少数治疗没有停止AD的进展，而是仅部分有效改善症状(Wollen，2010; Aderinwale等，2010)。目前，得到许可的针对AD的药用疗法是乙酰胆碱酯酶抑制剂诸如他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepizil)、利凡斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)和NMDA受体拮抗剂美金刚(memantine)。这些药物的效果是非常有限的，且主要作用同样是减少/减轻症状而不是预防疾病形成。可以在“标签外(off label)”给予其它药物，诸如他汀类(statins)(胆固醇水平降低剂)、抗高血压药、抗炎药,等等。这些药物无一已经证明为降低AD的进展(Kaduszkiewicz等,2005; Holscher, 2005)。用于治疗AD的其它策略在调查下。已经发现了神经元生长因子a (NGF)可以减少老年斑，并且改善认知功能(De Rosa等，2005)。由于现在已知胰岛素抗性为AD中的主要问题之一(Η?丨Scher和Li, 2010)，代替胰岛素自身，其它生长因子诸如肠降血糖素激素胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)在临床前研究中显示良好的效果。GLP-1肠降血糖素类似物利拉鲁肽(Iiraglutide)在转基因小鼠AD模型的脑中减少淀粉状蛋白斑的数目，降低β -淀粉状蛋白水平，预防认知损伤和突触功能障碍，降低炎症应答，并且增强突触生长和神经发生(McClean等，2011)。脑中的淀粉状蛋白斑及关联的炎症应答是AD的关键标志。在转基因小鼠AD模型中用另一种GLP-1类似物受体激动剂发现类似的保护效果(Li等，2010)。[0008]帕金森氏病
[0009]帕金森氏病(PD)是一种慢性神经变性性肌肉运动病症，其通常以黑质纹状体神经元的选择性变性、大大降低的多巴胺合成能力和随后不能衔接纹状体多巴胺受体为特征(Gandhi等，2005)。在疾病在临床上呈现前，黑质纹状体神经元的死亡在黑质密部(SNc)中默默发生，这可能是由于并发的凋亡事件、兴奋性毒性事件、自由基介导的神经炎性事件的发生。提供治愈ro病理学的治疗性策略或阻滞ro病理学的手段仍然是难以捉摸的。建立的药物疗法基本上是姑息的且并不在所有患者中有效。由于凋亡性细胞死亡是选择性黑质纹状体神经元死亡中的中心组分之一(Schapira，2001)，未来的治疗性策略可以牵涉靶向使用具有抗凋亡特性的生物分子。或者，可以通过具有神经营养性特性或刺激具有多巴胺能表型的细胞神经发生的能力的分子产生积极的治疗效果。最近已经观察到胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1)激动剂毒蜥外泌肽-4(exendin-4)在受到兴奋性毒性应激的PC12细胞培养物中显示神经营养性(Perry等，2002)和神经保护性(Perry等，2002)特性。最近，显示了(Harkavyi等，2008) —旦在两种H)小鼠模型中建立，毒蜥外泌肽_4阻滞黑质损伤的进展，或甚至反转黑质损伤。另外，已经在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)小鼠H)模型中显示了毒蜥外泌肽-4处理保护多巴胺能神经元免于变性，保持多巴胺水平，并且改善运动功能(Li等，2009)。
[0010]亨廷顿氏病
[0011]亨廷顿氏病(HD)是一种遗传性神经变性性病症，其以不随意身体运动，及精神病学和认知异常为典型。HD根本的遗传缺陷牵涉HD基因外显子I中CAG三核苷酸重复的扩充，这导致亨廷顿(htt)蛋白中多谷氨酰胺扩充。这导致异常的加工和有害的胞内聚集。最近，已经显示了毒蜥外泌肽-4处理阻抑胰和脑中的突变体htt内含物的形成，改善代谢效果和运动功能障碍，并且延长HD小鼠的存活(Martin等，2009)。
[0012]中风
[0013]中风的病理生理学包括皮层和纹状体神经元经由凋亡的死亡(Mattson，2007)。
[0014]最近，已经显示了毒蜥外`泌肽-4的施用在短暂大脑中动脉阻塞中风小鼠模型中降低脑损伤并且改善功能性结果(Li等，2009)。在沙鼠的大脑缺血模型中，进一步显示了用毒蜥外泌肽-4刺激GLP-1受体通过干扰小神经胶质活化免于短暂的大脑缺血性损伤来减弱缺血相关神经元死亡(Lee等，2011)。Teramoto等(2011)显示了毒蜥外泌肽_4在大脑缺血-再灌注损伤小鼠模型中是有效的。毒蜥外泌肽-4处理显著降低梗死体积，并且改善功能缺陷。
[0015]周围感觉神经病
[0016]约60-70%的患有糖尿病的个体具有一定程度的神经病学损伤，具体是引起手和/或脚的感觉受损，减缓的胃能动性或腕管综合征的神经病。目前没有证明反转由延长的高血糖及关联的代谢扰乱引起的神经病学损伤的疗法。已经在结状神经节的神经元中鉴定出GLP-1表达，这提示了 GLP-1在周围神经传递中的作用(Nakagawa，2004)。在非糖尿病啮齿类中的吡哆醇诱发的周围神经病的啮齿类模型中，显示了 GLP-1和s.c.毒蜥外泌肽-4部分提供保护免于几种吡哆醇诱发的功能和形态缺陷，并且促进轴突大小的正常化(Perry等，2007)。
[0017]认知功能、情绪和记忆:[0018]GLP-1受体激动剂能够在啮齿类中增强认知功能，如在Morris水迷宫中测量的；GLP-1受体敲除小鼠具有以学习缺陷为特征的表型，所述学习缺陷在海马GLP-1受体基因转基因后恢复(During等，2003)。最近，Isacson等(2010)在成年啮齿类中显示了长期毒蜥外泌肽-4处理对海马关联认知和情绪相关行为的影响。在另一项研究中，通过毒蜥外泌肽-4反转糖尿病小鼠模型的背根神经节中找到的多神经病(Himeno等，2011)。已经显示了另一种GLP-1类似物利拉鲁肽在高脂肪饮食诱发性肥胖和胰岛素抗性的小鼠中对认知功能和海马突触可塑性施加有益影响(Porter等，2010)。
[0019]胰高血糖素样肽I
[0020]胰高血糖素样肽1、GLP-1或GLP-1 (7-36)是一种在胰高血糖素原基因中编码的30个氨基酸的肽激素。它主要在肠的肠内分泌L细胞中生成，并且在含有脂肪、蛋白质水解物、和/或葡萄糖的食物进入十二指肠时分泌入血流中。最广泛研究的由GLP-1活化的细胞是胰腺中的胰岛素分泌β细胞，在那里其限定作用是提升葡萄糖诱导的胰岛素分泌。在β细胞中的GLP-1受体(GLP-1R)活化后，腺苷酰环化酶(AC)被活化，并且生成cAMP，这继而导致第二信使途径诸如蛋白质激酶A(PKA)和Epac途径的cAMP依赖性活化。与增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌的短期效果一样，连续的GLP-1R活化也提高胰岛素合成、β细胞增殖和新生(Doyle等，2007)。此外，GLP-1 一般调节胰高血糖素的浓度，减缓胃排空，刺激胰岛素(原)生物合成，提高对胰岛素的敏感性，并且刺激不依赖于胰岛素的糖原生物合成(Holst (1999) Curr.Med.Chem6:1005; Nauck 等(1997) Exp Clin EndocrinolDiabetesl05:187;Lopez-Delgado 等(1998)EndocrinologyI39:281I)。
