促进β-β交联的制备含热稳定的氧载体的组合物的方法
【专利摘要】本发明提供有利于β-β交联的制备含热稳定的基于血红蛋白的氧载体的药物组合物的方法。使用本发明的方法，可控制得到的分子的氧亲和力，从而使得可产生经调整用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。产生了高度纯化的和热稳定的交联非聚合的四聚血红蛋白，所述四聚血红蛋白具有大于40-60％的β-β交联并且适用于哺乳动物而不会引起肾损伤和血管收缩。进行高温和短时间(HTST)热加工步骤以有效地去除任何不需要的二聚血红蛋白、未交联的四聚血红蛋白和血浆蛋白质杂质。
【专利说明】促进β-β交联的制备含热稳定的氧载体的组合物的方法
[0001]著作权声明/许可
[0002]本专利文献的部分公开内容含有受著作权保护的内容。著作权所有者不反对任何人对本专利文件或专利公开内容如其在美国专利和商标局的专利文件或档案中所出现的那样进行原样复制，然而在其它情况下保留所有著作权权利。以下声明适用于如下文和其附带的附图中所述的方法、实验和数据:版权? 2011, Billion King International有限公司，保留著作权所有。
[0003]相关申请的交叉参考
[0004]本申请是国际专利申请，本申请要求于2011年8月31日提交的临时美国专利申请61/529，279、2011年9月6日提交的美国部分接续申请13/225，797和2011年10月18日提交的现为专利US8，106，011的美国部分接续申请13/275，366的优先权，这些申请的全部公开内容均以引用方式并入本文中。
【技术领域】
[0005]本发明涉及有利于交联的制备含热稳定的氧载体的药物组合物的方法。使用本发明的方法，可控制得到的分子的氧亲和力，从而使得可产生经调整用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。
【背景技术】
[0006]血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统与组织之间的气体交换发挥重要作用。其负责通过血液循环将氧从呼吸系`统运送到体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离到呼吸系统，在此处呼出二氧化碳。由于血红蛋白具有此氧运输特征，因此如果其可以在离体状态下被稳定化并且在体内使用，则可将其用作有效的氧供体。
[0007]天然存在的血红蛋白是在红细胞内存在时通常稳定的四聚体。然而，当天然存在的血红蛋白从红细胞中去除时，其在血浆中变得不稳定并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体中的每一个的分子量约为32kDa。这些二聚体在经肾脏过滤并排泄时可导致实质性肾损伤。四聚体键的断裂也会负面地影响循环中的功能性血红蛋白的持续性。
[0008]为了解决所述问题，最近在血红蛋白加工方面的发展已经引入了各种交联技术来产生四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧，并且因此不能氧合组织。因此，现有技术所教导的导致形成聚合血红蛋白的交联是有问题的。在本领域中需要允许分子内交联从而产生稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术。
[0009]现有技术为稳定血红蛋白而进行的尝试所存在的其它问题包括产生包含不可接受的高百分比的二聚体单元的四聚血红蛋白(或如果给予患者则会快速解离成二聚血红蛋白的未交联的四聚血红蛋白)；二聚体的存在使血红蛋白组合物不能令人满意地给予哺乳动物。二聚形式的血红蛋白可导致哺乳动物机体的严重肾损伤；此肾损伤可严重到足以导致死亡。因此，在本领域中需要在终产物中产生具有检测不到的二聚形式的稳定的四聚血红蛋白。
[0010]现有技术血红蛋白产物的另一问题是在给予后血压突然升高。过去，已经从较早一代的基于血红蛋白的氧载体记录到血管收缩事件。因此，在本领域中需要制备在向哺乳动物施用时不会引起血管收缩和高血压的血红蛋白的方法。
[0011]现有技术为产生稳定血红蛋白而进行的尝试所存在的其它问题包括存在可导致哺乳动物的过敏效应的蛋白质杂质，例如免疫球蛋白G。因此，在本领域中需要可产生无蛋白质杂质的稳定四聚血红蛋白的方法。
[0012]除上述问题以外，在本领域中还需要无二聚体、无磷脂并且能够以工业规模产生的稳定化的四聚血红蛋白。
[0013]基于血红蛋白的氧载体可用于众多种医学应用；根据医学应用，需要不同水平的氧亲和力。例如，具有低氧亲和力的血红蛋白分子可比具有较高氧亲和力的血红蛋白分子更容易将氧转移到靶组织。因此将需要控制交联四聚血红蛋白的氧亲和力。因此，在本领域中需要控制交联类型和交联条件以产生具有精确氧结合水平的交联四聚血红蛋白。
【发明内容】
[0014]本发明提供了加工非聚合的、热稳定的、纯化的交联四聚血红蛋白的方法，所述交联四聚血红蛋白适用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管有害作用和包括死亡在内的严重不良事件。本发 明去除了二聚形式的血红蛋白、未交联的四聚血红蛋白、磷脂和蛋白质杂质。本发明还提供通过控制四聚体中的交联类型(例如，四聚体中的交联、α-α交联、α-β交联的量)、四聚体的四级结构和交联条件来控制得到的交联四聚体的氧亲和力的技术。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。另外，本发明使用(I)快速细胞裂解装置用于精确的和受控的低渗裂解；(2)流通柱色谱(flowthrough column chromatography) ； (3)高温短时间(HTST)装置用于在纯化过程中热加工血红蛋白溶液以去除不需要的不稳定的血红蛋白二聚体并去除蛋白质杂质，例如免疫球蛋白-G，使得可避免肾损伤、血管有害作用和其它毒性反应；和(4)气密的输液袋包装以避免氧侵入到终产物中。
[0015]所述方法包括哺乳动物全血的起始材料,所述全血至少包含红细胞和血楽；。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，随后过滤以获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质。在快速细胞裂解装置中通过受控低渗裂解，持续足以裂解红细胞而不裂解白细胞的时间，来破裂洗涤过的红细胞。进行过滤以从裂解产物中去除至少一部分废滞留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。
[0016]对所述血红蛋白溶液进行一个或多个纯化过程，例如超滤和/或色谱。
[0017]通过富马酸双-3, 5-二溴水杨酸酯(DBSF)使纯化的血红蛋白交联以形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的非聚合的交联四聚血红蛋白的分子量为60_70kDa。如本文中所使用，表达“非聚合的”是指不与其它血红蛋白分子或任何其它非血红蛋白分子(例如PEG)发生分子间交联的四聚血红蛋白。根据血红蛋白源、血红蛋白的四级结构和交联条件，可产生具有高百分比交联的四聚产物。此外，可控制得到的分子的氧亲和力从而使得可产生经调配用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。
[0018]依照此程序，对交联血红蛋白进行热处理以去除任何残留的未交联的四聚血红蛋白和任何未稳定化的血红蛋白(例如二聚形式的血红蛋白)和任何其它蛋白质杂质。在热处理前，将约0.2%的浓度的N-乙酰基半胱氨酸任选地添加到交联四聚血红蛋白以防止形成高铁血红蛋白。在热处理和冷却后立即任选地添加约0.025%到0.4%的浓度的N-乙酰基半胱氨酸以进一步防止形成高铁血红蛋白。热处理优选地是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间处理，随后冷却到25°C。通过离心或过滤去除在热处理期间形成的任何沉淀。
