一种氧化寡糖交联胶原的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氧化寡糖交联胶原的方法，可应用于生物医用材料及皮革行业。
【背景技术】
[0002]胶原是细胞外基质的主要组成部分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，富含于动物的皮、骨骼、肌腱、内脏细胞间质、韧带、血管、巩膜等部位之中。胶原具有低的免疫原性、低刺激性、低细胞毒性、良好的生物相容性、良好的促进细胞生长的性能以及生物可降解性等诸多优点，在生物医学领域的应用日益广泛(但卫华，王坤余，曾睿，等.胶原的医学应用及其发展前景[J].生物医学工程与临床，2004，8 (1):45-52.)。不同用途的胶原医用生物材料，对物理机械性能、降解率等有着不同的要求，往往需要通过交联改性来改善胶原的物理机械性能、稳定性，降低抗原性，调节适宜的降解性(但年华，但卫华，曾睿，等.环氧化合物及其在胶原改性中的应用[J].材料导报.2006，20 (6):119-122.)。经典的戊二醛交联由于细胞毒性大、易钙化等副作用已经趋于淘汰；碳化二亚胺曾被认为是理想的“零长度”交联剂，但交联程度较低，且存在副作用(但年华，但卫华，关林波，等.环氧化合物和碳化二亚胺交联pADM的性能比较[J].功能材料，2009，8 (40):1352-1354.);环氧化合物交联程度高，结构可设计和控制，但水溶解性差，应用受到限制(但年华，但卫华，丁洁，等.丙三醇缩水甘油醚交联脱细胞猪真皮基质的亲水性研究[J].功能材料，2011，42 (5) =803-806);京尼平是目前认为比较好的交联剂，交联程度高，细胞毒性小，但交联颜色偏深，价格昂贵，且不能赋予胶原特殊功能性，仍算不上理想的交联剂(SungHW., Liang IL., Chen CN.Stability of a b1logical tissue fixed with a naturallyoccurring crosslinking agent (genipin) [J].JOURNAL OF B1MEDICAL MATERIALSRESEARCH, 2001，55(4):538-546.)。从交联剂发展的趋势来看，交联剂从人工合成的有机化合物，转向自然界的天然提取物；从一般的追求耐降解性，转向注重生物相容性和功能性。目前交联胶原的方法尚未达到这种要求，因此，胶原类材料亟需一种生物相容性好、交联程度高、并具有一定生物功能的新型交联方法。
[0003]糖最初仅被认为是一种结构或能量物质，现在则被证明是除核酸和蛋白质之外另一类重要的生命物质，参与了生命，特别是多细胞生命的受精、着床、分化、发育、免疫、衰老等全部时间和空间过程。天然糖类广泛存在与自然界中，具有安全无毒、能够在体内降解代谢、具有较高的生物活性等特性(屠鹏飞.天然糖化学[M].北京:化学工业出版社，2013)。对这些具有良好生化性能的物质，将其与胶原复合可得到良好的效果，但单纯复合可能导致它从胶原中脱离，影响使用。为了使这种混合物之间形成更强的化学结合，有人以碳化二亚胺为媒介，活化糖羧基使之间形成共价键。但由于糖类分子较大，位阻影响大，且该化学反应活性基团有限，与胶原中能够相互反应的基团难以有效接触，导致糖类与胶原作用/交联程度低不能满足需要。
[0004]氧化寡糖是指含有2~9个糖单元，且分子中含有一定量醛基的寡糖(低聚糖)，它是由寡糖经氧化(如高碘酸钠)、分离而得到的产物。包括氧化壳寡糖、氧化低聚异麦芽糖、氧化低聚麦芽糖、氧化海藻寡糖、氧化硫酸软骨素寡糖、氧化肝素寡糖、氧化葡甘寡糖、氧化大豆低聚糖、氧化低聚果糖、氧化低聚木糖。由于氧化寡糖中所含的醛基具有较高的反应活性，胶原中具有许多可与其反应产生交联的活性基团，如氨基、羧基、巯基等，使得氧化寡糖具有交联胶原的能力(Le-Tien C，Millette M，Lacroix M，et al.Modified alginatematrices for the immobilizat1n of b1active agents[J].B1technology & AppliedB1chemistry, 2004，39(2): 189 - 198.)o由于氧化寡糖是由寡糖制备而得的，基本保留了原寡糖的生物化学性质，在交联胶原后，不仅能提高胶原的力学强度、降解性等物理化学性质，还能将寡糖分子引入到胶原中，从而将寡糖的功能性赋予交联胶原，故氧化寡糖作为交联剂，它兼顾了化学活性、生物相容性和功能性，实现了三者的有机统一，是新一代医用交联剂。