[0021]GLP-1对胰岛素和胰高血糖素分泌的特殊影响在过去20年里已经产生研究活动，其以现在用于治疗2型糖尿病(T2DM)的天然存在的GLP-1受体(GLP-1R)激动剂毒蜥外泌肽-4为顶峰(Doyle等， 2007)。
[0022]在与胰腺不同的组织(脑、肾、肺、心、和主要血管)中，GLP-1可以活化特定的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体。
[0023]GLP-1已经显示了生长因子样及神经保护特性(McClean等，2010)。GLP-1还降低海马神经元的凋亡诱导，并且改善空间和联想学习(During等，2003)。Perry等(2002)报告了 GLP-1可以完全保护培养的大鼠海马神经元免于谷氨酸诱导的凋亡。GLP-1类似物(Val8)GLP-1和N-乙酰基-GLP-1已经对海马中突触传递的长时程增强效应(LTP)显示主要影响(McClean等，2010)。GLP-1类似物利拉鲁肽在转基因小鼠AD模型的海马中减少淀粉状蛋白斑的数目，降低β -淀粉状蛋白水平，阻止认知损伤和LTP抑制，降低炎症应答，并且增强突触生长和神经发生(McClean等，2011)。
[0024]已经显示了 GLP-1、利拉鲁肽和毒蜥外泌肽-4穿过血脑屏障(BBB) (Kastin等，2001;McClean等，2011)。Perry等(2003)发现了 GLP-1和毒蜥外泌肽-4降低脑中β淀粉状蛋白和神经元中淀粉状蛋白前体蛋白的水平。用毒蜥外泌肽-4或利拉鲁肽的长期处理影响成年小鼠海马齿状回中的细胞增殖和成神经细胞分化(Li等，2010;Hamilton等，2011)。
[0025]利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，具有式Arg34，Lys26(NE U-谷氨酰基(Na-十六酰基)))GLP-1 (7-37)。通常胃肠外施用利拉鲁肽。
[0026]化合物desPro36Exendin_4(1-39)-Lys6-NH2(AVEC)OlO,利西拉来(Iixisenatide))是毒蜥外泌肽-4的类似物。利西拉来在WO 01/04156中以SEQ ID N0:93披露:
[0027]SEQ ID NO:1:利西拉来(44AS)
[0028]H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-1-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0029]SEQ ID NO:2:毒蜥外泌肽 _4(39AS)
[0030]H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-1-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
[0031]SEQ ID NO:3:GLP-1(7-36)(30AS)
[0032]H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-1-A-W-L-V-K-G-R
[0033]毒蜥外泌肽是一组可以降低血液葡萄糖浓度的肽。毒蜥外泌肽与GLP-1 (7-36)具有仅约50%的氨基酸序列同一性。因此，一般不认为毒蜥外泌肽是GLP-1类似物。
[0034]利西拉来以天然毒蜥外泌肽-4序列的C端截短为特征。利西拉来包含毒蜥外泌肽-4中不存在的6个C端赖氨酸残基。直到现在，尚不认为利西拉来是适合于治疗CNS病症(特别是神经变性性疾病)的药物，因为C端赖氨酸残基可以阻止药物通过血脑屏障。目前，没有指示可以通过特定或/和受到调节的机制将利西拉来转运通过血脑屏障。
[0035]在本发明的实施例1中，已经证明了利西拉来与GLP-1类似物利拉鲁肽和毒蜥外泌肽-4 (这两者目前用作2型糖尿病的治疗)相比具有优越的特性:
[0036](a)令人惊讶地，`利西拉来可以穿过血脑屏障。本发明的数据指示转运受到调节，因为高浓度的转运速率限于最大水平。此外，与利拉鲁肽相比，利西拉来在更低的胃肠外剂量时被摄取入脑中。
[0037](b)利西拉来活化脑中的GLP-1受体，并且诱导cAMP生成。令人惊讶地，利西拉来比利拉鲁肽产生更高的cAMP水平，这证明了在相同剂量时在活化GLP-1受体方面的更高效率。
[0038](c)利西拉来可以诱导齿状回中祖细胞的增殖。与毒蜥外泌肽-4或利拉鲁肽相t匕，利西拉来在以相同剂量施用时提供增强的效果。在神经变性性疾病中，这些效果可以构成疾病缓解效果。
[0039](d)在与利拉鲁肽相比时，利西拉来在齿状回中显示优越的神经保护效果(针对细胞应激)。
[0040](e)令人惊讶地，用IOnM剂量利西拉来的预处理足以保护SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激。200ηΜ剂量利拉鲁肽在保护细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激中是必需的，这指示较低剂量的利西拉来足以诱导保护(还可见通过用GLP-1激动剂的预处理获得的实施例2数据)。
[0041]实施例2证明了用利西拉来的后处理足以保护SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞免于2mM甲基乙二醛应激或ImM H2O2应激。比较而言，利拉鲁肽没有保护细胞免于MG或H2O2的应激。
[0042]在实施例3中，利西拉来在经鱼藤酮(rotenone)处理的LUHMES细胞中针对神经变性展现出显著的神经保护效果。与其它GLP-1受体(GLP-1R)激动剂相比，利西拉来提供优点。在经鱼藤酮处理的LUHMES细胞中，利西拉来在比利拉鲁肽低3倍的浓度时显著有活性，该结果支持实施例1的甲基乙二醛模型中看到的出乎意料的卓越活性效果。艾塞那肽(Exenatide)在0.3和I μ M的浓度不引发显著效果。比较而言，利西拉来在这些浓度提供剂量依赖性存活力改善。
[0043]在实施例4中，证明了体内利西拉来处理导致转基因小鼠阿耳茨海默氏病模型的脑中淀粉状蛋白斑负荷的降低。因此，在其神经保护特性外，利西拉来还可以降低脑病理学损伤，诸如淀粉状蛋白斑，并且因此代表一种针对阿耳茨海默氏病的有吸引力的预防或/和治疗。在比由McLean等(2011)先前对利拉鲁肽描述的剂量(25nmolm/kg)更低的剂量(IOnmoI/kg)观察到活性。
[0044]因此，利西拉来适合于治疗或/和预防如本文中描述的神经变性性疾病，例如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病或/和中风。
[0045]本发明的第一个方面是在预防或/和治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物，该组合物包含desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2或/和其药学可接受盐,和任选地药学可接受载体、佐剂、或/和辅助物质。