[0019]然后将无二聚体、无磷脂、无蛋白质杂质的热稳定的非聚合的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。
[0020]此后，将热稳定的交联四聚血红蛋白调配并包装在定制的气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯和乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EV0H)输液袋中。所述包装防止导致形成无活性高铁血红蛋白的氧污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是描绘本发明的方法概述的流程图。
[0022]图2示意性地描绘本发明的方法中使用的快速细胞裂解装置。
[0023]图3描绘对于(a)未经热处理的交联四聚血红蛋白和(b)已经在90°C经历45秒到2分钟的热处理或在80°C经历30分钟的热处理的热稳定的交联四聚血红蛋白的高效液相色谱分析。
[0024]图4是流通柱色谱的洗脱曲线；血红蛋白溶液处于流过级分中。
[0025]图5示意性地描绘用于工业规模操作的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。
[0026]图6是用于HTST热加工步骤的装置的示意图。
[0027]图7证明HTST加工装置中的温度曲线，和在所述系统中在本发明的85°C和90°C下去除不稳定的四聚体(二聚体)所用的时间。
[0028]图8是用于本发明的热稳定的交联四聚血红蛋白的输液袋的示意图。
[0029]图9描绘在脱氧环境下与DBSF反应之前(虚线)和之后(实线)牛血红蛋白的α和β球蛋白链的反相HPLC色谱图。
[0030]图10描绘(A)天然牛血红蛋白和(B)在脱氧条件下与DBSF交联的血红蛋白的15% SDS-PAGE 分析。
[0031]图11描绘通过MALD1-T0F分析所生成的来自二聚蛋白质带(Β6)的胰蛋白酶消化的肽的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint)。
【具体实施方式】
[0032]血红蛋白是哺乳动物 和其它动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白质。血红蛋白展现蛋白质的三级结构和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋区段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋部分，产生分子内向其的吸引力，将每个多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子由四个球状蛋白质亚单位组装而成。每个亚单位由一条多肽链构成，所述多肽链排列成一组a -螺旋结构的区段，以“肌红蛋白折叠”排列与包埋的血红素基团连接。
[0033]血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与环中心中位于一个平面中的所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合到与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与4个氧分子结合的能力。
[0034]在哺乳动物中，最常见类型的血红蛋白是四聚体；在人中，其称为血红蛋白A并且由指定为α 2β 2的非共价结合的两个a亚单位和两个β亚单位组成，每个亚单位分别由141个和146个氨基酸残基构成。a和β亚单位的大小和结构彼此非常类似。对于约65kDa的四聚体的总分子量，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90.14%；β链中的同一性为84.35%)。不同之处在于牛血红蛋白中位于PCys93处的两个巯基，而人血红蛋白中的巯基分别位于aCysl04、β Cys93和0Cysll2处。当比较氨基酸序列时,人血红蛋白与牛、犬、猪和马血红蛋白具有高度的相似性。
[0035]在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，a链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个α β 二聚体与另一 α β 二聚体的缔合相当弱。所述键具有分裂成两个α β 二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而能够被肾脏过滤并排泄，结果造成潜在的肾损伤以及显著减少的在血管内的存留时间。
[0036]因此，从功效和安全性两方面来看，有必要稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白。下面概述了产生稳定化的血红蛋白的方法；本发明的方法的概述呈现在图1的流程图中。
[0037]首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括但不限于人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆`分离，过滤并洗涤以去除血浆蛋白质杂质。
[0038]为了从红细胞释放血红蛋白，将细胞膜裂解。尽管可使用各种技术来裂解红细胞，但本发明利用可以以适合于工业规模生产的体积以精确受控的方式在低渗条件下的裂解。为此，使用如图2中所见的快速细胞裂解装置来裂解红细胞。低渗裂解产生包含血红蛋白和废滞留物的裂解产物溶液。为了能够进行工业规模生产，小心地控制裂解以使得仅红细胞被裂解而不裂解白细胞或其它细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解装置的大小以使得红细胞在2到30秒内或足以裂解红细胞的时间内和优选30秒内穿过所述装置。快速细胞裂解装置包括静态混合器。使用去离子水和蒸馏水作为低渗溶液。当然应当理解，使用具有不同的盐浓度的其它低渗溶液将导致用于红细胞裂解的时间段不同。由于受控的裂解程序仅裂解红细胞，而不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白质、磷脂或DNA从白细胞和其它细胞性物质的释放最小化。在30秒后，即在含有红细胞的溶液已经穿过快速细胞裂解装置的静态混合器部分后，立即添加高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其它裂解技术得到的血红蛋白相比具有更高的纯度和更低水平的污染物，例如不需要的DNA和磷月旨。分别通过聚合酶链式反应(检测限=64pg)和高效液相色谱(HPLC，检测限=I μ g/ml)方法没有在所述血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不期望的核酸和磷脂杂质。
[0039]在所述方法中的此阶段，对血红蛋白溶液进行纯化以去除各种蛋白质和其它杂质。此纯化可为基于超滤的过程、基于色谱的过程或一个或多个超滤和/或色谱过程的组合。在示例性实施方案中，进行两个超滤过程:一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质，另一过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，使用IOOkDa过滤器进行第一超滤过程,而使用30kDa过滤器进行第二超滤过程。
