基于艰难梭菌毒素的疫苗的制作方法

文档序号:1251156阅读:424来源:国知局
基于艰难梭菌毒素的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及艰难梭菌TcdA和TcdB的重组片段,其可以用于开发针对艰难梭菌相关的疾病的疫苗。更具体地,本发明涉及包含ToxB-GT抗原和TcdA抗原或ToxA-GT抗原和TcdB抗原的组合。
【专利说明】基于艰难梭菌毒素的疫苗
【技术领域】
[0001]本发明属于针对艰难梭菌(Clostridium difficile)的基于毒素的疫苗领域。
【背景技术】
[0002]艰难梭菌(C.difficile)是可以无症状地存在于人类肠道中的、革兰氏阴性的、形成孢子的厌氧性细菌。除去其它肠菌群(例如通过抗生素和化学疗法治疗)所建立的生态小境允许艰难梭菌孢子在结肠中萌发,从而导致严重的肠疾病[I]。因此,抗生素治疗可以将该通常无害的微生物转化成一系列肠疾病的致病因子,这是在住院患者中特别流行的结果。
[0003]艰难梭菌是医院肠感染的主要病原体[2,3],并且造成大约20%的抗生素相关的腹泻病例、多达75%的抗生素相关的结肠炎病例和几乎所有的假膜性结肠炎病例[4]。宿主因素(诸如增加的年龄、预先存在的严重疾病和减弱的免疫防御)使个体倾向于有症状的感染[I]。这样的艰难梭菌相关的疾病(CDAD)经常发生在重症监护病房中,特别是影响超过60岁的患者。
[0004]CDAD的治疗通常包括起因抗生素的停止、口服甲硝唑或万古霉素疗法和流体替换的起始。但是,抗生素抗性的肠道病原体的出现已经导致关于抗生素用于治疗CDAD的用途的担忧。此外,多达2 0%的患者在完成抗生素疗程的1-2周内复发,并且复发的风险随着每次额外复发而显著增加[5,6]。还报道了超过50%的复发事件是由于不同艰难梭菌菌株的再感染,而不是原发性感染的复发[7]。预防措施是基于患者分离、手卫生和接触预防的实现,这已经获得可变的且经常有限的成功。
[0005]目前没有针对CDAD的有效疫苗。本发明的一个目的是,提供可有效地引起针对艰难梭菌的免疫应答的组合物,其用于开发用于预防和/或治疗艰难梭菌相关疾病的疫苗。

【发明内容】

[0006]因而,本发明提供了一种免疫原性组合物,其包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含:
[0007]a) ToxB-GT抗原和TcdA抗原;或者
[0008]b) ToxA-GT 抗原和 TcdB 抗原。
[0009]因而,本发明提供了一种免疫原性组合物,其包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含a) ToxB-GT抗原和TcdA抗原;或b) ToxA-GT抗原和TcdB抗原。优选地,所述ToxB-GT抗原和/或所述ToxA-GT抗原是脱毒的。
[0010]在一个实施方案中,所述ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:18或SEQ ID N0:60具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 18或SEQ ID N0:60具有80%或更多同一性且包含SEQ ID N0:18或SEQ ID NO:60的表位;所述ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:56具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 56的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:56具有80%或更多同一性且包含SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:56的表位;所述TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:1具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO:1具有80%或更多同一性且包含SEQ ID NO:1的表位;且所述TcdB抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:2具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQ ID NO: 2的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO:2具有80%或更多同一性且包含SEQ ID NO:2的表位。
[0011]在一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原和I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种TcdA抗原,所述 TcdA 抗原任选地选自:(I) ToxA-ED 抗原(SEQ ID NO: 3)、(2) ToxA-GT 抗原(SEQ IDNO:4)、(3) ToxA-CP 抗原(SEQ ID NO: 5)、(4) ToxA-T 抗原(SEQ ID NO:6)、(5) ToxA_T4 抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B 抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA_PTA2 抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO: 10)、(9) ToxA-P5_6抗原(SEQ ID NO: 11)、(10) ToxA-P9_10抗原(SEQ ID NO: 12)、(11)ToxA_B2 抗原(SEQ ID NO: 13)、(12)ToxA_B3 抗原(SEQ ID NO: 14)、
(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO: 15)、(14)ToxA_B6 抗原(SEQ ID NO: 16)或全长 TcdA 抗原(SEQ ID NO:1)。所述免疫原性组合物任选地进一步包含I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种另外的TcdB抗原,所述另外的TcdB抗原任选地选自:(I) ToxB-ED抗原(SEQ ID NO: 17)、(2) ToxB-GT 抗原(SEQ ID NO: 18)、(3) ToxB-CP 抗原(SEQ ID NO: 19) (4)ToxB-T 抗原(SEQ ID NO: 20)、(5) ToxB-B 抗原(SEQ ID NO: 21)、(6)ToxB_B2 抗原(SEQ IDNO: 22) (7) ToxB-B7 (SEQ ID NO:23)或(8)全长 TcdB 抗原(SEQ ID NO: 2)。
[0012]在一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含ToxA-GT抗原和I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或更多种TcdB抗原,所述TcdB抗原任选地选自:(I)ToxB-ED抗原(SEQ ID NO: 17)、(2)ToxB-GT抗原(SEQ ID NO: 18)、(3)ToxB-CP抗原(SEQ ID NO: 19)
(4)ToxB-T 抗原(SEQ ID NO: 20)、(5) ToxB-B 抗原(SEQ ID NO: 21)、(6)ToxB_B2 抗原(SEQID NO: 22) (7) ToxB-B7 (SEQ ID NO: 23)或(8)全长 TcdB 抗原(SEQ ID NO: 2)。所述免疫原性组合物任选地进一步包含I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种另外的TcdA抗原,所述另外的TcdA抗原任选地选自:(I)ToxA-ED 抗原(SEQ ID NO: 3)、(2) ToxA-GT 抗原(SEQ ID NO:4)、(3) ToxA-CP 抗原(SEQ IDNO: 5)、(4) ToxA-T 抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ToxA_T4 抗原(SEQ ID NO: 7)、(6) ToxA-B 抗原(SEQ ID N0:8)、(7)ToxA-PTA2 抗原(SEQ ID NO: 9)、(8) ToxA-P5_7 抗原(SEQ ID NO: 10)、
(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO: 11)、(10) ToxA-P9_10抗原(SEQ ID NO: 12)、(11) ToxA_B2抗原(SEQ ID N0:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO: 14)、(13)ToxA_B5抗原(SEQ ID NO: 15)、
(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO: 16)或全长 TcdA 抗原(SEQ ID NO:1)。
[0013]在一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含:i) ToxA-GT抗原或ToxB-GT抗原;和 ii)至少一种选自 ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5_7、ToxA-P5_6、ToxA-P9_10、ToxA_B2、ToxA-B3、ToxA-B5 和 / 或 ToxA_B6 的 TcdA 抗原;和至少一种选自 ToxB-B、ToxB-B2 抗原和/ 或 ToxA-B7 的 TcdB 抗原。
[0014]在一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含:i) ToxA-GT抗原和ToxB-GT抗原;和 ii)至少一种选自 ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5_7、ToxA-P5_6、ToxA-P9_10、ToxA_B2、ToxA-B3、ToxA-B5 和 / 或 ToxA_B6 的 TcdA 抗原;和至少一种选自 ToxB-B、ToxB-B2 抗原和/ 或 ToxA-B7 的 TcdB 抗原。
[0015]在一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原、TcdA抗原和另一种TcdB抗原,任选地其中所述组合物包含:(a)ToxB-GT+ToxA-B2+ToxB-B,或(b)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5-6。在一个实施方案中,所述组合物包含ToxB-GT抗原、ToxA-GT抗原、另一种TcdA抗原和另一种TcdB抗原,任选地其中所述组合包含ToxB_GT+ToxA_GT+ToxA_B2+ToxB_B。
[0016]在一个实施方案中,所述组合物中的至少2种抗原是呈杂合多肽的形式。在另一个实施方案中,所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。
[0017]在某些实施方案中,所述免疫原性组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的中和滴度。
[0018]在某些实施方案中,所述免疫原性组合物包含至少一种其它艰难梭菌抗原,任选地其中所述其它艰难梭菌抗原是糖抗原。
[0019]在某些实施方 案中,所述免疫原性组合物是疫苗组合物。在某些实施方案中,所述疫苗组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中,所述疫苗组合物是用作药物。在某些实施方案中,所述疫苗组合物是用于在哺乳动物(优选人)中引起免疫应答。在某些实施方案中,所述疫苗组合物是用于治疗或预防艰难梭菌相关的疾病。
[0020]在一个实施方案中,本发明提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法,所述方法包括下述步骤:给所述哺乳动物施用有效量的本文描述的免疫原性组合物或疫苗。
[0021]艰难梭菌的所有致病菌株表达一个或两个大外毒素(TcdA和TcdB,在本文中也被称作ToxA和ToxB、和毒素A和毒素B)。TcdA和TcdB属于大梭菌细胞毒素(IXD)家族且表现出49%氨基酸同一性。它们是组织成多结构域结构的单个多肽链高分子量外毒素(分别是308和270kDa) [8,9]。编码TcdA和TcdB的基因tcdA和tcdB位于19.6kb艰难梭菌致病性基因座中[10]。象LCD家族的其它成员一样,TcdA和TcdB组织成模块结构域,其中每个结构域执行不同的功能[11]。TcdA和TcdB的结构域结构显示在图1中。
[0022]TcdA/B的作用机理的概述提供在参考文献11中。简而言之,TcdA/B的C-端(在图1中用“B”表示)负责毒素与上皮细胞表面的结合。两种毒素的C-端区域由被称作梭菌重复寡肽或细胞壁结合结构域(由于它们与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)LytA的重复序列的同源性)的残基重复序列组成,且负责细胞表面识别和胞吞作用[12]。近年来,已经分辨了 TcdA的C-端片段的晶体结构,从而揭示螺线管样结构,其由32个具有15-21个残基的短重复序列和7个具有30个残基的长重复序列组成(参考文献13)。TcdA和TcdB的C-端重复区域是类似的,且可以常规地鉴别。
[0023]TcdA/B与上皮细胞的结合会诱导受体介导的胞吞作用,从而促进向细胞质中的进入。内化以后,毒素需要酸性核内体才能运输至胞质溶胶。认为胞内体pH的下降会诱导构象变化,后者导致疏水易位结构域(在图1中用“T”表示)的暴露和酶促N-端(其包含糖基转移酶结构域和半胱氨酸蛋白酶结构域,在图1中分别用“GT”和“CP”表示)的插入,从而允许经由孔形成进入核内体[13]。近年来,参考文献14和15证实,来自宿主细胞的六磷酸肌醇会诱导半胱氨酸蛋白酶(“CP”)位点的N-端区域的自动催化裂解,从而将N-端葡萄糖基转移酶(“GT”)结构域释放进胞质溶胶中(认为毒素的剩余部分残留在核内体中)。裂解后,认为GT结构域能够将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移至Rho-GTP酶,从而灭活细胞信号传递[16]。Rho-GTP酶的抑制会造成一系列级联效应,包括肌动蛋白细胞骨架和紧密连接部完整性的调节异常,它们共同地导致增加的膜渗透性和屏障功能的损失[17]、腹泻、炎症、以及嗜中性粒细胞和先天性免疫应答的其它成员的流入[18]。
[0024]因此,TcdA和TcdB外毒素是主要负责由艰难梭菌造成的临床征状的蛋白[19,20,21],且已经成为开发用于治疗和预防CDAD的疫苗的尝试的焦点。参考文献19发现,如果在攻击前施用,针对重组TcdA的抗体足以预防腹泻。针对TcdB的免疫应答也可以在疾病表达和/或免疫中起作用,如与TcdA阴性的、TcdB阳性的艰难梭菌菌株有关的腹泻和假膜性结肠炎的众多报道所证实的[22,23,24,25]。
[0025]使用甲醛灭活的TcdA和TcdB的混合物的临床前研究已经提示,TcdA和TcdB可能涉入艰难梭菌相关的腹泻的发病机制和产生保护性免疫[26]。可以从细胞培养物中纯化TcdA和TcdB,但是灭活过程代表基于类毒素的疫苗的制备中的一个重大限制。毒素灭活通常通过甲醛处理来实现,所述甲醛处理会交联毒素多肽中的氨基酸。甲醛灭活的问题是,毒素可能发生未知的化学修饰和/或部分灭活。实际上,已经证实福尔马林灭活的分子具有受损的结合能力和降低的免疫原性[27]。关于从细胞培养物纯化的艰难梭菌毒素所衍生出的类毒素在疫苗中的应用,还存在许多安全性问题。
[0026]如在参考文献28中讨论的,认为TcdA主要负责CDAD的临床征状。使用纯化的类毒素的实验已经指示,单独的TcdA能够引起CDAD的征状,但是TcdB不能用于该目的,除非将它与TcdA混合或者存在对肠粘膜层的先前损伤[29]。得自动物模型的临床证据指示,TcdA的结合结构域可以引起血清抗体,所述血清抗体会中和TcdA的细胞毒性和致死效应(30,31,32,33)。并且,已经证实含有这些重复单元的重组无毒肽会引起中和抗体,所述中和抗体可以保护实验动物免于TcdA和艰难梭菌的攻击(34,35,36,33)。但是,令人感兴趣的是,一项新近的研究表明,毒素B是艰难梭菌毒力所必需的,并且产生单独TcdA的菌株是无毒性的(29,37),所以艰难梭菌毒力的当前模型仍然未解决。因而,当前不清楚TcdA和TcdB的哪种组分可以用于诱导免疫应答以治疗或预防CDAD。但是,当前的一致意见是,针对CDAD的有效免疫可能需要包含TcdA和TcdB的结合结构域的肽(38,39),并且针对所述结合结构域的抗体会赋予对抗毒素病理学的保护。
[0027]参考文献40公开了嵌合蛋白,其保留了存在于野生型毒素中的所有功能结构域(即GT、CP、T和B结构域),但是其中ToxA的结合结构域已经被ToxB的结合结构域替换,反之亦然。与当前的一致意见相符合,提示所述结合结构域是免疫原性的关键结构域。另外,作者指出,它们的全毒素构建体(其保留天然毒素的所有功能结构域)的嵌合性质是必需的。
[0028]但是,发明人已经令人惊奇地发现,天然毒素结构不是免疫原性所必需的,并且包含TcdA或TcdB的GT结构域的片段特别适合用于产生免疫应答,前提条件是,它们与TcdB片段组合(当使用TcdA的GT结构域时)或与TcdA片段组合(当使用TcdA的GT结构域时)。在这样的组合中采用的GT结构域通常是脱毒的。这样的组合会造成针对TcdA和TcdB的中和滴度的产生,并且比包含结合结构域片段的组合更有效地在动物模型中提供针对CDAD的保护性应答。这些组合因而提供改进的针对CDAD的疫苗。此外,重组多肽片段的应用也会避免与从细胞培养物纯化的艰难梭菌毒素所衍生出的类毒素在疫苗中的应用有关的安全性问题。
[0029]ToxB-GT 杭原
[0030]全长TcdB抗原(在本文中也被称作ToxB和毒素B)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列(由SEQ ID N0:31的核酸序列编码)。脱毒的TcdB抗原在本文中被称作类毒素B。
[0031]缩写“ToxB-GT”表示TcdB的葡萄糖基转移酶结构域,其位于酶促结构域(ED)的N-端区域内。ToxB-GT结构域(SEQ ID NO: 18,由SEQ ID NO: 47的核酸序列编码)是TcdB的与SEQ ID NO:2的氨基酸1-543对应的片段。