[0046]本发明的另一个方面是在治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物，该组合物包含desPro36Exendin-4 (1-39)-Lys6-NH2或/和其药学可接受盐,和任选地药学可接受载体、佐剂、或/和辅助物质。
[0047]神经变性性疾病可以是任何神经变性性疾病，特别是与氧化应激、神经突完整性损失、凋亡、神经元损失或/和炎症应答有关的神经变性性疾病。
[0048]在本发明中，神经突完整性损失包括树突棘损失、突触可塑性损失、或/和新代偿性神经突发芽损失(loss of new compensatory neurite sprouting)。
[0049]神经变性性疾病可以与认知损伤有关。
[0050]特别地，神经变性性疾病选自下组:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、路易`体痴呆、帕金森氏病痴呆、癫痫、中风、亨廷顿氏舞蹈症、大脑缺氧、多发性硬化、和周围神经病。周围神经病可以与糖尿病有关。
[0051]优选的是，神经变性性疾病选自下组:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中风。
[0052]也优选的是，神经变性性疾病选自下组:进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、帕金森氏病、和帕金森氏病痴呆。这些疾病中任何一种可以与帕金森综合征(Parkinsonism)有关。
[0053]进行性核上性麻痹和多系统萎缩统称为帕金森叠加综合征(Parkinson-plussyndrome)。
[0054]在本发明中，帕金森综合征是一种以特定症状组合诸如震颤、运动减少、强直或/和姿势不稳定性为特征的神经病学综合征。
[0055]在一个实施方案中，神经变性性疾病是阿耳茨海默氏病。阿耳茨海默氏病可以与氧化应激和神经元损失有关。
[0056]在另一个实施方案中，神经变性性疾病是帕金森氏病。帕金森氏病可以与氧化应激、炎性应答、凋亡、神经元损失(特别是多巴胺能神经元损失，例如导致多巴胺缺乏的黑质中神经元损失)有关。
[0057]神经元损失可以由凋亡引起。
[0058]在另一个实施方案中，神经变性性疾病是进行性核上性麻痹。进行性核上性麻痹可以与神经元损失(特别是多巴胺能神经元损失)有关。[0059]在另一个实施方案中，神经变性性疾病是多系统萎缩。多系统萎缩可以与神经元损失(特别是多巴胺能神经元损失)有关。
[0060]在另一个实施方案中，神经变性性疾病是路易体痴呆。路易体痴呆可以与神经元损失(特别是多巴胺能神经元损失)有关。路易体痴呆可以与帕金森氏病有关。
[0061]在另一个实施方案中，神经变性性疾病是帕金森氏病痴呆。帕金森氏病痴呆可以与神经元损失(特别是多巴胺能神经元损失)有关。特别地，帕金森氏病痴呆与帕金森氏病有关。
[0062]在又一个实施方案中，神经变性性疾病是中风。中风可以与由缺血引起的神经元损失有关，其中缺血可以由阻塞(诸如血栓形成或动脉栓塞)或出血引起。
[0063]在又一个实施方案中，神经变性性疾病是多发性硬化，其可以与CNS中的炎性过程有关。
[0064]本发明的数据证明了(a)利西拉来提供神经保护或/和神经生成效果，和(b)与其它GLP-1激动剂诸如毒蜥外泌肽-4或利拉鲁肽相比，利西拉来是卓越的。如此，利西拉来可以在神经变性性疾病(诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中风)中提供疾病缓解效果。特别地，利西拉来的施用适合于神经变性性疾病的早期阶段中的治疗，因为神经保护和神经生成可以减缓疾病的进展，且由此改善生命质量。
[0065]因此，在本发明的一个方面，神经变性性疾病在早期阶段中。例如，阿耳茨海默氏病可以是早期阶段阿耳茨海默氏病。早期阶段阿耳茨海默氏病(AD)又称作前驱阿耳茨海默氏病或痴呆前阿耳茨海默氏病(Dubois等，2010)。早期阶段阿耳茨海默氏病可以定义为:患者表现出与支持性 生物标志数据或阿耳茨海默氏病病理学有关的客观记忆抱怨:在脑脊液(CSF)中，发现低水平的β_淀粉状蛋白42(Ab42)肽比τ蛋白比率，或者通过淀粉状蛋白PET (正电子发射断层成像术)剂诸如来自Ε.Lilly (Avid)的AmyVid?检出脑中的淀粉状蛋白斑。
[0066]在另一个例子中，帕金森氏病可以是早期阶段帕金森氏病。在又一个例子中，进行性核上性麻痹可以是早期阶段进行性核上性麻痹。在又一个例子中，多系统萎缩可以是早期阶段多系统萎缩。在另一个例子中，路易体痴呆可以是早期阶段路易体痴呆。在一个别的例子中，帕金森氏病痴呆可以是早期阶段帕金森氏病痴呆。
[0067]此外，利西拉来在预防神经变性性疾病中是合适的，特别是在那些怀疑患有神经变性性疾病且没有明确诊断的患者中。在本发明的另一个方面，如本文中描述的药物组合物用于预防神经变性性疾病。
[0068]在本发明的上下文中，desPro36Exendin_4(1-39)-Lys6-NH2 (利西拉来)包括其药学可接受盐。本领域技术人员知道利西拉来的药学可接受盐。本发明中采用的一种优选的利西拉来药学可接受盐是乙酸盐。
[0069]在本发明中，可以以足以诱导治疗效果的量对有此需要的患者施用desPro36Exendin_4 (1-39)-Lys6-NH2 或 / 和其药学可接受盐。
[0070]在本发明中，可以用合适的药学可接受载体、佐剂、或/和辅助物质配制desPro36Exendin_4 (1-39)-Lys6-NH2 或 / 和其药学可接受盐。
[0071]本发明的药物组合物通过如本文中描述的其神经保护和神经再生效果在如本文中描述的神经变性性疾病中提供疾病缓解效果。特别地，可以在治疗如本文中描述的神经变性性疾病中，例如如本文中描述的阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、帕金森氏病痴呆、癫痫、中风、亨廷顿氏舞蹈症、大脑缺氧、多发性硬化、和周围神经病中获得疾病缓解应答。
[0072]本发明的药物组合物可以胃肠外施用，例如通过注射，诸如通过肌肉内或通过皮下注射。合适的注射装置是已知的，例如所谓的“笔”，其包括装有活性成分的药筒和注射针。可以以合适的量(例如以范围为每剂I至50 μ g，每剂5至40 μ g，每剂10至30 μ g，每剂 10 至 15 μ g 或每剂 15 至 20 μ g 的量)施用化合物 desPro36Exendin_4 (1-39) -Lys6-NH2 或/和其药学可接受盐。
[0073]在本发明中，可以以范围为I至50 μ g，范围为5至40 μ g，范围为10至30 μ g，范围为10至20 μ g，范围为10至15 μ g，或范围为15至20yg的日剂量施用化合物desPro36Exendin-4 (1-39)-Lys6-NH2或/和其药学可接受盐。可以通过每日一次注射施用本发明的组合物。