目前氧化多糖，如氧化海藻酸钠已应用于胶原类材料的交联改性，效果良好且生物相容性倶佳(Yang H，Lan L, Gu Z, et al.Modificat1n of collagen with a naturalderived cross-linker, alginate dialdehyde.[J].Carbohydrate Polymers, 2014，102(3):324 - 332.)。但氧化多糖分子量大，反应位阻大，水溶性差(如氧化壳聚糖、氧化纤维素)，渗透性差，对表面致密的材料难以渗透，容易产生表面交联，交联效率低。与氧化多糖相比，氧化寡糖的分子量更小，水溶性好，并且空间位阻小，渗透性良好，反应活性高，因而氧化寡糖在交联效率上更胜多糖一筹。
[0005]可见，采用兼具反应活性和天然生物活性的氧化寡糖来交联胶原是新一代胶原基生物医用材料的交联方法。
【发明内容】
[0006]1.一种氧化寡糖交联胶原的方法，包括以下步骤:
(1)预处理:称取100重量份的胶原(以干重计)；对于胶原纤维及其聚集体，将其浸泡于100?10000重量份的PH4.0至pH12.0的缓冲溶液中，充分湿润；对于提取得到的胶原分子，加入8000?100000重量份的pH3.0?6.5的醋酸溶液，振摇或搅拌使其完全溶解；
(2)氧化寡糖溶液的制备:称取1?20重量份的氧化寡糖，溶于20?1000重量份的PH3.0?12.0的缓冲溶液中，搅拌或振摇至其完全溶解；
(3)交联反应:将预处理后的胶原和氧化寡糖溶液加入反应容器中，并置于可控温的环境中，调整反应温度为0°C?45°C，保持振摇或搅拌，反应4?48小时；
(4)后期处理:对于胶原纤维及其聚集体，用酸或硫酸铵、氯化铵将浴液pH调至中性，弃去浴液，加入100?10000重量份蒸馏水振摇或搅拌清洗0.5?2小时，弃去清洗液，继续清洗2?5次，取出清洗后的交联胶原，用冷冻干燥机冻干；对于提取得到的胶原分子，交联反应后，在0~4°C的环境中进行后续操作，首先用氢氧化钠溶液调节pH值为弱碱性(pH值约7.50)，缓慢加入固体硫酸铵使其浓度约为1.5 mol/L，连续搅拌至硫酸铵完全溶解，然后静置过夜(10?12h);次日用高速低温离心机离心分离(8000~12000 r/min，15 min)，弃上清液，向沉淀中加入800-10000重量份的0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌30 min ;将其注入透析袋(截留分子量为3500?14000Da)中，在0.04mol/L的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钠溶液中透析1?2天，再置于0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钠溶液中透析1?2天，最后置于双蒸水或注射水中透析2天。
[0007]2.根据权利要求1所述的一种氧化寡糖交联胶原的方法，其中所述的氧化寡糖是指氧化壳寡糖、氧化低聚异麦芽糖、氧化低聚麦芽糖、氧化海藻寡糖、氧化硫酸软骨素寡糖、氧化肝素寡糖、氧化葡甘寡糖、氧化大豆低聚糖、氧化低聚果糖、氧化低聚木糖。
[0008]3.根据权利要求1所述化寡糖交联胶原的方法，其中所述的缓冲液是指硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、氢氧化钠-碳酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲液。
[0009]4.根据权利要求1所述化寡糖交联胶原的方法，其特征在于该交联方法可用于皮革行业中猪、牛、羊动物皮的加工或胶原类生物医学材料的制备中。
[0010]本发明具有以下优点:
(1)与胶原形成牢固的共价键交联
氧化寡糖含