[0032]在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 18具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%, 99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 18 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 18具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO: 18的表位。其它优选的片段缺乏一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 18的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、 5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQID NO: 18的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 18的至少一个表位。ToxB-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 18的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0033]在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现:使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变,突变野生型ToxB-GT抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地,相对于SEQ ID NO: 18的野生型ToxB-GT抗原序列,所述ToxB-GT抗原包含一个或多个氨基酸置换(即 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个突变)。例如,相对于SEQ ID NO: 18的野生型ToxB-GT抗原序列,所述ToxB-GT抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个突变),例如在氨基酸位置17、102、139、269、270、273、284、286、288、384、449、444、445、448、449、450、451、452、455、461、463、472、515,518和/或520。例如,所述ToxB-GT抗原可以包含在I个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO: 18的Tox-GT抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的置换。具体地,I个、2个、3个、4个或5个在与SEQ ID NO: 18的ToxB-GT抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸残基置换。在SEQ ID N0:18的氨基酸270、273、284、286和/或288被置换的情况下,所述置换优选地是 D270A、R273A、Y284A、D286A 和 / 或 D288A、最优选地 D270A、R273A、Y284A、D286A和 D288A。这些置换对应于 SEQ ID NO: 2 的置换 D270A、R273A、Y284A、D286A 和 D288A。在SEQ ID N0:60中提供了具有在这些位置处的丙氨酸置换的脱毒ToxB-GT抗原的氨基酸序列。
[0034]在ToxB-GT包含2个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ ID NO: 18的ToxB-GT抗原序列的氨基酸位置102和278、或氨基酸位置102和288。在本发明的组合物中包括的脱毒ToxB-GT抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:60具有50%或更多同一性(例如60%、65%、70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%,99%,99.5%、99.8%、99.9%或更多);和/或(b)是SEQ ID NO:60的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:60具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。脱毒ToxB-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:60的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的片段包含SEQ ID NO:60的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:60的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID Ν0:60的N-端的氨基酸,同时保留SEQ IDNO:60的至少一个表位。
[0035]缩写“ToxB-ED”表示TcdB的酶促结构域。ToxB-ED结构域(SEQ ID NO: 17,由SEQID NO:46的核酸序列编码)是TcdB的与SEQ ID NO:2的氨基酸1-767对应的片段。TcdB的ToxB-ED结构域因而包含ToxB-GT结构域。在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原因而可以是ToxB-ED抗原。
[0036]在本发明的组合物中包括的ToxB-ED抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 17具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 17 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 17具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、650、700、750 或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO: 17的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 17的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 17的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 17的至少一个表位。
[0037]Tox B-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 17的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨
基酸残基的氨基酸序列。
[0038]在本发明的组合物中包括的ToxB-ED抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现:使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变,突变野生型ToxB-ED抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地,相对于SEQ ID NO: 17的野生型ToxB-ED抗原序列,所述ToxB-ED抗原包含一个或多个氨基酸置换(即I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或更多个突变)。例如,相对于SEQ ID NO: 17的野生型ToxB-ED抗原序列,所述ToxB-ED抗原包含一个或多个氨基酸置换(即I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个突变),例如在氨基酸位置 17、102、139、269、270、273、284、286、288、384、449、444、445、448、449、450、451、452、455、461、463、472、515、518 和 / 或 520。例如,所述 ToxB-ED 抗原可以包含在I个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO: 17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的置换。具体地,I个、2个、3个、4个或5个在与SEQID NO: 17的ToxB-ED抗原序 氨酸残基置换。所述ToxB-ED抗原还可以包含在I个、2个或3个与SEQ ID NO: 17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸587、653和/或698对应的位置处的置换。具体地,I个、2个或3个在与SEQ ID NO: 17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸587、653和/或698对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在SEQID NO: 17的氨基酸587、653和/或698被置换的情况下,所述置换优选地是D587N、H653A和/或C698A,最优选D587N、H653A和C698A。这些置换对应于SEQ ID NO: 2的置换D587N、H653A 和 C698A。在 SEQ ID NO: 58 中提供了具有在位置 270、273、284、286、288、587、657 和698(相对于SEQ ID NO:2)处的置换的脱毒ToxB-ED抗原的氨基酸序列。
[0039]在ToxB-ED包含2个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ ID NO: 17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸位置102和278、或氨基酸位置102和288。
[0040]在本发明的组合物中包括的脱毒ToxB-ED抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:58具有50%或更多同一1性(例如 60%、65%、70%、75%、80% ,85 % ,90 % ,91 % ,92 % ,93 % ,94 % ,95 %,96%,97%,98%,98.5 % ,99 % ,99.5 % ,99.8 %、99.9% 或更多);和 / 或(b)是 SEQ IDN0:58的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO:58具有50%或更多同一性,其中“η”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、
45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、650、700、750 或更多)。脱毒ToxB-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:58的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0041]优选的片段包含SEQ ID NO: 58的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQID NO: 58的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:58的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO:58的至少一个表位。
[0042]在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原和ToxB-ED抗原还可以包括存在于全长TcdB抗原中的、下面定义的ToxB-CP和/或ToxB-T结构域。ToxB-GT抗原和ToxB-ED抗原可以例如包含η个来自下面描述的ToxB-T结构域的N-端区域的氨基酸,其中η = 1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1025、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064 或 1065。
[0043]在本发明的组合物中包括的ToxB-GT和ToxB-ED抗原优选地不包含TcdB的结合结构域。具体地,所述ToxB-GT和ToxB-ED优选地不包含在下面更详细地描述的ToxB-B结构域或该结构域的片段,例如在下面更详细地描述的ΤοχΒ-Β2和/或ΤοχΒ-Β7结构域。
[0044]ToxA-GT 抗原
[0045]全长TcdA抗原(在本文中也被称作ToxA和毒素Α)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(由SEQ ID NO: 30的核酸序列编码)。脱毒的TcdA抗原在本文中被称作类毒素Α。
[0046]缩写“ToxA-GT”表示TcdA的葡萄糖基转移酶结构域,其位于酶促结构域(ED)的N-端区域内。ToxA-GT结构域(SEQ ID N0:4,由SEQ ID NO:33的核酸序列编码)是TcdA的与SEQ ID NO:1的氨基酸1-541对应的片段。
[0047]在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:4具有50%或更多同一性(例如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID N0:4 的至少 “η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:4具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:4的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:4的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQID NO:4的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO:4的至少一个表位。
[0048]ToxA-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:4的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0049]在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现:使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变,突变野生型ToxA-GT抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地,相对于SEQ ID NO:4的野生型ToxA-GT抗原序列,所述ToxA-GT抗原包含一个或多个氨基酸置换(即I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或更多个突变)。例如,所述ToxA-GT抗原可以包含在I个、2个或3个与SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的置换。具体地,I个、2个或3个在与SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸残基置换(即Y283A,D285A, D287A)。这些突变对应于SEQ ID NO:1的位置283、285和287。在SEQ ID NO: 56中提供了具有在这些位置处的丙氨酸置换的脱毒ToxA-GT抗原的氨基酸序列。
[0050]在ToxA-GT抗原包含一个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ IDNO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置278。在ToxA-GT抗原包含2个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置101和278。在ToxA-GT抗原包含3个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置101、278和519、或氨基酸位置101、287和519。
[0051]在本发明的组合物中包括的脱毒ToxA-GT抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 56具有50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO:56 ^至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO:56具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540 或更多)。优选的片段包含 SEQ ID Ν0:56 的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 56的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 56的N-端的氨基酸,同时保留至少一个SEQ ID Ν0:56的表位。脱毒ToxB-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID Ν0:56的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0052]缩写“ToxA-ED”表示TcdA的酶促结构域。所述ΤοχΑ-ED结构域(SEQ ID NO: 3,由SEQ ID NO: 32的核酸序列编码)是TcdA的与SEQ ID NO:1的氨基酸1-769对应的片段。TcdA的ToxA-ED结构域因而包含ToxA-GT结构域。在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原因而可以是ToxA-ED抗原。
[0053]在本发明的组合物中包括的ToxA-ED抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:3具有50%或更多同一性(例如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID N0:3 的至少 “η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:3具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:3的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:3的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQID NO: 3的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 3的至少一个表位。