[0074]在本发明中，本发明的组合物可以以液体组合物提供。技术人员已知适合于胃肠外施用的利西拉来液体组合物。本发明的液体组合物可以具有酸性或生理学pH。优选地，酸性pH在ρΗΙ-6.8，ρΗ3.5-6.8，或ρΗ3.5-5的范围中。优选地，生理学pH在ρΗ2.5-8.5，pH4.0-8.5，或ρΗ6.0-8.5的范围中。可以通过药学可接受稀释酸(通常为HCl)或药学可接受稀释碱(通常为NaOH)调节pH。
[0075]本发明的液体组合物可以包含合适的防腐剂。合适的防腐剂可以选自:酹、间甲酚、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯。一种优选的防腐剂是间甲酚。
[0076]本发明的液体组合物可以包含张度剂。合适的张度剂可以选自:甘油、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、NaCl、含有钙或镁的化合物诸如CaCl2。甘油、乳糖、山梨糖醇、甘露醇和葡萄糖的浓度可以在100-250mM的范围内。NaCl的浓度可以高达150mM。一种优选的张度剂是甘油。
`[0077]本发明的液体组合物可以包含0.5 μ g/mL至20 μ g/mL,优选I μ g/ml至5 μ g/ml的甲硫氨酸。优选地，液体组合物包含L-甲硫氨酸。
[0078]本发明的又一个方面涉及用于预防或/和治疗如本文中描述的医学适应症的方法。例如，所述方法可以包括施用如本文中描述的药物组合物。所述方法可以是用于预防或/和治疗如本文中描述的神经变性性疾病的方法。
[0079]特别地，如本文中描述的方法例如通过神经保护或/和神经生成引发疾病缓解应答。
[0080]在本发明的方法中，通过施用如本文中描述的药物组合物在如本文中描述的神经变性性疾病中提供通过其神经保护和神经再生效果的疾病缓解疗法。特别地，可以在治疗如本文中描述的神经变性性疾病中，例如在如本文中描述的阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、帕金森氏病痴呆、癫痫、中风、亨廷顿氏舞蹈症、大脑缺氧、多发性硬化、和周围神经病中获得疾病缓解应答。
[0081]在本发明的方法中，施用治疗有效量的如本文中描述的药物组合物。
[0082]本发明的又一个方面涉及如本文中描述的组合物用于制造供治疗如本文中描述的医学适应症用的药物的用途。例如，本发明的组合物可以用于制造药物，该药物用于预防或/和治疗如本文中描述的神经变性性疾病。[0083]本发明通过以下实施例和图进一步例示。
[0084]附图简述
[0085]图1。(A)在1.p.盐水媒介物(0.9%w, v NaCl)或1.p.利西拉来(2.5，25或250nmol/kg体重)注射后30分钟时在野生型雌性小鼠(n=5，平均年龄24周)的脑中测量的总利西拉来浓度(pmol/L)。数值是均值土S.E.M。*p<0.05,**p<0.010 (B)在1.p.盐水媒介物(0.9%w, V NaCl)或1.p.利西拉来(2.5，25或250nmol/kg体重)注射后3小时时在野生型雌性小鼠(n=5，平均年龄24周)的脑中测量的总利西拉来浓度(pmol/L)。数值是均值土S.E.M。*ρ〈0.05。
[0086]图2。(A)在1.ρ.盐水媒介物(0.9%w, v NaCl)或1.p.利拉鲁肽(2.5，25或250nmol/kg体重)注射后30分钟时在野生型雌性小鼠(n=5)的脑中测量的总利拉鲁肽浓度(pmol/L)。数值是均值土S.E.M0 *p<0.05，**ρ〈0.01。(B)在 1.p.盐水媒介物(0.9%w, vNaCl)或1.p.利拉鲁肽(2.5，25或250nmol/kg体重)注射后3小时时在野生型雌性小鼠的脑中测量的总利拉鲁肽浓度(pmol/L)。数值是均值土S.E.M。*p〈0.05。
[0087]图3。(A)与对照相比,分析前30分钟注射25nmol/kg bw利拉鲁肽ip.显示脑中cAMP的显著增加(p〈0.05 ;t检验)。(B)与对照相比,分析前30分钟注射25nmol/kg bw利西拉来ip.显示脑中cAMP的显著增加(p〈0.01;t检验)。(C)在直接比较利拉鲁肽与利西拉来的效果时，发现药物间的显著差异(p〈0.05 ;t检验)。
[0088]图4。毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽或利西拉来25nmol/kg bw.每日一次注射3周对齿状回中细胞增殖(BrdU染色)的影响。数值是均值土S.E.M。*p<0.05,**p<0.010与毒蜥外泌肽-4和利拉鲁肽(p〈0.05) 及对照(p〈0.01)相比，利西拉来显示升高的细胞增殖活性。
[0089]图5。对利西拉来ip.每日一次持续3周(25nmol/kg bw ip.)的长期注射的组织学分析。在BrdU免疫组织学分析中，在齿状回脑区中发现较多的新细胞。还有，发现较多的幼神经元(双重皮质激素(cortin)染料)。数值是均值土S.E.M。*=ρ〈0.05广=ρ〈0.01。
[0090]图6。(A)LDH测定法。用利西拉来预处理SH-SY5Y细胞，接着是甲基乙二醛应激(_〈0.0001)。IOnM剂量利西拉来在保护细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激中是足够的。(B)LDH测定法。用利拉鲁肽预处理SH-SY5Y细胞，接着是甲基乙二醛应激rρ〈0.05，**ρ<0.001,***ρ<0.0001)。200ηΜ剂量利拉鲁肽在保护细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激中是足够的。较低剂量IOnM或IOOnM显示没有效果。
[0091]图7。在甲基乙二醛(MG)和过氧化氢(H2O2)处理后用利西拉来或利拉鲁肽的应激后处理。X轴指各种测定条件，而Y轴代表吸光度。*=p〈0.05，#=p〈0.()l。(A)利西拉来后处理，(B)利拉鲁肽后处理。
[0092]图8。用利西拉来或利拉鲁肽预处理，接着是甲基乙二醛(MG)应激。X指各种测定条件，而Y轴代表吸光度。*=p〈0.()5，m=p〈().(K)l。(A)利西拉来、⑶利拉鲁肽和(C)毒蜥外泌肽-4的预处理效果。
[0093]图9。在存在多个浓度的利西拉来的情况中LUHMES细胞的神经保护(表示为通过鱼藤酮暴露诱导的标准化细胞存活力降低的百分比反转)。Rot.=鱼藤酮。NS=不显著；*=ρ〈0.05 ;***=ρ〈0.001。
[0094]图10。在存在多个浓度的毒蜥外泌肽-4/艾塞那肽的情况中LUHMES细胞的神经保护(表示为通过鱼藤酮暴露诱导的标准化细胞存活力降低的百分比反转)。Rot.=鱼藤酮。NS=不显著。*=ρ<0.05 ο
[0095]图11。在存在多个浓度的利拉鲁肽的情况中LUHMES细胞的神经保护(表示为通过鱼藤酮暴露诱导的标准化细胞存活力降低的百分比反转)。Rot.=鱼藤酮。NS=不显著；***=ρ〈0.001。