[0040]使用流通柱色谱来去除纯化的血红蛋白溶液中的蛋白质杂质，例如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来实施柱色谱，所述离子交换柱例如DEAE柱、CM柱、羟磷灰石柱等。用于柱色谱的pH通常为6到8.5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH8.0下去除蛋白质杂质。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和HPLC方法以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白质杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离使得能够实现用于工业规模生产的连续分离方案。ELISA结果显示在洗脱的血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G:44.3ng/ml ;白蛋白:
20.37ng/ml ;碳酸酐酶:81.2 μ g/ml)。使用不同种类的柱利用不同的pH值去除蛋白质杂质的结果示于下表1中。
[0041]表1
[0042]
【权利要求】
1.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于40%的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括: a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血； b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离； c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分； d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的红细胞； e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液； f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物； g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液； h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一种或多种； i)在氧合环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少40% β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白； j)去除任何残留的化学品； k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少40%的β-β交联且其氧亲和力大于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力； I)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和 m)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.2%到0.4%的量的N-乙酰基半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述β-β交联高于50%并且ρ50值小于约23mm Hg。
4.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述β-β交联高于60%并且ρ50值小于约23mm Hg。
5.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述纯化是使用色谱进行的，所述色谱包括使用一个或多个阳离子交换柱或阴离子交换柱。
6.根据权利要求5所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述色谱柱是一个或多个DEAE、CM和/或羟磷灰石柱。
7.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是人血。
8.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是猪血、马血或犬血。
9.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其进一步包括在低透氧性包装中包装所述血红蛋白溶液以使得血红蛋白溶液具有约两年的保存期限。
10.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求1所述的方法形成的具有高于40%的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。
11.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求4所述的方法形成的具有高于60%的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。
12.根据权利要求10所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。
13.根据权利要求11所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。
14.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于50%的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括: a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血； b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离； c)过滤与所述血浆分离 的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分； d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的红细胞； e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液； f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物； g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液； h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一种或多种； i)在脱氧环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少50% β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白； j)去除任何残留的化学品； k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少50%的β-β交联且其氧亲和力小于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力； I)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和 m)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。