[0054]ToxA-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:3的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0055]在本发明的组合物中包括的ToxA-ED抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现:使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变,突变野生型ToxA-ED抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地,相对于SEQ ID NO:3的野生型ToxA-ED抗原序列,所述ToxA-ED抗原包含一个或多个氨基酸置换(即 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个突变)。例如,所述ToxA-ED抗原可以包含在I个、2个或3个与SEQ ID NO: 3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的置换。具体地,I个、2个或3个在与SEQ ID NO: 3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸残基置换。在SEQ ID N0:54中提供了具有在这些位置处的丙氨酸置换的脱毒ToxA-ED抗原的氨基酸序列。
[0056]所述ToxA-ED抗原还可以包含在I个、2个或3个与SEQ ID NO: 3的ΤοχΑ-ED抗原序列的氨基酸589、655和/或700对应的位置处的置换。具体地,I个、2个或3个在与SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸589、655和/或700对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在氨基酸589、655和/或700被置换的情况下,所述置换优选地是D589N、H655A和/或C700A,最优选D589N、H655A和C700A。
[0057]在ToxA-ED抗原 包含一个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ IDNO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸位置278。在ToxA-ED抗原包含2个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸位置101和278。在ToxA-ED抗原包含3个氨基酸置换的情况下,所述置换优选地不是在SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸位置101、278和519、或氨基酸位置101、287和519。
[0058]在本发明的组合物中包括的脱毒ToxA-ED抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 54具有50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO:54 ^至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:54具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550 或更多)。优选的片段包含 SEQ ID NO:54 ^表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 54的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 54的N-端的氨基酸,同时保留至少一个SEQ ID NO: 54的表位。脱毒ToxA-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:54的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基
的氨基酸序列。
[0059]在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原和ToxA-ED抗原还可以包括存在于全长TcdA抗原中的、下面定义的ToxA-CP和/或ToxA-T结构域。ToxA-GT抗原和ToxA-ED抗原可以例如包含η个来自下面描述的ToxA-T结构域的N-端区域的氨基酸,其中η = 1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、 600、700、800、900、1000、1025、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064 或 1065。
[0060]在本发明的组合物中包括的ToxA-GT和ToxA-ED抗原优选地不包含TcdA的结合结构域。具体地,所述ToxA-GT和ToxA-ED优选地不包含在下面更详细地描述的ToxA-B结构域或该结构域的片段,例如在下面更详细地描述的ΤοχΑ-ΡΤΑ2、ΤοχΑ-Ρ5-7、ΤοχΑ-Ρ5_6、ΤοχΑ-Ρ9-10、ΤοχΑ-Β2、ΤοχΑ_Β3、ΤοχΑ_Β5 和 / 或 ΤοχΑ_Β6 结构域。
[0061]TcdA 杭原
[0062]本发明的组合物可以包含TcdA抗原。在本发明的组合物中包括的TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:1具有 50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是SEQ ID NO:1的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ IDNO:1具有50%或更多同一性,其中“η”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500 或更多)。TcdA的氨基酸片段可以包含SEQ ID NO:1的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个、多达750个、多达1000个、多达1250个、多达1500个、多达1750个、多达2000个、多达2250个或多达2500个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的TcdA片段包含SEQ ID NO:1的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:1的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ IDN0:1的N-端的氨基酸,同时保留至少一个SEQ ID NO:1的表位。其它TcdA片段缺少一个或更多个蛋白结构域。可以缺少的蛋白结构域可以包括功能性蛋白结构域,诸如在本文中讨论的“B”、“ T ”、“ GT”、“ CP”、“ ToxA-ED”、“ ToxA-GT”、“ ToxA-CP”、“ ToxA-T”、“ ToxA_T4 ”、“ ToxA_PTA2 ”、“ ToxA-P5-7 ”、“ ToxA-P5-6 ”、“ ToxA-P9_10,,、“ ToxA_B2 ”、“ ToxA_B3 ”、“ ToxA_B5,,和 “ ToxA_B6 ”结构域。
[0063]在本发明的组合物中可包括的TcdA抗原片段优选地选自:“ToxA-ED”、“ ToxA-GT”、“ ToxA-CP”、“ ToxA-T”、“ ToxA_T4 ”、“ ToxA_PTA2 ”、“ ToxA-P5_7 ”、“ ToxA-P5_6 ”、“ToxA-P9-10”、“ToxA-B2”、“ToxA-B3”、“ToxA-B5” 和 “ToxA_B6”。该组片段在本文中被称作“TcdA抗原组”。[0064]因而,本发明的组合物可以包含一种或多种(即I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种)选自以下的TcdA抗原:(I) ToxA-ED抗原,(2) ToxA-GT 抗原,(3) ToxA-CP 抗原,(4) ToxA-T 抗原,(5) ToxA_T4 抗原,(6) ToxA-B抗原,(7)ToxA-PTA2 抗原,(8)ToxA-P5-7 抗原,(9)ToxA-P5_6 抗原,(10)ToxA-P9_10 抗原,
(11)ΤοχΑ-Β2 抗原,(12)ToxA-B3 抗原,(13)ToxA_B5 抗原,(14)ToxA_B6 抗原,和(15)全长TcdA抗原。其中本发明的组合物包含一种TcdA片段,所述一种TcdA片段优选地不是单独的ToxA-CP抗原。
[0065](I) ToxA-GT抗原、(2) ToxA-ED抗原和(15)全长TcdA抗原如上面所定义。在下面更详细地定义了其它抗原。
[0066](3) ToxA-CP 抗原
[0067]ToxA-CP结构域(SEQ ID NO: 5,由SEQ ID NO: 34的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸542-769。缩写“ToxA-CP”表示TcdA的半胱氨酸蛋白酶结构域,其位于酶促结构域的C-端区域内。
[0068]在本发明的组合物中包括的ToxA-CP抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:5具有50%或更多同一性(例如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%, 91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和/或(b)是 SEQ ID NO: 5 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:5具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、225或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:5的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:5的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 5的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID Ν0:5的至少一个表位。ToxA-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQID NO:5的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200或多达225个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0069] 在本发明的组合物中包括的ToxA-CP抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现:使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变,突变野生型ToxA-CP抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地,相对于SEQ ID NO:5的野生型ToxA-CP抗原序列,所述ToxA-CP抗原包含一个或多个氨基酸置换(即 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、25、30个或更多个突变)。例如,所述ToxA-CP抗原可以包含在I个、2个或3个与SEQ ID NO:5的ToxA-CP抗原序列的氨基酸48、114和159对应的位置处的置换。具体地,I个、2个或3个在与SEQ ID NO:5的ToxA-CP抗原序列的氨基酸48、114和159对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在SEQ ID Ν0:5的氨基酸48、114和/或159被置换的情况下,所述置换优选地是D48N、H114A和/或A159A,最优选D48N、H114A和A159A。这些置换对应于SEQ ID NO:1的置换D589N、H655A和C700A。在SEQ ID N0:62中提供了具有在这些位置处的丙氨酸或天冬酰胺置换的脱毒ToxA-CP抗原的氨基酸序列。[0070]脱毒ToxA-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:62的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200或多达225个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0071]在本发明的组合物仅含有一种TcdA抗原的情况下,所述一个TcdA抗原优选地不是单独的ToxA-CP。在本发明的组合物包含ToxA-CP抗原的情况下,所述抗原可以是ToxA-ED 抗原。
[0072](4) ToxA-T 抗原
[0073]The ToxA-T结构域(SEQ ID N0:6,由SEQ ID NO:35的核酸序列编码)对应于SEQID NO:1的氨基酸770-1808。缩写“ToxA-T”表示TcdA的易位结构域。
[0074]在本发明的组合物中包括的ToxA-T抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:6具有50%或更多同一性(例如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和/或(b)是 SEQ ID N0:6 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:6具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、550、600、700、800、900、1000 或更多)。优选的片段包含 SEQ IDNO:6的表位。其它优选的片段缺少 一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:6的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID Ν0:6的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO:6的至少一个表位。ToxA-T的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:6的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个、多达900个或多达1000个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0075](5) ΤοχΑ-Τ4
[0076]ΤοχΑ-Τ4结构域(SEQ ID NO: 7,由SEQ ID NO: 36的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1510-1775。缩写“ToxA_T4”表示在TcdA内的区域。发现ToxA_T4区域是不溶性的。
[0077]在本发明的组合物中包括的ToxA-T4抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:7具有50%或更多同一性(例如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID N0:7 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:7具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:7的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:7的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 7的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID Ν0:7的至少一个表位。ΤοχΑ-Τ4的氨基酸片段因而可以包含SEQID NO:7的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个或多达
260个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0078](6) ToxA-B 抗原
[0079]ToxA-B结构域(SEQ ID NO:8,由SEQ ID NO:37的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1809-2710。缩写“ToxA-B”表示TcdA的结合结构域的片段。TcdA的结合结构域(在图1中用“B”表示)负责毒素与上皮细胞表面的结合。发明人已经发现,与GT抗原组合的结合结构域的片段可有效地引起免疫应答。本发明的组合物因而采用结合结构域的片段(例如 ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5 和 / 或 ToxA-B6)。
[0080]在本发明的组合物中包括的ToxA-B抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:8具有50%或更多同一性(例如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID N0:8 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:8具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、900 或更多)。优选的片段包含 SEQ ID NO:8 的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:8的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID Ν0:8的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 8的至少一个表位。ToxA-B的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID Ν0:8的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达900个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0081](7) ΤοχΑ-ΡΤΑ2