[0096]图12。利西拉来处理降低阿耳茨海默氏病转基因小鼠的脑中的淀粉状蛋白斑负荷。7月龄APP/PS1转基因小鼠中持续70天的利西拉来处理(lOnmol/kg，1.p.，每日)降低脑中的β淀粉状蛋白斑负荷，如通过β淀粉状蛋白免疫组织化学及测定脑皮层的横截面中对β淀粉状蛋白呈阳性的％面积量化的。数值是均值+/-SEMfSK0.01)。
[0097]图13。利西拉来处理降低阿耳茨海默氏病转基因小鼠的脑中的淀粉状蛋白斑负荷。7月龄APP/PS1转基因小鼠(阿耳茨海默氏病模型)中持续70天的利西拉来处理(10nmol/kg，1.p.，每日)降低脑中的成熟淀粉状蛋白斑负荷，如通过用刚果红的组织学染色及测定脑皮层的横截面中对刚果红呈阳性的％面积量化的。数值是均值+/-SEM(*=p〈0.05)。
[0098]实施例1
[0099]利西拉来是一种通常胃肠外施用的肽药物。为了引发针对神经变性性疾病(诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、帕金森氏病痴呆或中风)的活性，利西拉来必须穿过血脑屏障。若利西拉来提供下列一项或多项特征，则利西拉来(特别在胃肠外施用时)适合于治疗或/和预防神经变性性疾病:
[0100](a)利西拉来可以穿过血脑屏障，
[0101](b)利西拉来活化脑中的GLP-1受体，并且通过受体活化诱导生理学效果，
`[0102](c)利西拉来在合适的模型中提供疾病缓解效果，
[0103](d)利西拉来在合适的模型中是神经保护的，以及
[0104](e)利西拉来相对于其它GLP-1受体激动剂诸如利拉鲁肽或艾塞那肽提供优点。
[0105]脑的利西拉来摄取
[0106]在本实施例中，描述了 GLP-1受体激动剂利西拉来是否穿过血脑屏障(BBB)。测试3 种剂量(2.5nmol/kg bw, 25nmol/kg bw 和 250nmol/kg bw, ip.)，并且检查注射后 30 分钟和3小时的小鼠脑组织中找到的水平。利西拉来水平在用所有剂量投递后30分钟升高，并且用低(2.5nmol/kg bw)和中等水平(25nmol/kg bw)两者而非高剂量250nmol/kg bw利西拉来也检出。此差异提示了利西拉来进入脑的转运受到调节，限制本文测试的高浓度的利西拉来的流入(图1)。
[0107]脑中利西拉来摄取与利拉鲁肽摄取的比较
[0108]将上文关于利西拉来的结果与那些关于GLP-1激动剂利拉鲁肽(Novo Nordisk的Victoza)的结果比较。如上文讨论及图1和2中显示的，利西拉来水平在最低剂量
2.5nmol/kg bw ip.时在脑中显示显著升高,而利拉鲁肽在此剂量时没有显示升高(图2),这提示了利西拉来比利拉鲁肽在更低的浓度时被摄取入脑中。
[0109]从此发现得出结论，与利拉鲁肽相比，利西拉来需要更低剂量的利西拉来以通过血脑屏障，从而与利拉鲁肽相比，它可以在更低的剂量对如本文中描述的神经变性性疾病施加治疗效果。
[0110]脑中的GLP-1受体活化/cAMP生成[0111]初步研究已经显示了利西拉来活化胰GLP-1受体，这与CAMP水平升高相联系(关于综述，见例如Doyle等，2007)。
[0112]在本实施例中，已经第一次显示了注射利西拉来1.p.增加脑中的cAMP量，指示利西拉来活化脑中的GLP-1受体(图3b)。图3c中显示了利西拉来(25nmol/kg bw 1.p.)和利拉鲁肽(25nmol/kg bw 1.p.,关于结果,见图3a)对GLP-1受体的影响的直接比较。利西拉来在相同剂量时比利拉鲁肽产生显著更高的cAMP水平(*=ρ〈0.05)，这证明了利西拉来的
更闻效率。
[0113]利西拉来在脑中的神经生成效果/疾病缓解效果
[0114]调查利西拉来1.p.、毒蜥外泌肽_41.p.和利拉鲁肽1.p.持续3周的长期注射对神经元祖干细胞增殖的影响。发现齿状回中增强的干细胞增殖(BrdU染料，图4和5)。令人惊讶地，在与毒蜥外泌肽-4或利拉鲁肽相比时，利西拉来具有显著增强的细胞增殖C=P<0.05)，这指示在以相同剂量注射时，利西拉来比毒蜥外泌肽-4和利拉鲁肽在脑中更有效。
[0115]另外，在与利拉鲁肽相比时，齿状回中的幼神经元数目在利西拉来注射后增加(双重皮质激素染料，数据未显示)，这指示祖细胞分化成神经元。这证明了利西拉来诱导持久的改善。
[0116]利西拉来对干细胞的这些影响(增殖和分化)是脑修复的一个重要方面，因此这些效果可以在神经变性性疾病(诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中风)中提供疾病缓解效果。
[0117]利西拉来在脑中的神经保护效果
[0118]在神经元细胞培养研究中，已经测试了利西拉来以调查它在细胞应激条件中是否具有神经保护效果。使用毒性药物甲基乙二醛来降低细胞存活。利西拉来的添加以剂量依赖性方式显示神经保护效果(图6a)，在最低浓度的甲基乙二醛的情况中在所有剂量提供100%保护，且即使在测试的最高浓度的甲基乙二醛的情况中维持保护。IOnM剂量利西拉来在保护细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激中是足够的。
[0119]另外，利西拉来与利拉鲁肽相比显示优越的保护。在图6b中，显示了利拉鲁肽在IOnM的剂量时不能保护细胞。为了保护细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激需要200nM剂量利拉鲁肽，更低剂量10或IOOnM显示没有效果。
[0120]材料和方法
[0121]脑中cAMP的测量
[0122]动物
[0123]使用雌性野生型(C57BL/6背景)小鼠，每组5只。对于cAMP测量，给小鼠1.p.注射25nmol/kg体重(bw)利拉鲁肽、利西拉来或作为对照的盐水(0.9%w.v.)，在两个分开实验中。注射后30分钟，将小鼠脑立即取出，并快速冷冻。
[0124]cAMP的组织提取
[0125]使用0.1M HCI提取每个脑。对每g组织添加IOml0.1M HC10将样品超声处理，然后以10，OOOrpm于4°C离心15分钟。将上清液倒出，并直接用于通过直接cAMP ELISA试剂盒(Enzo Life Sciences)测量。使用试剂盒中提供的0.1MHCl生成稀释液。
[0126]免疫组织化学[0127]对动物施用BrdU(180mg/kg bw; 1.p.),之后18小时用戍巴比通(0.3ml; Euthanal, Bayer AG, Leverkusen,德国)麻醉，并用PBS,接着用4%低聚甲醒穿心灌注。将脑取出，并放入PBS中的30%蔗糖中过夜。对45μπι自由浮动切片实施BrdU或双重皮质激素(DCX)方面的免疫组织化学。通过在3%过氧化氢中温育切片淬灭内源过氧化物酶活性。DNA的变性牵涉在2Ν HCI，接着是0.1M硼砂中温育10分钟。将切片在针对BrdU的一抗(1:200，小鼠单克隆抗BrdU，Sigma)或者用于DCX的山羊多克隆抗双重皮质激素(1:200，Santa Cruz, USA, sc_710)中于4°C温育过夜。然后，应用二抗(1:200，马抗小鼠，Vector精华ABC试剂盒,小鼠,Vector laboratories)。将切片在亲合素生物素酶试剂中温育，并在Vector SG底物发色团中温育(关于详情，见Gengler等.2010)。