15.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述交联四聚牛血红蛋白的氧亲和力具有约38mm Hg到50mmHg的p50值。
16.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其进一步包括在低透氧性包装中包装所述血红蛋白溶液以使得血红蛋白溶液具有约两年的保存期限。
17.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求14所述的方法形成的β-β交联大于50%的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。
18.—种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求15所述的方法形成的β-β交联大于60%的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。
19.根据权利要求17所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。
20.根据权利要求18所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组合物被体内或离体施用。
21.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025%到0.4%的量的N-乙酰基半胱氨酸。
22.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中所述热加工步骤是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025%到0.2%的量的N-乙酰基半胱氨酸。
23.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含 血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于40%的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括: a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血； b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离； c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分； d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的红细胞； e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液； f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物； g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液； h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一种或多种； i)在氧合环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少40% β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白； j)去除任何残留的化学品； k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少40%的β-β交联且其氧亲和力大于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力； I)冷却得到的热稳定的交联血红蛋白； m)添加0.025% -0.4%的N-乙酰基半胱氨酸；η)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和 ο)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。
24.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025%到0.4%的量的N-乙酰基半胱氨酸。
25.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.025%到0.2%的量的N-乙酰基半胱氨酸。
26.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70°C到95°C进行30秒到3小时的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.2%到0.4%的量的N-乙酰基半胱氨酸。
27.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于50%的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括: a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血； b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离； c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分； d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的红细胞； e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生`包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液； f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物； g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液； h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一种或多种； i)在脱氧环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少50% β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白； j)去除任何残留的化学品； k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少50%的β-β交联且其氧亲和力小于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力； I)冷却得到的热稳定的交联四聚血红蛋白； m)添加0.025% -0.4%的N-乙酰基半胱氨酸； η)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和 ο)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。
【文档编号】A61K35/12GK103796671SQ201280038971
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年8月23日 优先权日:2011年8月31日
【发明者】黄炳镠, 郭瑞仪, 毕国珠 申请人:亿京国际有限公司