[0082]ΤοχΑ-ΡΤΑ2结构域(SEQ ID NO:9,由SEQ ID NO:38的核酸序列编码)对应于SEQID NO:1的氨基酸1995-2198。缩写“ToxA_PTA2”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域,且被发现是不溶性的。如在W098/59053中所述,ToxA_PTA2片段包含来自毒素A的C-端重复区域的8个串联重复序列。
[0083]在本发明的组合物中包括的ToxA-PTA2抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:9具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID N0:9 的至少 “η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:9具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200或更多)。优选 的片段包含SEQ ID Ν0:9的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:9的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 9的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO:9的至少一个表位。ToxA-PTA2的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:9的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个或多达200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0084](8)ToxA-P5_7 抗原
[0085]ToxA-P5-7 抗原(SEQ ID NO: 10,由 SEQ ID NO:39 的核酸序列编码)对应于 SEQID NO:1的氨基酸2249-2706。缩写“ToxA-P5_7”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。如在W098/59053中所述,ToxA-P5_7片段包含来自毒素A的C-端重复区域内的20个串联
重复序列。
[0086]在本发明的组合物中包括的ToxA-P5-7抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 10具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 10 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 10具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、450或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:10的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 10的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ IDNO: 10的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 10的至少一个表位。ΤοχΑ-Ρ5-7的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 10的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个或多达450个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0087](9) ΤοχΑ-Ρ5-6 抗原
[0088]ΤοχΑ-Ρ5-6 结构域(也被称作“Ρ5-6”)(SEQ ID NO: 11,由 SEQ ID NO:40 的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2387-2706。缩写“ΤοχΑ-Ρ5_6”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。如在W098/59053中所述,ΤοχΑ-Ρ5_6片段包含来自毒素A的C-端重复区域的14个串联重复序列。
[0089]在本发明的组合物中包括的ΤοχΑ-Ρ5-6抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 11具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 11 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 11具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:11的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 11的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 11的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 11的至少一个表位。ToxA-P5-6的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 11的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达
250个或多达300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0090]ToxA-p5_6抗原可以包含相对于SEQ ID NO: 11的至少一个(例如I个、2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸的突变。突变优选地涉及单个氨基酸,且优选地是点突变。所述突变可以各自独立地是缺失、插入或置换。例如,相对于ToxA-p5-6序列SEQ ID NO: 11,突变的ToxA-p5-6抗原可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)单个氨基酸缺失。作为其它例子,相对于ToXA-p5-6序列SEQ ID勵:11,突变的1'(?4-?5-6抗原可以包含一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如I个、2个、3个、4或5个氨基酸中的每一个)。缺失、置换或插入可以是在N-端和/或C-端处,或者可以是在2个末端之间。因而,截短是缺失的一个例子。截短可能涉及在N-端和/或C-端处的多达40个(或更多个)氨基酸的缺失。具体插入包括2个氨基酸(例如亮氨酸(L)和谷氨酸(E))在C-端处的添加,如在SEQ ID NO:84中所示。
[0091]优选的突变是氨基酸置换。氨基酸置换可以是从一种氨基酸至其它19种天然存在的氨基酸中的任一种。通常将保守置换定义为这样的置换:其引入具有充分类似的化学性质(例如具有有关的侧链)的氨基酸(例如碱性的带正电荷的氨基酸应当用另一种碱性的带正电荷的氨基酸替换),以便维持所述分子的结构和生物学功能。遗传编码的氨基酸可以分成5个家族:(I)酸性的,即天冬氨酸、谷氨酸;(2)碱性的,即赖氨酸、精氨酸、组氨酸;
(3)非极性的,即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;
(4)带电荷的,即天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸;和(5)不带电荷的极性的,即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。一般而言,在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物活性不具有重大影响。具体地,可以在根据SEQ IDll编号的ToxA-p5-6抗原的位置41和/或42处做出置换。具体地,在位置41处的组氨酸(H)可以被天冬氨酸(D)置换,如在SEQID NO: 101中所示(命名为H41D的置换)。具体地,在位置42处的天冬酰胺(N)可以被丙氨酸(A)置换,如在SEQ ID NO: 102中所示(命名为N42A的置换)。更具体地,ToxA-P5_6抗原可以包含这2种突变H41D和N42A,如在SEQ ID NO:103中所示。
[0092]ToxA-p5-6抗原可以是式A_Bp5-6_C的杂合多肽的一部分,其中:
[0093]A是任选的N-端另外的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以源自来自MCS的载体序列,或者所述序列可以源自辅助蛋白的过表达的外来多肽。所述另外的氨基酸可以用于亲和纯化或用于抗体检测。所述另外的氨基酸序列可以是本领域已知的任意标签,诸如GST标签、His标签、T7标签、Trx标签、MBP标签、His-GM标签等。具体地,所述另外的氨基酸序列包含序列 MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS SRITR(SEQ ID NO: 104)
[0094]B 是 ToxA-p5-6 抗原,其具有选自 SEQ ID NOlK SEQ ID N084、SEQ ID N010U SEQID N0102和SEQ ID NO: 103的氨基酸序列。
[0095] C是任选的C-端氨基序列,其具有下述序列TESTCRXQA(SEQ ID NO: 105),其中X是20种天然存在的氨基酸之一。[0096]包含ToxA-p5-6抗原的杂合多肽的例子显示在SEQ ID NO: 106、107、108、109、110和111中。Seq ID NO: 111由SEQ ID NO: 112的核酸序列编码。用于本发明的组合中的优选 ToxA-p5-6 抗原包括 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 111。
[0097](10)ToxA-P9_10 抗原
[0098]ToxA-P9-10结构域(SEQ ID NO: 12,由SEQ ID NO:41的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1843-2706。缩写“ToxA-P9_10”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。如在W098/59053中所述,ToxA-P9_10片段包含来自毒素A的C-端重复区域的所有36个串联重复序列。
[0099]在本发明的组合物中包括的ToxA-P9-10抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 12具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 12 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 12具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、850或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO: 12的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 12的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 12的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 12的至少一个表位。ΤοχΑ-Ρ9-10的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 12的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达850个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0100](11)ΤοχΑ-Β2 抗原
[0101]ΤοχΑ-Β2结构域(SEQ ID Ν0:13,由SEQ ID NO:42的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸2303-2706。缩写“ΤοχΑ_Β2”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。将ΤοχΑ-Β2设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的6个(参见图2)。
[0102]在本发明的组合物中包括的ΤοχΑ-Β2抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 13具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 13 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 13具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO: 13的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 13的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 13的N-端的氨基酸, 同时保留SEQ ID NO: 13的至少一个表位。ToxA-B2的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 13的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0103](12)ToxA_B3 抗原
[0104]ToxA-B3结构域(SEQ ID NO: 14,由SEQ ID NO:43的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1839-2710。缩写“ToxA_B3”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。将ToxA-B3设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的12个(参见图3)。
[0105]在本发明的组合物中包括的ToxA-B3抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 14具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 14 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 14具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、850 或更多)。优选的片段包含 SEQ IDNO: 14的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 14的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 14的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 14的至少一个表位。ΤοχΑ-Β3的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 14的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达850个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0106](13)ΤοχΑ_Β5 抗原
[0107]ΤοχΑ-Β5结构域(SEQ ID NO: 15,由SEQ ID NO:44的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1964-2706。缩写“ΤοχΑ_Β5”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。将ΤοχΑ-Β5设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的10.5 (参见图4)。
[0108]在本发明的组合物中包括的ΤοχΑ-Β5抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 15具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 15 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 15具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、740 或更多)。优选的片段包含 SEQ ID NO: 15 的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 15的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 15的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 15的至少一个表位。ToxA-B5的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 15的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个或多达740个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0109](14)ToxA_B6 抗原
[0110]ToxA-B6结构域(SEQ ID N0:16,由SEQ ID NO:45的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1890-2706。缩写“ToxA_B6”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。将ToxA-B6设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的11.5(参见图5)。