[0128]显微术
[0129]使用体视学技术,使用Olympus CX40显微镜分析切片。这牵涉随机开始切片，并且收集每第5个贯穿齿状回(DG)的颗粒细胞层(GCL)的切片。使用40倍物镜实施分析，并且使用5.1MPix数字照相机拍摄代表性图像。对于每个药物组，分析4-6个小鼠脑。对每个脑采集8和12个之间的切片。分析的脑区范围为-1.3至-2.5mm前囟。使用ImageJ软件(NIH的免费软件，http://rsbweb.nih.govl/i j/)计数DG中的所有阳性细胞。在GCL中，计数在BrdU或DCX方面呈阳性的细胞。
[0130]SH-SY5Y 细胞系
[0131]SH-SY5Y是一种三次克隆的人成神经细胞瘤细胞系，其在1970年从4岁女性中的转移性成神经细胞瘤部位的骨髓活组织检查建立。这些细胞是有多巴胺β羟化酶活性的，乙酰胆碱能的，谷氨酸能的且腺苷能的。SH-SY5Y细胞以漂浮的和粘附的细胞的混合物生长以及形成具有多个短的精致细胞过程的成神经细胞性细胞簇。视黄酸和胆固醇处理可以迫使细胞生长出树突并分化。
[0132]用利西拉来或利拉鲁肽预处理SH-SY5Y细胞，接着是甲基乙二醛应激
[0133]将SH-SY5Y细胞在Dulbecco氏极限必需培养基中培养，并在湿润的，5%C02，37°C培养箱中温育，所述Dulbecco氏极限必需培养基具有F12 (1:1)和Glutamax，且补充有10%热灭活(于56°C加热20分钟)胎牛血清及青霉素和链霉素。将细胞在80%汇合时用胰蛋白酶处理，并在通过锥虫蓝排除法(Countess, Invitrogen)计数细胞后，将2xl04个细胞在经层粘连蛋白包被的96孔板(Nunc，Inc)中以95%细胞存活力分配。在细胞附着12小时后，将细胞用10nM、100nM和200nM不同剂量的利西拉来或利拉鲁肽预处理，接着以浓度300μΜ、600μΜ和1200 μ M在无血清培养基中添加应激物甲基乙二醛(图6Α和6Β)。通过PRISM5.0C (GraphPad Software, Inc.)分析数据，并且显著性定义为小于0.05或更小的p值。
[0134]利西拉来或利拉鲁肽预处理对经过过氧化氢应激的SH-SY5Y细胞的影响
[0135]将细胞用IOnM和IOOnM利拉鲁肽或利西拉来预处理，接着以浓度200 μ Μ、400 μ M和800 μ M在无血清培养基中添加应激物过氧化氢。
[0136]LDH测定法
[0137]使用灵敏性乳酸-脱氢酶(LDH)测定法(Sigma)分析细胞培养液。LDH测定法经由总胞质LDH或者通过膜完整性(其作为释放入培养基中的胞质LDH量的函数)提供死细胞数目的测量。释放的LDH的测量基于通过LDH作用的NAD还原。在四唑染料的化学计量转化中使用所得的还原性NAD (NADH)。通过比色法测量最终有色化合物。
[0138]汇总
[0139]本实施例的数据证明了利西拉来适合于治疗或/和预防神经变性性疾病，诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、帕金森氏病痴呆或中风。此外，利西拉来与GLP-1类似物利拉鲁肽和毒蜥外泌肽-4 (这两者目前用作2型糖尿病的治疗)相比具有优越的特性。
[0140]特别地，本实施例的数据证明了:
[0141](a)令人惊讶地，利西拉来可以穿过血脑屏障。本发明的数据指示转运受到调节，因为高浓度的转运速率限于最大水平。此外，与利拉鲁肽相比，利西拉来在更低的胃肠外剂量时被摄取入脑中。
[0142](b)利西拉来活化脑中的GLP-1受体，并且诱导cAMP生成。令人惊讶地，利西拉来比利拉鲁肽产生更高的cAMP水平，这证明了在相同剂量时在活化GLP-1受体方面的更高效率。
[0143](c)利西拉来可以诱导齿状回中祖细胞的增殖。令人惊讶地，与毒蜥外泌肽-4或利拉鲁肽相比，利西拉来在以相同剂量施用时提供增强的效果。在神经变性性疾病中，这些效果可以构成疾病缓解效果。
[0144](d)令人惊讶 地，在与利拉鲁肽相比时，利西拉来在齿状回中显示优越的神经保护效果(针对细胞应激)。
[0145](e)令人惊讶地，用IOnM剂量利西拉来的预处理足以保护SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激。200ηΜ剂量利拉鲁肽在保护细胞免于1200 μ M甲基乙二醛应激中是必需的，这指示较低剂量的利西拉来足以诱导保护。
[0146]实施例2
[0147]甲基乙二醛(MG)和过氧化氢(H2O2)处理后用利西拉来或利拉鲁肽的应激后处理
[0148]将SHSY-5Y细胞在96孔板中接种，并在血清饥饿12小时后，用600 μ M和ImM H2O2和ImM和2mM MG应激3小时。用O, I, 10，50和IOOnM利西拉来和O, 10，50，100和200nM利拉鲁肽处理细胞。24小时后，添加50 μ L XTT试剂，并温育8小时。测定体积是100 μ L。
[0149]图7证明了用利西拉来的后处理以剂量依赖性方式显著增加用MG或H2O2应激后的存活细胞数目(特别见图7Α中用600 μ M H2O2，和2mM MG获得的数据)。利拉鲁肽没有保护细胞免于MG或H2O2的应激(图7B)。
[0150]用利西拉来或利拉鲁肽的预处理，接着是甲基乙二醛(MG)应激
[0151]将SHSY-5Y细胞在96孔板中接种，并且在血清饥饿12小时后，用0，I, 10，50和IOOnM利西拉来和0，10，50，100和200nM利拉鲁肽和毒蜥外泌肽_4处理4小时，之后用400 μ M和600 μ M MG应激14小时。添加50 μ L XTT试剂，并将板温育8小时。
[0152]图8证明了在MG或H2O2应激前用利西拉来预处理以剂量依赖性方式显著增加存活细胞的数目，以最低剂量InM开始，50ηΜ时结果最佳(图8Α)。利拉鲁肽也保护细胞，但是仅于较高剂量IOOnM时(图8Β)。毒蜥外泌肽_4没有保护细胞免于MG或H2O2的应激(图8C)。
[0153]材料和方法
[0154]使用甲基乙二醛作为应激物用SHSY-5Y细胞的预处理测定法[0155]1.将 SHSY-5Y 细胞在具有 10%FBS (产品目录编号 10437，Invitrogen Inc.)和 1%青霉素链霉素(产品目录编号15070063，Invitrogen Inc.)的DMEM+F12Glutamax培养基(产品目录编号313310，Invitrogen Inc.)中维持。
[0156]2.将80-90%汇合的培养物使用0.25倍胰蛋白酶EDTA溶液进行胰蛋白酶处理，并且在96孔板(产品目录编号55301，Orange Scientific)中接种，所述96孔板先前用用层粘连蛋白(L2020，Sigma)以I μ g/cm2的浓度于37°C在CO2培养箱中包被2小时，并且用无菌双蒸水清洗2次。
[0157]3.在12-15小时后，对于接着的12小时，将培养基从含有10%FBS更换成无血清培养基(SFM)。
[0158]4.将细胞用肠降血糖素预处理4小时，在不同浓度的150 μ I体积形式中实施测定法,并将新鲜的SFM添加至对照，持续4小时。
[0159]5.用I倍HBSS和150 μ 1600 μ M甲基乙二醛(产品目录编号Μ0252，Sigma)清洗孔，并分别对测试孔和对照添加SFM，持续12小时。
[0160]6.将上清液收集以实施LDH测定法，并于_20°C贮存。
[0161]7.将75μ1 XTT溶液(产品目录编号11465015001，Roche Inc.)(含有偶联剂)添加至剩余的细胞，并于37°C温育4小时。该测定法基于代谢活性细胞将四唑盐XTT还原成有色化合物的能力，这可以通过吸光度测量测定。升高的吸光度指示增加的代谢活性细胞数目。
[0162]8.通过于492nm和690nm测量每个孔并从A492扣除A69tl获得吸光度。
[0163]9.对于LDH(产品目`录编号G1780，Promega)测定法，将50 μ I上清液与50 μ I底物一起添加至96孔板，并在黑暗中于室温温育60分钟。
[0164]10.添加50 μ I停止溶液，并于490nm测量吸光度。
[0165]11.使用Prism V分析XTT和LDH测定法的数据。
[0166]汇总
[0167]实施例2的数据证明了利西拉来适合于治疗或/和预防神经变性性疾病，诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、帕金森氏病痴呆或中风。此外，与GLP-1类似物利拉鲁肽和艾塞那肽相比，利西拉来具有优越的特性。
[0168]用IOnM剂量利西拉来的预处理足以保护SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞免于600 μ M甲基乙二醛应激。100ηΜ-200ηΜ剂量利拉鲁肽足以保护细胞免于600 μ M甲基乙二醛应激，这指示较低剂量的利西拉来足以诱导保护。如此，利西拉来适合于预防如上文指定的疾病。这些数据与实施例1中获得的数据一致(图6Α和B)，这证明了在与利拉鲁肽相比时，利西拉来在SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞中显示优越的神经保护效果(针对细胞应激)。
[0169]此外，用利西拉来的后处理足以保护SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞免于2mM甲基乙二醛应激或ImM H2O2应激。比较而言，利拉鲁肽没有保护细胞免于MG或H2O2的应激。
[0170]实施例3
[0171]用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂利西拉来处理保护人神经元细胞免于
鱼藤酮毒性。
[0172]在此实施例中，描述了细胞模型中的神经保护实验，其支持在治疗帕金森氏病、帕金森氏病痴呆、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、和路易体痴呆中使用利西拉来。实施例证明了利西拉来可以通过保护此疾病中易受攻击的神经元来减缓，阻滞或反转帕金森氏病、帕金森氏病痴呆、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、和路易体痴呆的进展。这些疾病与利用多巴胺作为神经递质的神经元的损失有关。
[0173]实施例涉及使用人细胞系的体外培养测定法，所述人细胞系本质上是多巴胺能的，称作Lund人中脑神经元(LUHMES细胞)。这些细胞记载于Lotharius等(2002)。将来自这些细胞的培养物在体外暴露于鱼藤酮，已知鱼藤酮杀死多巴胺能细胞并且与对人偶然或环境暴露后的帕金森氏病有关。鱼藤酮与帕金森氏病的关联记载于Sherer等，2003及Tanner等，2011。鱼藤酮可以如下引起帕金森综合征，这通过杀死多巴胺生成神经元来实现，由此在实验中再现人帕金森氏病的主要特征。
[0174]在本实施例中，胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂利西拉来在LUHMES细胞中展现出针对由鱼藤酮诱发的神经变性的显著神经保护效果(图9)。与其它GLP-1受体(GLP-1R)激动剂相比，利西拉来提供优点。利西拉来在LUHMES细胞中针对鱼藤酮的神经保护效果在比利拉鲁肽低3倍的浓度时显著有活性(图9和11)，该结果支持先前在实施例1的甲基乙二醛模型中看到的利西拉来的出乎意外的卓越活性效果。
[0175]艾塞那肽在0.3μΜ或I μΜ的浓度不诱导改善的存活力。比较而言，利西拉来在这些浓度提供显著的存活力改善(图9和10)。
[0176]材料和方法
[0177]为了评估针对鱼藤酮的神经保护，将LUHMES细胞于37°C在湿润的95%空气，5%C02气氛中在标准细胞培养培养基中培养。在塑料烧瓶中培养2天后，添加含有生长因子的分化培养基，并将细胞再温育2天。将细胞解离，并接种入经包被的多孔板中，并添加新鲜的分化培养基，再持续4 天。分化的第6天，将细胞用多个浓度的利西拉来、艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4)或利拉鲁肽处理I小时，之后用鱼藤酮(0.75μΜ)处理。用基于刃天青的测定法(一种经由细胞氧化-还原生成荧光产物的有代谢活性的细胞的指示剂)在72小时后测量神经保护。产生的荧光与培养物中的活细胞数目成比例，并且如此测量通过处理提供的对神经元LUHMES细胞的保护程度。在相对于没有鱼藤酮的对照标准化细胞存活力读出后比较来自η=12次测量的数据。使用单因素方差分析，接着是Dunnett氏检验来进行实验组间的统计学比较。认为数值Ρ〈0.05是显著的，并且在图中如下以星号表示:*=Ρ<0.05;**=ρ<0.01;***=ρ<0.001 ;NS=不显著。神经保护表示为由鱼藤酮诱导的存活力降低的百分比反转。
[0178]汇总
[0179]实施例3的数据证明了利西拉来适合于治疗或/和预防神经变性性疾病，诸如帕金森氏病、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、路易体痴呆、帕金森氏病痴呆或中风。此外，与GLP-1类似物利拉鲁肽和毒蜥外泌肽-4相比，利西拉来具有优越的特性。
[0180]在本实施例中，利西拉来在LUHMES细胞中展现出针对由鱼藤酮诱导的神经变性的显著神经保护效果(图9)。与其它GLP-1受体(GLP-1R)激动剂相比，利西拉来提供优点。在经鱼藤酮处理的LUHMES细胞中，利西拉来在比利拉鲁肽低3倍的浓度显著有活性。在浓度0.3 μ M或I μ M艾塞那肽，不能观察到显著效果。比较而言，利西拉来在这些浓度时提供剂量依赖性存活力改善。
[0181]实施例4:利西拉来在APPswe/PSl.转基因小鼠中的效果。[0182]为了进一步证明利西拉来对于治疗神经变性性疾病诸如阿耳茨海默氏病的利益，在本实施例中，描述了利西拉来处理在其脑中携带淀粉状蛋白斑的转基因小鼠中的效果。APP_/PSUE9转基因小鼠是一种充分表征的阿耳茨海默氏病模型，其显示淀粉状蛋白脑病理学。在7月龄APP/PS1转基因小鼠中在淀粉状蛋白斑已经在脑中形成的龄期启动利西拉来处理(10nmol/kg，1.p.,每日)，并且持续70天。
[0183]转基因动物