[0111]在本发明的组合物中包括的TOXA-B6抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 16具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5 %,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 16 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 16具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800 或更多)。优选的片段包含 SEQ ID NO: 16 的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 16的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 16的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 16的至少一个表位。ΤοχΑ-Β6的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 16的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达850个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0112]TcdB 杭原
[0113]本发明的组合物可以包含TcdB抗原。在本发明的多肽中包括的TcdB抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:2具有 50%或更多同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是SEQ ID NO: 2的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ IDNO: 2具有50%或更多同一性,其中“η”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、
40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2400 或更多)。TcdB的氨基酸片段可以包含SEQ ID NO:2的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个、多达750个、多达1000个、多达1250个、多达1500个、多达1750个、多达2000个、多达2250个或多达2400个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的TcdB的片段包含SEQ ID NO:2的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:2的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:2的N-端的氨基酸,同时保留至少一个SEQ ID NO: 2的表位。其它TcdB片段缺少一个或更多个蛋白结构域。可以缺少的蛋白结构域可以包括功能性蛋白结构域,诸如在本文中讨论的“ B ”、“ T ”、“ GT”、“ CP”、““ ToxB-ED”、“ ToxB-GT”、“ ToxB-CP”、“ ToxB-T”、“ ToxB-B”、“ ToxB_B2 ”和“ToxB-B7”结构域。
[0114]可以在本发明的组合物中包括的TcdB片段优选地选自:“ToxB-ED”、“ToxB-GT”、“ ToxB-CP ”、“ ToxB-T ”、“ ToxB-B ”、“ ToxB_B2 ” 和 ToxB_B7。该组抗原在本文中被称作 “ TcdB
抗原组”。
[0115]因而,本发明的组合物可以包含一种或多种(即I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或所有8种)选自以下的TcdB抗原:(I) ToxB-ED抗原,(2) ToxB-GT抗原,(3) ToxB-CP抗原,(4) ToxB-T 抗原,(5) ToxB-B 抗原,(6) ToxB_B2 抗原,(7) ToxA_B7 抗原和(8)全长 TcdB抗原。其中本发明的组合物仅包含一种TcdB片段,所述一种TcdB片段优选地不是单独的ToxB-CP。
[0116](I)ToxB-GT抗原、(2)ToxB-ED抗原和(8)全长TcdB抗原如上面所定义。在下面更详细地定义了其它抗 原。
[0117](3) ToxB-CP 抗原
[0118]ToxB-CP结构域(SEQ ID NO: 19,由SEQ ID NO:48的核酸序列编码)对应于SEQID NO: 2的氨基酸544-767。缩写“ToxB-CP”表示TcdB的半胱氨酸蛋白酶结构域,其位于酶促结构域的C-端区域内。
[0119]在本发明的组合物中包括的ToxB-CP抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 19具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO: 19 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 19具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、230或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO: 19的表位。ToxB-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 19的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个或多达230个连续氨基酸残基的氨基酸序列。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQID NO: 19的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 19的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 19的至少一个表位。
[0120]在本发明的组合物中包括的ToxB-CP抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现:使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变,突变野生型ToxB-CP抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地,相对于SEQ ID NO: 19的野生型ToxB-CP抗原序列,所述ToxB-CP抗原包含一个或多个氨基酸置换(即 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、25、30个或更多个突变)。例如,所述ToxB-CP抗原可以包含在I个、2个或3个与SEQ ID NO: 19的ToxB-CP抗原序列的氨基酸44、110和155对应的位置处的置换。具体地,I个、2个或3个在与SEQ ID NO: 19的ToxB-CP抗原序列的氨基酸44、110和155对应的位置处的氨基酸可以被置换,优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在SEQ ID NO: 19的氨基酸
44、110和/或155被置换的情况下,所述置换优选地是D44N、HllOA和/或C155A,最优选044队!111(^和/或(:1554。在SEQ ID NO:64中提供了具有在这些位置处的丙氨酸或天冬酰胺置换的脱毒ToxB-CP抗原的氨基酸序列。这些置换对应于SEQ ID NO: 2的置换D587N、H653A和C698A。脱毒ToxB-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID N0:64的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个或多达225个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0121]在本发明的组合物仅含有一种TcdB抗原的情况下,所述一种TcdB抗原优选地不是单独的ToxB-CP。在本发明的组合物包含ToxB-CP抗原的情况下,所述抗原可以是ToxB-ED 抗原。
[0122](4) ToxB-T 抗原
[0123]ToxB-T结构域(SEQ ID N0:20,由SEQ ID NO:49的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO: 2的氨基酸768-1833。缩写“ToxB-T”表示TcdB的易位结构域。
[0124]在本发明的组合物中包括的ToxB-T抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:20具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO:20 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:20具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、900、1000、1050 或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:20的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:20的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 20的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 20的至少一个表位。ToxB-T的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 20的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个、900个、1000个或多达1050个、连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0125](5) ToxB-B 抗原
[0126]ToxB-B结构域(S EQ ID Ν0:21,由SEQ ID NO:50的核酸序列编码)对应于SEQ IDNO:2的氨基酸1853-2366。缩写“ToxB-B”表示TcdB的结合结构域的一个片段。发明人已经发现,与GT抗原组合的结合结构域的片段可有效地引起免疫应答。本发明的组合物因而采用结合结构域的片段(例如ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA_B7)。
[0127]在本发明的组合物中包括的ToxB-B抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:21具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO:21 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:21具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:21的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:21的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ IDNO: 21的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 21的至少一个表位。ToxB-B的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID Ν0:21的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达450个或多达500个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0128](6)ΤοχΒ_Β2 抗原
[0129]ΤοχΒ-Β2结构域(SEQ ID Ν0:22,由SEQ ID NO:51的核酸序列编码)对应于SEQID NO: 2的氨基酸2157-2366。缩写“ΤοχΑ_Β2”表示TcdB的结合结构域的C-端区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdB结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。将ΤοχΒ-Β2设计成包括9个假定的形成结合结构域的结构单元中的4个(参见图6)。
[0130]在本发明的组合物中包括的ΤοχΒ-Β2抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 22具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO:22 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:22具有50%或更多同一性,其中 “η” 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、175、200或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:22的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 22的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID Ν0:22的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID Ν0:22的至少一个表位。
[0131]ΤοχΒ-Β2的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 22的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个或多达200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0132](7)ΤοχΒ_Β7 抗原
[0133] ΤοχΒ-Β7结构域(SEQ ID Ν0:23,由SEQ ID NO:52的核酸序列编码)对应于SEQID NO:2 的氨基酸 2056-2366。[0134]在本发明的组合物中包括的ToxB-B7抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 23具有50%或更多同一性(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%,99%,99.5%,99.8%,99.9%或更多);和 / 或(b)是 SEQ ID NO:23 的至少“η”个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID Ν0:23具有50%或更多同一性,其中“η”是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或更多)。优选的片段包含SEQ ID Ν0:23的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO: 23的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:23的N-端的氨基酸,同时保留SEQ ID NO: 23的至少一个表位。
[0135]ΤοχΒ-Β7的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO: 23的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个或多达300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0136]抗原组合
[0137]本发明的组合物可以包含ToxB-GT抗原和一种或多种TcdA抗原(例如1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自以下的1^(^抗原:如上所述的(I) ToxA-ED抗原、
(2)ToxA-GT 抗原、(3) ToxA-CP 抗原、(4) ToxA-T 抗原、(5) ΤοχΑ_Τ4 抗原、(6) ToxA-B 抗原、
(7)ΤοχΑ-ΡΤΑ2 抗原、(8)ΤοχΑ-Ρ5-7 抗原、(9) ΤοχΑ-Ρ5_6 抗原、(10) ΤοχΑ-Ρ9_10 抗原、(11)ΤοχΑ-Β2 抗原、(12)ΤοχΑ-Β3 抗原、(13) ΤοχΑ_Β5 抗原、(14) ΤοχΑ_Β6 抗原和(15)全长 TcdA抗原)。这样的组合物可以进一步包含一种或多种另外的TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7或8种选自以下的TcdB抗原作为上述的TcdB: (I) ToxB-ED抗原、(2) ToxB-GT抗原、(3)ToxB-CP 抗原、(4) ToxB-T 抗原、(5) ToxB-B 抗原、(6) ΤοχΒ-Β2 抗原、(7) ΤοχΑ-Β7 抗原和(8)全长TcdB抗原)。
[0138]可替换地,本发明的组合物可以包含ToxA-GT抗原和一种或多种TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7或8种选自以下的TcdB抗原作为上述的TcdB: (I)ToxB-ED抗原、(2)ToxB-GT 抗原、(3) ToxB-CP 抗原、(4) ToxB-T 抗原、(5) ToxB-B 抗原、(6) ΤοχΒ_Β2 抗原、(7)ΤοχΑ-Β7抗原和(8)全长TcdB抗原)。这样的组合物可以进一步包含一种或多种另外的TcdA抗原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自以下的TcdA抗原:如上所述的(I) ToxA-ED 抗原、(2) ToxA-GT 抗原、(3) ToxA-CP 抗原、(4) ToxA-T 抗原、(5) ΤοχΑ_Τ4抗原、(6)ToxA-B 抗原、(7)ΤοχΑ-ΡΤΑ2 抗原、(8)ΤοχΑ-Ρ5_7 抗原、(9)ΤοχΑ-Ρ5_6 抗原、(10)ΤοχΑ-Ρ9-10 抗原、(11)ΤοχΑ-Β2 抗原、(12) ΤοχΑ_Β3 抗原、(13) ΤοχΑ_Β5 抗原、(14)ΤοχΑ_Β6抗原和(15)全长TcdA抗原)。
[0139]下面阐述了在本发明的组合物中可以包括的抗原组合的具体例子。
[0140]在某些实施方案中,所述免疫原性组合物包含以下抗原的组合:i) 一种ToxB-GT抗原和一种TcdA抗原,或ii) 一种ToxA-GT抗原和一种TcdB抗原。
[0141]在某些实施方案中,所述组合物包含ToxA-GT和一种来自TcdB抗原组的抗原,例如 ToxA-GT+ToxB-ED、ToxA-GT+ToxB-GT、ToxA-GT+ToxB-CP、ToxA-GT+ToxB-T、ToxA-GT+ToxB-Βλ ToxA-GT+ToxB_B2、 ToxA-ED+ToxB_B7、 ToxA-ED+ToxB_ED、ToxA-ED+ToxB-GT、ToxA-ED+ToxB-CP、ToxA-ED+ToxB-T、ToxA-ED+ToxB-B、ToxA-ED+ToxB_B2和 ToxA-ED+ToxB-B70