[0184]具有C57B1/6 背景的 APPswe/PS]^E9 小鼠获自 Jackson 实验室(http://research.jax.0rg/reposi tory/Alzheimer s.html)。将杂合雄性与本地购买的野生型C57/B16雌性(Harlan，UK)育种。对后代进行耳冲孔，并用对APP序列特异性的引物(正向“GAATTCCGACATGACTCAGG, SEQ ID N0:4”，反向:“GTTCTGCTGCATCTTGGACA, SEQ ID NO: 5”)使用PCR测定基因型。使用不表达转基因的小鼠作为野生型对照。在所有研究中使用雄性动物。将动物个别笼养，并且按12/12光照-黑暗周期(光照在08h00时开启，在20h00时关闭)，在温度受控房间(T:21.5°C ±1)中维持。食物和水任意可得到。将动物每日处理2周，之后开始研究。
[0185]用利西拉来的处理
[0186]小鼠在开始处理时为7月龄。在该时间时，小鼠已经显示淀粉状蛋白脑病理学。给小鼠每日一次腹膜内(1.P.)注射利西拉来(10nmol/kg体重)或盐水(0.9%w/v)达70天。UK内政部依照1986年动物(科学规程)法案许可实验。
[0187]利西拉来由Sanofi提供。将冻干的肽在Mill1-Q水中以浓度lmg/ml重建。将等分试样在冷冻机中贮存，并在0.9%注射用盐水中重建。
[0188]组织学制备
[0189]对动物穿心灌注PBS缓冲液，接着是PBS中冰冷的4%低聚甲醛。将脑取出，并在4%低聚甲醒中固定至少24小时,之后转`移至30%鹿糖溶液过夜。然后,使用Envirofreez?将脑快速冷冻，并使用Leica低温恒温器在-2至_3前因深度切出40微米厚度的皮层切片。依照体视学规则选择切片，随机采集第一个切片，然后采集每第6个切片。
[0190]使用标准方法(关于详情，见McClean等，2011),使用家兔多克隆抗淀粉状蛋白β肽(1:200, Invitrogen, UK, 71-5800)染色β淀粉状蛋白，并使用刚果红染色密集核心斑。通过对每个切片拍摄2张皮层图像(使用10倍物镜)分析β淀粉状蛋白和刚果红(每个脑具有7-10个切片；η=6 (对于利西拉来10nmol/kg bw),n=12 (对于盐水))。通过AxioScopel (Zeiss,德国)显现所有染色，并使用具有Image J(NIH, USA)的多阈值插入进行分析。
[0191]结果
[0192]在启动处理时已经携带淀粉状蛋白脑病理学的APPswe/PSl ΔΕ9转基因小鼠中，与用盐水处理的小鼠相比，利西拉来处理70天导致β淀粉状蛋白斑负荷降低62%，如通过β淀粉状蛋白免疫反应性测量的(Ρ〈0.0039 ;重复测量t检验)(图12)。
[0193]类似地，与相应的用盐水处理的APP/PS1小鼠相比，利西拉来处理将密集核心淀粉状蛋白斑负荷降低52%，如通过刚果红组织学染色量化的(p=0.0419;重复测量t检验)(图 13)。
[0194]在比先前对利拉鲁肽描述的剂量(25nmolm/kg, McClean等，2011)低的剂量(IOnmoI/kg)观察到活性。
[0195]汇总
[0196]使用两种独立技术得到的这些数据证明了利西拉来可以降低阿耳茨海默氏病动物模型中的脑淀粉状蛋白病理学。数据证明了利西拉来适合于通过降低脑淀粉状蛋白斑病理学来治疗或/和预防神经变性性疾病，诸如阿耳茨海默氏病。因此，在其神经保护特性外，利西拉来可以降低病理学损伤诸如淀粉状蛋白斑，并且因此代表一种针对阿耳茨海默氏病的有吸引力的治疗或/和预防。此外，如从实施例1的数据预期的，在比先前对GLP-1类似物利拉鲁肽描述的那些剂量低的剂量实现活性。
[0197]参考文献
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【权利要求】
1.一种在预防或/和治疗神经变性性疾病中使用的药物组合物，所述组合物包含desPro36Exendin-4 (1-39)-Lys6-NH2或/和其药学可接受盐,和任选地药学可接受载体、佐剂、或/和辅助物质。
2.依照权利要求1使用的药物组合物，其中所述desPro36Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2或/和其药学可接受盐制备用于胃肠外施用。
3.依照前述权利要求中任一项使用的药物组合物，其中所述神经变性性疾病牵涉氧化应激、神经突完整性损失(loss of neurite integrity)、凋亡、神经元损失(neuronalloss)或/和炎症应答。
4.依照前述权利要求中任一项使用的药物组合物，其中所述神经变性性疾病与认知损伤有关。
5.依照前述权利要求中任一项使用的药物组合物，其中所述神经变性性疾病选自下组:阿耳茨海默(Alzheimer)氏病、帕金森(Parkinson)氏病、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy, PSP)、多系统萎缩(multiple system atrophy, MSA) >路易体痴呆(Lewy body dementia)、帕金森氏病痴呆癫痫、中风、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington，s Chorea)、大脑缺氧(cerebral hypoxia)、多发性硬化(multiplesclerosis)、和周围神经病(peripheral neuropathy)。
6.依照权利要求5使用的药物组合物，其中周围神经病与糖尿病有关。
7.依照权利要求5使用的药物组合物，其中所述神经变性性疾病选自下组:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中风。
8.依照权利要求5使用的药物组合物，其中所述阿耳茨海默氏病是早期阶段阿耳茨海默氏病。
9.依照权利要求5使用的药物组合物，其中所述帕金森氏病是早期阶段帕金森氏病。
10.依照前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2或/和其药学可接受盐制备用于以选自10 μ g至20 μ g范围的日剂量(daily dose)施用。
11.一种用于预防或/和治疗神经变性性疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用权利要求1至10中任一项的组合物。
12.权利要求11的方法，其中所述神经变性性疾病选自下组:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中风。
13.权利要求11或12的方法,其中所述组合物引发疾病缓解应答(disease-modifyingresponse)。
【文档编号】A61P25/28GK103813801SQ201280038987
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年9月3日 优先权日:2011年9月1日
【发明者】S.赫斯, C.霍尔舍, A.贝姆, A.米纳特, L.普拉蒂尔, V.陶平 申请人:赛诺菲-安万特德国有限公司, 阿尔斯特大学