[0142]在某些实施方案中,所述组合物包含ToxB-GT和一种来自TcdA抗原组的抗原,例如 ToxB-GT+ToxA-ED、ToxB-GT+ToxA-GT、ToxB-GT+ToxA-CP、ToxB-GT+ToxA-T、ToxB-GT+ToxA-T4、 ToxB-GT+ToxA_PTA2、 ToxB-GT+ToxA-P5_7、 ToxB-GT+ToxA-P5_6、ToxB-GT+ToxA-P9-10、 ToxB-GT+ToxA_B2、 ToxB-GT+ToxA_B3、 ToxB-GT+ToxA_B5、ToxB-GT+ToxA_B6、 ToxB-ED+ToxA_ED、 ToxB-ED+ToxA_GT、 ToxB_ED+ToxA_CP、ToxB-ED+ToxA-T、 ToxB-ED+ToxA_T4、 ToxB-ED+ToxA_PTA2、 ToxB-ED+ToxA-P5_7、ToxB_ED+ToxA_P5_6、ToxB_ED+ToxA_P9_10> ToxB_ED+ToxA_B2、ToxB-ED+ToxA-B3 >ToxB-ED+ToxA-B5 和 ToxB-ED+ToxA_B6。优选地,所述组合物包含(a) ToxB-GT+ToxA-P5_6、(b)ToxB-GT+ToxA-B2、 (c)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA_B2 或(d)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5_6。
[0143]在另一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含3种抗原。这样的免疫原性组合物可以包含以下抗原的组合:i) 一种ToxB-GT抗原和2种TcdA抗原;ii) 一种ToxA-GT抗原和2种TcdB抗原;或iii) 一种ToxB-GT抗原、一种ToxA-GT抗原和一种其它的TcdA或TcdB 抗原,例如 ToxB-GT+ToxA-B2+ToxB_B、ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5_6。
[0144]所述免疫原性组合物可以包含4种抗原。例如,所述组合物可以包含ToxB-GT抗原、ToxA-GT抗原和2种来自TcdA和/或TcdB抗原组的另外的抗原,例如ToxB-GT+ToxB_B+ToxA_GT+ToxA_B2。
[0145]已经发现,当与源自TcdA和TcdB的结合结构域的片段组合时,包含ToxA-GT和/或ToxB-GT抗原的组合是惊人地有效的。具体地,所述组合物因此可以包含以下抗原的组合:i)ToxA-GT抗原或ToxB-GT抗原,和(ii)至少一种选自 ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5_7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10 、ToxA_B2、ToxA_B3、ToxA_B5 和 / 或 ToxA_B6 的 TcdA 抗原;和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA_B7的TcdB抗原。所述组合物还可以包含以下抗原的组合:i) ToxA-GT抗原和ToxB-GT抗原和(ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA_PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5 和 / 或 ToxA_B6 的 TcdA 抗原;和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA_B7的TcdB抗原。
[0146]所述组合物可以进一步包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种另外的片段。这样的其它片段优选地选自TcdA抗原组和/或TcdB抗原组。
[0147]杂合多妝
[0148]所述组合物中的抗原可以呈现为各种单独的多肽和/或“杂合”多肽。在某些实施方案中,所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。在某些实施方案中,所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。在下面更详细地描述杂合多肽(在本文中也被称作嵌合体或嵌合蛋白)。
[0149]所述抗原可以作为各种单独的多肽存在于本发明的组合物中(即混合到一起)。作为一个替代方案,本发明的组合物包含“杂合”多肽,其中将至少2种(例如2、3、4、5种或更多种)抗原表达为单个多肽链。本发明的组合物还可以包含至少一种各种单独的多肽抗原和至少一种杂合多肽。杂合多肽会提供2个主要优点:首先,通过添加克服该问题的合适杂合配偶体,可以辅助本身不稳定或者表达较差的多肽;其次,简化了商业生产,因为为了生产在抗原性方面都有用的两种多肽仅需利用一次表达和纯化。
[0150]杂合多肽可以包含ToxB-GT抗原和一种或多种TcdA抗原。所述杂合多肽因而包含2种或更多种不同的抗原。因而,所述杂合多肽可以包含来自例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同抗原的氨基酸序列,且可以包含每种抗原的多个拷贝,即2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。
[0151]杂合多肽可以包含ToxA-GT抗原和一种或多种TcdB抗原。所述杂合多肽因而包含2种或更多种不同的抗原。因而,所述杂合多肽可以包含来自例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同抗原的氨基酸序列,且可以包含每类片段的多个拷贝,即2、3、4、5、6、7、8、
9、10或更多个拷贝。
[0152]TcdA抗原优选地选自TcdA抗原组,例如所述杂合多肽可以包含TcdA抗原组中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种抗原。TcdB抗原优选地选自 TcdB抗原组,例如所述杂合多肽可以包含TcdB抗原组中的1、2、3、4、5、6、7或8种抗原。
[0153]不同的杂合多肽可以在单一制剂中混合到一起。可以将杂合体与非杂合抗原组合。在这样的组合内,TcdA/TcdB抗原可以存在于超过一种杂合多肽中和/或作为非杂合多肽存在。优选地,TcdA/TcdB抗原作为杂合体或作为非杂合体存在,但是不作为二者存在。
[0154]所述杂合多肽还可以与缀合物或非-艰难梭菌抗原组合。 [0155]杂合多肽可以由式NH2-A-{-X-L-}n-B-C00H表示,其中:X是如上所述的毒素片段(优选类毒素片段)的氨基酸序列;L是任选的接头氨基酸序列4是任选的N-端氨基酸序列是任选的C-端氨基酸序列;n是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。η经常是2或3。
[0156]如果-X-部分具有野生型形式的前导多肽序列,那么其可在杂合蛋白中包含或者缺失。在某些实施方案中,除了位于杂合蛋白N-端处的-X-部分的前导多肽以外,前导多肽可缺失,即保留X1的前导多肽,但缺失ν..χη的前导多肽。这相当于删除所有前导多肽并使用X1的前导多肽作为部分-Α-。
[0157]就{-X-L-}的各η示例而言,接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如,当 η = 2 时,杂合体可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH' NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH,NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少的氨基酸,即20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个)。例子包含促进克隆的短多肽序列、聚甘氨酸接头(即包含Glyn,其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和组氨酸标签(即Hisn,其中η = 3、4、5、6、7、8、
9、10或更多)。本领域技术人员会明白其它合适的接头氨基酸序列。一种有用的接头是GSGGGG (SEQ ID NO: 25)或 GSGSGGGG (SEQ ID NO: 26),其中 Gly-Ser 二肽从 BamHI 限制位点形成,因而有助于克隆和操作,且(Gly)4四肽是典型的聚-甘氨酸接头。其它合适的接头(具体地用作最终的Ln)是Leu-Glu 二肽或SEQ ID NO: 27。
[0158]-A-是任选的N-端氨基酸序列。其通常较短(例如40个或更少的氨基酸,即40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个)。例子包括指导蛋白运输
的前导序列、或促进克隆或纯化的短多肽序列(例如组氨酸标签,即Hisn,其中η = 3、4、5、
6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员会明白其它合适的N-端氨基酸序列。如果X1缺少其自身的N-端甲硫氨酸,-A-优选是提供N-端甲硫氨酸的寡肽(例如,具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸),例如Met-Ala-Ser或单个Met残基。
[0159]-B-是任选的C-端氨基酸序列。其通常较短(例如40个或更少的氨基酸,即39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个)。例子包括指导蛋白质运输的序
列、促进克隆或纯化的短多肽序列(例如包含组氨酸标签,即Hisn,其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、或增强蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员会明白其它合适的C-端氨基酸序列。
[0160]例如,本发明提供了一种杂合多肽(“Β4杂合体”),其由通过肽接头(SEQ IDNO: 25)与 ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11)融合的 ToxB-GT (SEQ ID NO: 18)组成。在图 7 中提供了 Β4杂合体的示意图(SEQ ID NO:24,由SEQ ID NO:53的核酸序列编码)。
[0161]本发明的杂合多肽通常不是全毒素,即它们不包含存在于天然毒素或全毒素中的所有功能结构域(GT、CP、T和B)。例如,在包含ToxB-GT抗原的杂合多肽也包含TcdB的结合结构域片段(例如ToxB-B、ToxB-B2和/或ToxB_B7)的情况下,所述杂合体不包含以它们在天然毒素B中存在的次序呈现的Tcd B的CP和T结构域。类似地,在包含ToxA-GT抗原的杂合多肽也包含TcdA的结合结构域片段(例如ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5_7、ToxA-P5-6、ToxA-P 9-10、ToxA_B2、ToxA_B3、ToxA_B5 和 / 或 ToxA_B6)的情况下,所述杂合体不包含以它们在天然毒素A中存在的次序呈现的TcdA的CP和T结构域。
[0162]在某些实施方案中,杂合多肽中的功能结构域的N-端至C-端次序不同于在天然毒素中存在的功能结构域的次序,例如T结构域可以是GT结构域的N-端。
[0163]类似地,TcdA和TcdB片段可以以任意次序呈现。例如,在杂合多肽包含2种TcdA抗原和一种TcdB抗原的情况下,它们从N-端至C-端可以是次序A_A_B、A-B-A、B-A_A,或者在杂合多肽包含2种TcdB抗原和一种TcdA抗原的情况下,它们从N-端至C-端可以是次序B-B-A、B-A-B、A-B-B。一般而言,TcdA和TcdB抗原可以是交替的,例如A-B-A或B-A-B。
[0164]具体地,所述杂合多肽优选地不包含与TcdA的ToxA-B结构域融合的TcdB的ToxB-ED和ToxB-T结构域,其中TcdA的B-结构域直接地或经由接头与TcdB的T-结构域的C-端融合(例如修饰的全长TcdB,其中TcdB的B-结构域替换TcdA的B-结构域)。所述杂合多肽优选地不包含与TcdA的CP、T和B结构域(在N-C方向)融合的TcdB的GT结构域,其中TcdB的GT-结构域直接地或经由接头与TcdA的CP-结构域的C-端融合(例如修饰的全长TcdA,其中TcdA的GT-结构域替换TcdB的GT-结构域)。所述杂合多肽优选地不包含与TcdB的GT、CP和T结构域(在N-C方向)融合的TcdA的B-结构域,其中TcdA的B-结构域直接地或经由接头与TcdB的GT-结构域的C-端融合。
[0165]制备本发明的组合物
[0166]本发明还提供了一种用于制备本发明的组合物的方法,所述方法包括混合如上定义的抗原组合中的任一种组合的抗原的步骤。例如,本发明提供了一种方法,其包括混合以下抗原的步骤:(i) ToxA-GT抗原和(ii) 一种或多种(即I种、2种、3种或4种)TcdB抗原和任选的(iii) 一种或多种(即I种、2种、3种或4种)其它TcdA抗原。例如,所述方法可以包括混合以下抗原的步骤:ToxA_GT抗原和一种或多种选自TcdB抗原组的抗原和任选的一种或多种选自TcdA抗原组的抗原。[0167]本发明还提供了一种方法,其包括混合以下抗原的步骤:(i)ToXB-GT抗原和(ii)一种或多种(即I种、2种、3种或4种)TcdA抗原和任选的(iii) 一种或多种(即I种、2种、3种或4种)TcdB抗原。例如,所述方法可以包括混合多肽的步骤,所述多肽包含ToxB-GT抗原和一种或多种选自TcdA抗原组的抗原和任选的一种或多种选自TcdB抗原组的抗原。
[0168]根据本发明的用于制备TcdA和TcdB抗原的混合物的方法可以包括以下另外的步骤:将本发明的TcdA和TcdB抗原的组合的混合物配制为药物,例如作为疫苗。这样的方法可以进一步包括以下步骤:将所述制剂包装用于作为药物(例如作为疫苗)进行贮存或分布。
[0169]与本发明一起使用的多肽
[0170]与本发明一起使用的多肽可以呈不同的形式(例如天然形式、融合体形式、糖基化形式、未糖基化形式、脂质化形式、非脂质化形式、磷酸化形式、非磷酸化形式、肉豆蘧酰基化的、非肉豆蘧酰基化的、单体形式、多聚体形式、微粒形式、变性形式等)。
[0171]与本发明一起使用的多肽可以通过多种方式(例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)来制备。重组表达的蛋白是优选的,特别对于杂合多肽而言。
[0172]与本发明一起使用的多肽优选地以纯化的或基本上纯化的形式提供,即基本上不含有其它多肽(例如不含有天然存在的多肽),具体地不含有其它艰难梭菌或宿主细胞多肽,且通常是至少约50%纯的(按重量计),且经常是至少约90%纯的,即小于约50%、更优选地小于约10% (例如5%)的组合物由其它表达的多肽构成。因而,所述组合物中的抗原与表达所述分子的完整生物体分离。
[0173]与本发明一起使用的多肽优选地是艰难梭菌多肽。
[0174]与本发明一起使用的多肽优选地是分离的或纯化的。
[0175]术语“多肽”表示任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链的或支链的,它可以包含经修饰的氨基酸,且它可以被非氨基酸中断。该术语也包括已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意其它操作或修饰,诸如用标记组分组合。也包括,例如,含有氨基酸的一种或更多种类似物(包括、例如,非天然氨基酸等)、以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以作为单链或有关的链存在。
[0176]本发明提供了包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽,其中:-P-是如上定义的氨基酸序列,且-Q-不是如上定义的序列,即本发明提供了融合蛋白。在-P-的N-端密码子不是ATG、但是该密码子不存在于多肽的N-端的情况下,它将被翻译为该密码子的标准氨基酸,而不是翻译为Met。但是,在该密码子是在多肽的N-端的情况下,它将被翻译为Met。-Q-部分的例子包括、但不限于:组氨酸标签(即Hisn,其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、麦芽糖-结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。 [0177]本发明还提供了一种用于生产本发明的多肽的方法,所述方法包括下述步骤:在诱导多肽表达的条件下,培养用本发明的核酸转化的宿主细胞。
[0178]尽管本发明的多肽的表达可以发生在艰难梭菌中,本发明经常使用异源宿主进行表达(重组表达)。所述异源宿主可以是原核的(例如细菌)或真核的。它可以是大肠杆菌(E.coli),但是其它合适的宿主包括桥石短芽孢杆菌(Brevibacilluschosinensis)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌属(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。与编码本发明多肽的野生型艰难梭菌基因相比,有益的是,改变密码子以优化这样的宿主中的表达效率,而不影响编码的氨基酸。
[0179]本发明提供了一种用于生产本发明的多肽的方法,所述方法包括下述步骤:通过化学方法合成所述多肽的至少一部分。
[0180]趁璧
[0181]本发明还提供了组合物,其包含编码上述的本发明的多肽或杂合多肽的组合的核酸(例如核酸的组合、载体或载体组合)。
[0182]编码本发明的抗原组合的核苷酸序列是已知的,或者可以根据遗传密码来设计。因而,在本发明范围内,这样的核苷酸序列可以编码本文中公开的多肽序列中的一个或更多个,或者可以编码这样的氨基酸序列,其:(a)与所述多肽中的任一个具有50%或更多同一1注(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%,98%,99%,99.5%或更多,例如90%同一性或更多、或95%同一性或更多、或99%同一性或更多);和/或(b)包含所述多肽中的任一个的至少’η’个连续氨基酸的片段:1,其中 ’η’ 是 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200,250或更多;例如20或更多;或例如50或更多;或例如80或更多)。
[0183]编码所有上述TcdA和TcdB抗原的核酸的天然核苷酸序列给出在序列表中,且总结在序列表表格中。编码这些抗原中的一些的核苷酸序列已经使用密码子优化方法进行了优化,并且在某些情况下也提供了经优化的核苷酸序列。密码子优化的序列的例子包括包含SEQ ID Ν0:55、57、59、61、63和65-69的核苷酸序列的核酸序列。本发明包括包含在序列表表格中鉴别出的核酸的组合物,所述核酸编码上述的抗原的组合。本发明还提供了可以与这些核酸杂交的核酸。杂交反应可以在不同“严谨性”的条件下进行。增加杂交反应的严谨性的条件是在本领域中广泛已知的和公开的(例如[42]的第7.52页)。有关的条件的例子包括(以严谨性递增的次序):251:、371:、501:、551:和681:的温育温度;10χSSC、6x SSCUx SSC、0.1xSSC (其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)的缓冲液浓度和它们的使用其它缓冲液系统的等效物75%的甲酰胺浓度;从5分钟至24小时的温育时间;1、2次或更多次洗涤步骤;1、2或15分钟的洗涤温育时间;和6xSSCUx SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。杂交技术和它们的优化是本领域众所周知的[43,44,42,45,等]。
[0184]核酸可以在低严谨性条件下与靶标杂交;在其它实施方案中,它在中间严谨性条件下杂交;在优选的实施方案中,它在高严谨性条件下杂交。一组示例性的低严谨性杂交条件是50°C和IOx SSC0 一组示例性的中间严谨性杂交条件是55°C和Ix SSC0 一组示例性的高严谨性杂交条件是68°C和0.1x SSC0
[0185]本发明包括包含这些序列的互补序列的核酸(例如,用于反义或探测,或用作引物)。
[0186] 根据本发明的核酸可以采取各种形式(例如单链形式、双链形式、载体、引物、探针、标记形式等)。本发明的核酸可以是环状的或分枝的,但是通常是线性的。除非另有说明或要求, 利用核酸的本发明任何实施方案可以利用双链形式和构成该双链形式的两条互补单链形式中的每条链。引物和探针通常是单链的,反义核酸也是如此。
[0187]编码本文描述的抗原的核酸优选地以纯化的或基本上纯化的形式提供,即基本上不含有其它核酸(例如不含有天然存在的核酸),特别是不含其它艰难梭菌或宿主细胞核酸,通常是至少约50%纯的(按重量计),且经常至少约90%纯。本发明的核酸优选地是艰难梭菌核酸。
[0188]可以以多种方式制备编码本文描述的抗原的核酸,例如,通过完全或部分化学合成(例如DNA的氨基亚磷酸酯合成)、通过用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、从基因组或cDNA文库制备等。
[0189]可以将核酸连接至固体支持物(例如珠子、平板、滤器、膜、载玻片、微阵列支持物、树脂等)。可以标记核酸,例如用放射性标记或荧光标记、或生物素标记。在将核酸用于检测技术的情况下(例如核酸是引物或作为探针的情况下),这是特别有用的。
[0190]术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸的聚合形式,其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。它也包括DNA或RNA类似物,诸如含有经修饰的主链(例如多肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或经修饰的碱基的那些。因此,本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA, cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、探针、引物等。在本发明的核酸采取RNA形式的情况下,它可以具有或不具有5’帽。
[0191]编码本文描述的抗原的核酸可以是载体的一部分,即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是,例如,设计用于分离、扩增和复制插入的核苷酸的“克隆载体”,设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”,设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”,或包含超过一种载体类型的属性的“穿梭载体”。优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物,其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代,并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变,所述后代可以不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA互补方面)。宿主细胞包括用本发明的核酸在体内或在体外转染或感染的细胞。
[0192]当与核酸关联使用时,术语“互补”或“互补的”表示沃森-克里克碱基配对。因此,C的互补物是G,G的互补物是C,A的互补物是T (或U),T (或U)的互补物是A。也可能使用碱基诸如I (嘌呤肌苷),例如与嘧啶(C或T)互补。
[0193]编码本文描述的抗原的核酸可以用于例如:生产多肽;作为杂交探针用于检测生物样品中核酸;产生核酸的另外的拷贝;产生核酶或反义寡核苷酸;作为单链DNA引物或探针;或作为形成三链的寡核苷酸。
[0194]本发明提供了一种用于生产编码本文描述的抗原的核酸的方法,其中所述核酸使用化学方法部分地或完全地合成。
[0195]本发明提供了包含编码本文描述的抗原的核苷酸序列的载体(例如克隆或表达载体)和用这样的载体转化的宿主细胞。
[0196]对于本发明的某些实施方案,核酸的长度优选地是至少7个核苷酸(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300 个核苷酸或更长)。[0197]对于本发明的某些实施方案,核酸的长度优选地是多达500个核苷酸(例如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15 个核苷
酸或更长)。
[0198]菌株和夺体
[0199]上面参考得自艰难梭菌菌株630的艰难梭菌ToxA和ToxB定义了抗原。ToxA和ToxB的基础参照序列可以在公开的基因数据库中容易地找到。例如,GenBank登录号AM180355是完整艰难梭菌基因组序列,并且各个ToxA和ToxB序列作为基因组序列的“特征”部分中的“基因座_标签”入口给出。在数据库中也给出了功能注解。
[0200]本发明的免疫原性组合物可用于针对由多种不同艰难梭菌菌株造成的CDAD的免疫。本发明不限于包含仅来自630菌株的片段的组合物。几个艰难梭菌菌株的序列是可得到的,包括艰难梭菌菌株R20291 (SM)、艰难梭菌菌株196、艰难梭菌菌株BI 1、艰难梭菌菌株BI/NAP1/027 (核糖型027)、艰难梭菌菌株M120和艰难梭菌菌株M68、菌株855、菌株Q⑶-63q42、菌株ATCC43255的序列。可以使用标准的检索和比对技术在任何其它基因组序列中鉴别得自艰难梭菌菌株630的任何特定毒素序列的同系物。例如在菌株ATCC43255、菌株 CIP107932、菌株 QCD-23m63、菌株 QCD_32g58、菌株 QCD_37x79、菌株 QCD_63q42、菌株 QCD-66c26、菌株 QCD_76w55、菌株 QCD_97b34、菌株 CD196、菌株 CDBI1、菌株 CDCF5、菌株CDSM、菌株CDM68、菌株00祖20或菌株1?20291中。此外,可得自的艰难梭菌菌株630的序列可以用于设计引物用于扩增得自其它菌株的同源序列。因此,本发明不限于得自该菌株的多肽,而是包括得自其它艰难梭菌菌株的这样的变体和同系物以及非天然的变体。一般而言,特定SEQID NO的合适变体包括它的等位基因变体、它的多晶型形式、它的同系物、它的直系同源物、它的旁系 同源物、它的突变体等。
[0201]因而,例如,与菌株630参照序列相比,与本发明一起使用的多肽可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)氨基酸置换,诸如保守置换(即用另一个具有有关侧链的氨基酸置换一个氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分成4个家族:(I)酸性的,即天冬氨酸、谷氨酸;(2)碱性的,即赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性的,即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电荷的极性的,即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。一般而言,在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物活性不具有重大影响。相对于菌株630序列,所述多肽还可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)单个氨基酸缺失。相对于TcdA和/或TcdB序列,所述多肽还可以包括一个或更多个(例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如1、2、3、4或5个氨基酸中的每一个)。
[0202]类似地,与本发明一起使用的多肽可以包含这样的氨基酸序列,其:
[0203](a)与在序列表中公开的序列相同(即100%同一性);
[0204](b)与在序列表中公开的序列具有序列同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或更多);
[0205](c)与(a)或(b)的序列相比,具有I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个
或10个(或更多个)单个氨基酸改变(缺失、插入、置换),所述改变可以是在分开的位置,或者可以是连续的;和
[0206](d)当用逐对比对算法与得自序列表的特定序列比对时,从N-端向C-端的X个氨基酸的每个移动窗口(使得对于延伸到P个氨基酸的比对(其中P > X),存在P-X+1个这样的窗口 )具有至少X *y个相同的比对氨基酸,其中:Χ选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 0.50,0.60,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.91,0.92,0.93、0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99 ;并且如果x.y不是整数,则四舍五入至最接近的整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[46],其中使用默认参数(如缺口开放罚分=10.0,缺口延伸罚分=0.5,使用EBL0SUM62评分矩阵)。用EMBOSS包中的needle工具会方便地实施这种算法[47]。
[0207]—般而言,当本发明的多肽包含与得自序列表的完整艰难梭菌序列不同的序列时(例如当它包含与其具有〈100%序列同一性的序列表时,或当它包含其片段时),在每种单独情况下优选的是,所述多肽可以引起抗体,所述抗体识别它各自的毒素(TcdA或TcdB),优选在序列表中提供的完整艰难梭菌序列。
[0208]在使用杂合多肽的情况下,所述杂合体内的各个抗原(即各个-X-部分)可以来自一种或多种菌株。例如,在η = 2的情况下,X2可以来自与X1相同的菌株,或来自不同菌株。在η = 3的情况下,所述菌株可以是(DX1 = X2 = X3(Ii)Xi = X2 ^ X3(Iii)X1 ^ X2 =X3 (iv) X1 古 X2 古 X3 或(V)X1 = X3 ^ X2,等。
[0209]在组(C)内,缺失或置换可以是在N-端和/或C-端,或者可以在两个末端之间。因此,截短是缺失的一个例子。截短可以包括在N-端和/或C-端处缺失多达40个(或更多个)氨基酸。
[0210]免疫原性组合物和药物
[0211]在本文描述的抗原的背景下,术语“免疫原性的”用于指,该抗原能够引起针对它的来源野生型艰难梭菌蛋白的免疫应答,诸如细胞介导的应答和/或抗体应答,例如,当用于免疫受试者(优选哺乳动物,更优选人或小鼠)时。
[0212]本发明的免疫原性组合物包含根据本发明的抗原。本发明的免疫原性组合物可以用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即用于预防感染)或治疗性的(即用于治疗感染),但是通常是预防性的。术语“保护免于感染”是指,已经激发受试者的免疫系统(例如通过疫苗接种)以触发免疫应答和排斥感染。接种疫苗的受试者因而可能受到感染,但是能够比对照受试者更好地排斥感染。
[0213]组合物因而可以是药学上可接受的。它们经常包括除了抗原以外的组分,例如它们通常包括一种或更多种药用载体和/或赋形剂。在[48]中可得到这样的组分的彻底讨论。
[0214]通常将组合物以含水形式施用给哺乳动物。但是,在施用之前,所述组合物可以已经处于非含水形式。例如,尽管一些疫苗以含水形式制备,然后也以含水形式填充和分布和施用,将其它疫苗在制备过程中低压冻干并在使用时重构成含水形式。因此,可以干燥本发明的组合物,诸如低压冻干的制剂。
[0215]所述组合物可以包含防腐剂诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。但是,优选的是,所述疫苗应当基本上不含有(即小于5μg/ml)汞材料,例如不含硫柳汞。不含汞的疫苗是更优选的。不含防腐剂的疫苗是特别优选的。[0216]为了改善热稳定性,组合物可以包含温度保护剂。下面提供了这样的试剂的其它细节。
[0217]为了控制张度,优选的是,包含生理盐如钠盐。氯化钠(NaCl)是优选的,其可以以l-20mg/ml存在,例如约10±2mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱
水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。
[0218]组合物通常具有200m0sm/kg至400m0sm/kg的渗透压,优选240-360m0sm/kg,且更优选地落入290-310m0sm/kg的范围内。
[0219]组合物可以包含一种或多种缓冲液。典型缓冲剂包括:磷酸盐缓冲液;Tris缓冲液;硼酸盐缓冲液;琥珀酸盐缓冲液;组氨酸缓冲液(特别是含有氢氧化铝佐剂);或柠檬酸盐缓冲液。通常包括在5-20mM范围内的缓冲液。
[0220]组合物的pH通常为5.0-8.1,更通常为6.0-8.0,例如6.5-7.5,或者7.0-7.8。 [0221]所述组合物优选地为无菌的。所述组合物优选地为无热原的,例如每剂量含有<1EU(内毒素单位,标准量度),优选每剂量〈0.1EU0所述组合物优选地不含谷蛋白。
[0222]所述组合物可以包含用于单次免疫的物质,或者可以包含用于多次免疫的物质(即‘多剂量’试剂盒)。多剂量配置优选地包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案),可以将所述组合物包含容器中,所述容器具有用于取出物质的无囷接头。
[0223]通常以约0.5ml的剂量体积施用人疫苗,但是可以将一半剂量(即约0.25ml)施
用给儿童。
[0224]本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。优选地,一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。所述佐剂可以包括在下面进一步讨论的THl佐剂和/或TH2佐剂。
[0225]可以在本发明的组合物中使用的佐剂包括、但不限于:
[0226]?矿物盐,诸如铝盐和钙盐,包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)和硫酸盐等[例如参见参考文献49的第8章和第9章];
[0227]?水包油乳剂,诸如角鲨烯-水乳剂,包括MF59(5%角鲨烯、0.5%吐温80和0.5%Span85,使用微流态化仪配制成亚微米颗粒)[参考文献49的第10章,也参见参考文献50,-,53参考文献54的第10章和参考文献55的第12章]、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA);
[0228]?皂苷制剂[参考文献49的第22章],诸如QS21 [56]和ISCOMs [参考文献49的第23章];
[0229].病毒体和病毒样颗粒(VLP) [57-63];
[0230].细菌或微生物衍生物,诸如肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物[64、65]、免疫刺激性的寡核苷酸[66-71],诸如IC-31?[72](包含26-聚体序列5’-(IC)13-3’ (SEQ ID NO: 28)的脱氧核苷酸和包含11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQID NO:29)的聚阳离子聚合物多肽)和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物[73-82];
[0231]?人免疫调节剂,包括细胞因子,诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL_6、IL-7、IL-12[83、84]、干扰素(例如干扰素-Y )、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子;
[0232].生物粘着剂和粘膜粘着剂,诸如壳聚糖及其衍生物、酯化的透明质酸微球[85]或粘膜粘着剂,诸如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素[86];
[0233]?从可生物降解的且无毒的材料(例如聚U -羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成的微粒(即直径为~IOOnm至~150 μ m的颗粒,更优选地直径为~200nm至~30 μ m的颗粒,最优选地直径为~500nm至~10 μ m的颗粒);
[0234].脂质体[[49,87-89]的第13章和第14章;.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[90];
[0235].PCPP 制剂[91 和 92];
[0236]?胞壁酰多肽,包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰-1-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-MDP)、和N-乙酰基胞壁酰_1_丙氨酰基-d-异谷氨酰基-1-丙氨酸-2- 0- -2’ - 二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙KMTP-PE);和
[0237]?咪唑并喹诺酮化合物,包括咪喹莫特(Imiquamod)和它的同系物(例如“瑞喹莫德 3M” ) [93 和 94]。
[0238]本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以包含以上鉴定的一种或多种佐剂各个方面的组合。例如,可将以下佐剂组合物用于本发明中:(I)皂苷和水包油乳剂[95] ;(2)皂苷(例如QS21) +无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) [96] ; (3)皂苷(例如QS21) +无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) +胆固醇;(4)皂苷(例如QS21) +3dMPL+IL_12 (任选地+甾醇)[97];(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[98] ;(6)SAF,其含有10%角鲨烷、0.4%吐温80?、5%普流尼克- 嵌段共聚物L121和thr-MDP,或微流态化为亚微米乳剂或涡旋以产生较大粒度的乳剂,(7) Ribi?佐剂系统(RAS) (Ribi Immunochem),其含有2%角鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分,所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS),优选地MPL+CWS (Detox?);和(8) —种或多种矿物盐(诸如铝盐)+LPS的无毒衍生物(诸如3dMPL)。
[0239]充当免疫刺激剂的其它物质公开于[49]的第7章。
[0240]氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂的应用是特别优选的,且抗原通常吸附于这些盐。磷酸钙是另一种优选的佐剂。其它优选的佐剂组合包括Thl和Th2佐剂的组合,诸如CpG和明矾,或瑞喹莫德和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合(已经报道这在肺炎球菌免疫中是有效的[99])。
[0241]本发明的组合物可以引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。该免疫应答优选地诱导持久的(例如中和)抗体和在暴露于艰难梭菌以后可以快速地做出应答的细胞介导的免疫。
[0242]通常认为两类T细胞(CD4和CD8细胞)是启动和/或增强细胞介导的免疫和体液免疫所必需的。⑶8T细胞可以表达⑶8共受体,且通常被称作细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)。⑶8T细胞能够识别在MHC I类分子上展示的抗原或与其相互作用。
[0243]⑶4T细胞可以表达⑶4共受体,且通常被称作T辅助细胞。⑶4T细胞能够识别与MHC II类分子结合的抗原多肽。与MHC II类分子相互作用后,CD4细胞可以分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可以激活B细胞、细胞毒性的T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可以进一步分为两个在功能上不同的子集:SP在它们的细胞因子和效应子功能方面不同的THl表型和TH2表型。[0244]活化的THl细胞会增强细胞免疫(包括抗原特异性的CTL生成的增加),并因此在对细胞内感染做出响应时具有特定价值。活化的THl细胞可以分泌IL-2、IFN- Y和TNF-β中的一种或多种。THl免疫应答可以通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)而导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞的生长,THl免疫应答也可以用于放大免疫应答。THl刺激的B细胞可以分泌IgG2a。
[0245]活化的TH2细胞会增加抗体生成,并因此在对细胞外感染做出响应时具有价值。活化的TH2细胞可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可以导致IgGl、IgE, IgA和记忆B细胞的产生用于将来的保护。
[0246]增强的免疫应答可以包括增强的THl免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。
[0247]THl免疫应答可以包括以下一种或多种:CTL的增加,与THl免疫应答有关的一种或多种细胞因子(诸如IL-2、IFN-Y和TNF-β)的增加,活化的巨噬细胞的增加,NK活性的增加,或IgG2a生成的增加。优选地,增强的THl免疫应答包括IgG2a生成的增加。
[0248]可以使用THl佐剂引发THl免疫应答。相对于不用佐剂的抗原的免疫接种,THl佐剂通常引起增加的IgG2a生成水平。适用于本发明中的THl佐剂可以包括例如皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性的寡核苷酸。免疫刺激性的寡核苷酸(诸如含有CpG基序的寡核苷酸)是用于本发明中的优选THl佐剂。
[0249]TH2免疫应答可以包括以下一种或多种--与TH2免疫应答有关的一种或多种细胞因子(诸如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加,或IgGl、IgE, IgA和记忆B细胞生成的增加。优选地,增强的TH2免疫应答包括IgGl生成的增加。
[0250]可以使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫接种,TH2佐剂通常引起增加的IgGl生成水平。适用于本发明中的TH2佐剂包括例如,含矿物质的组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质的组合物(如铝盐)是用于本发明中的优选TH2佐剂。
[0251]优选地,本发明包括包含THl佐剂和TH2佐剂的组合的组合物。优选地,这样的组合物会引起增强的THl和增强的TH2应答,即,IgGl和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫接种的增加。更优选地,相对于使用单一佐剂的免疫接种(即,相对于只用THl佐剂的免疫接种或只用TH2佐剂的免疫接种),包含THl和TH2佐剂的组合的组合物会引起增加的THl免疫应答和/或增加的TH2免疫应答。
[0252]所述免疫应答可以是THl免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。优选地,免疫应答提供增强的THl应答和增强的TH2应答中的一种或两种。
[0253]增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地,所述免疫应答提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地,粘膜免疫应答为TH2免疫应答。优选地,粘膜免疫应答包括IgA生成的增加。
[0254]可以将本发明的组合物制备成不同的形式。例如,可以将所述组合物制备为液体溶液或混悬液形式的注射剂。也可以制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如低压冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备所述组合物用于局部给药,例如作为软膏剂 、乳膏剂或粉末。可以制备所述组合物用于口服给药,例如作为片剂或胶囊剂、作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地经过调味)。可以制备所述组合物用于采用细粉或喷雾进行肺给药,例如作为吸入剂。可以将所述组合物制备为栓剂或子宫托。可以制备所述组合物用于鼻、 耳或眼给药,例如作为滴剂。所述组合物可以呈试剂盒形式,设计成在即将施用给患者之前重构合并的组合物。这样的试剂盒可以包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种低压冻干的抗原。
[0255]当在使用前即时制备组合物(例如,以低压冻干形式提供组分)并以试剂盒形式提供时,该试剂盒可以包含两个管形瓶,或者它可以包含一个已填充的注射器和一个瓶,所述注射器的内容物用于在注射前再次激活所述瓶的内容物。
[0256]用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学上有效量的抗原以及需要的任意其它组分。“免疫学上有效量”是指,在单次剂量中或作为一系列剂量的一部分施用给个体的对治疗或预防而言有效的量。该量随以下因素而变化:待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预见到,所述量将落入通过常规试验可以确定的相对宽范围内。如果在组合物中包含超过一种抗原,那么两种抗原可以以彼此相同的剂量或以不同的剂量存在。
[0257]如上所述,组合物可以包含温度保护剂,且该组分可能在含佐剂的组合物(特别是含有矿物质佐剂诸如铝盐的那些)中是特别有用的。如在参考文献100中所述,可以将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其冰点,例如将冰点降低至0°C以下。因此,可以将组合物储存在0°C以下但在其冰点以上以便抑制热分解。温度保护剂还允许冷冻组合物,同时保护矿物盐佐剂免于在冷冻和融化后凝聚或沉降,并且还可以在高温(例如40°C以上)保护组合物。可以混合起始水性疫苗和液体温度保护剂,使得该液体温度保护剂形成最终混合物的1-80体积%。合适的温度保护剂应该是人施用安全的、易混溶的/可溶于水的,并且不应损害组合物的其它组分(例如抗原和佐剂)。例子包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG可以具有200-20,OOODa的平均分子量。在一个优选的实施方案中,聚乙二醇可以具有约300Da( ‘PEG-300’)的平均分子量。
[0258]通过混合以下组分可以形成本发明的组合物:(i)水性组合物,其包含本发明的抗原组合的2种或更多种(例如2种、3种或4种)抗原,(ii)温度保护剂。然后可以将该混合物储存于例如(TC以下、0-20°C、20-35°C、35-55°C或更高温度。它可以以液体或冷冻形式储存。可以低压冻干该混合物。可替换地,通过混合以下组分可以形成所述组合物:(i)干燥组合物,其包含本发明的抗原组合的2种或更多种(例如2种、3种或4种)抗原;(ii)液体组合物,其包含温度保护剂。因此,可以利用组分(ii)重构组分(i)。
[0259]治疗方法和疫苗施用
[0260]本发明还提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法,所述方法包括下述步骤:施用有效量的本发明的组合物。
[0261]本发明还提供了一种免疫原性组合物,其包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含 a)ToxB-GT 抗原和 TcdA 抗原(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 种或更多种TcdA的多肽片段);和/或b) ToxA-GT抗原和TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种TcdB的多肽片段),所述抗原用作药物,例如用于在哺乳动物中引起免疫应答。特定免疫原性组合物包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含(i) ToxB-GT抗原和ToxA-P5-6抗原或(ii)ToxB-GT抗原和ToxA-B2抗原,所述抗原用作药物,例如用于在哺乳动物中引起免疫应答。[0262]本发明还提供了一种免疫原性组合物,其包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含 a)ToxB-GT 抗原和 TcdA 抗原(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 种或更多种TcdA的多肽片段);和/或b) ToxA-GT抗原和TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种TcdB的多肽片段),所述抗原用于制备在哺乳动物中引起免疫应答的药物。特定免疫原性组合物包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含(i) ToxB-GT抗原和ToxA-P5-6抗原或(ii)ToxB-GT抗原和ToxA-B2抗原,所述抗原用于制备在哺乳动物中引起免疫应答的药物。
[0263]所述免疫应答优选地是保护性的,且优选地涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以引起加强应答。
[0264]通过用这些应用和方法在哺乳动物中引起免疫应答,可以保护哺乳动物免于艰难梭菌感染。更具体地,可以保护哺乳动物免于CDAD,包括腹泻、抗生素有关的腹泻(AAD)、腹部疼痛、发热、白细胞增多、假膜性结肠炎或中毒性巨结肠中的一种或多种。本发明的组合物对各种不同血清型的艰难梭菌是有效的。本发明的组合物可用于保护免于由艰难梭菌菌株 630、Β1、Β1/ΝΑΡ1/027(核糖型 027)、R20291 (SM)、196、BIl、M120M68、855、QCD_63q42、ATCC43255、CIP107932、QCD_23m63、QCD_32g58、QCD_37x79、QCD_63q42、QCD_66c26、QCD-76w55、QCD-97b34、CD196、CDBIl、CDCF5、CDSM、CDM68、CDM120*R20291 等引起的 CDAD。
[0265]本发明还提供了包含第一组分和第二组分的试剂盒,其中第一组分和第二组分都不是如上所述的本发明组合物,但是其中可以组合所述第一组分和第二组分以提供如上所述的本发明组合物。所述试剂盒可以进一步包括含有以下一种或多种的第三组分:说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
[0266]本发明还提供了一种预填充了本发明的免疫原性组合物的递送装置。 [0267]所述哺乳动物优选地是人、大型兽医哺乳动物(例如马、牛、鹿、山羊、猪)和/或家养宠物(例如狗、猫、沙鼠、仓鼠、豚鼠、毛丝鼠)。最优选地,所述哺乳动物优选地是人。根据本发明的免疫原性组合物可以用于治疗儿童和成年人。因此,人患者可以是小于I岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者是老年人(例如≤50岁,≤60岁,优选≤65岁)、年轻人(如< 5岁)、住院患者、健康护理工作者、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。但是,所述疫苗不仅适用于这些群体,可以用于更广泛的群体。
[0268]检查治疗性处理的效力的一种方式包括,在施用本发明的组合物以后,监测艰难梭菌感染。一种检查预防性处理的效力的方法包括,在施用本发明的组合物以后,监测针对所述组合物中抗原的全身免疫应答(诸如监测IgGl和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(诸如监测IgA产生水平)。通常,在免疫接种之后但是在攻击之前确定抗原特异性的血清抗体应答,而在免疫接种之后和在攻击之后确定抗原特异性的粘膜抗体应答。
[0269]评估本发明组合物的免疫原性的另一种方法是重组地表达蛋白,用于通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者样品之间的阳性反应指示,该患者已经对目标蛋白产生免疫应答。该方法也可以用于鉴定免疫显性的抗原和/或抗原中的表位。
[0270]通过用疫苗组合物攻击艰难梭菌感染的动物模型(例如,仓鼠、豚鼠或小鼠),也可以在体内确定疫苗组合物的效力。本文描述了一种这样的模型。
[0271]本发明的组合物通常直接施用给患者。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射至组织的间质间隙),或通过粘膜,诸如通过直肠、口服(例如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用,可以实现直接递送。
[0272]本发明可以用于引起全身免疫和/或粘膜免疫,优选地用于引起增强的全身免疫和/或粘膜免疫。
[0273]优选地,增强的全身免疫和/或粘膜免疫表现为增强的THl和/或TH2免疫应答。优选地,所述增强的免疫应答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。
[0274]可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中,可以通过相同或不同的途径施用多个剂量,例如胃肠外激发和粘膜加强,粘膜激发和胃肠外加强等。通常间隔至少I周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用多剂量。
[0275]可以将通过本发明生产的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)施用给患者,例如与肺炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、联合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌的联合疫苗(诸如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗等基本上同时施用。
[0276]粘膜免疫
[0277]本发明提供了一种免疫原性组合物,其包含:⑴包含ToxB-GT和一种或多种TcdA的多肽片段(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种TcdA的多肽片段)的多肽,和/或包含ToxA-GT和一种或多种TcdB的多肽片段(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种TcdB的多肽片段)的多肽,和(ii)细菌ADP-核糖基化毒素和/或它们的脱毒衍生物。本发明还提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法,所述方法包括下述步骤:给所述哺乳动物施用有效量的这样的免疫原性组合物。
[0278]本发明的组合物的其它抗原组分
[0279]本发明还提供了进一步包含至少一种其它艰难梭菌抗原的组合物。其它艰难梭菌抗原包括例如糖抗原。使用本领域已知的标准缀合技术,可以将糖抗原缀合至本发明的肽上。用于本发明的组合物中的一种优选糖抗原是细胞壁多糖11(在本文中被称作“PS-1I”),其被认为是艰难梭菌中的保守表面抗原。PS-1I重复单元的结构描述在[101]中:
[0280][ — 6) - β -D-Glcp-(I — 3) - β -D-GalpNAc-(I — 4) - a -D-Glcp- (I — 4) - [ β -D-GlcP- (I — 3] - β -D-GalpNAc-(I — 3) - α -D-Manp-(I — P]
[0281]例如,上述的多肽(诸如ToxB-GT)可以化学缀合到例如PS-1I上。
[0282]本发明还提供了进一步包含至少一种不是艰难梭菌抗原的抗原的组合物。
[0283]具体地,本发明还提供了一种组合物,其包含本发明的多肽和下述其它抗原中的一种或多种:
[0284]-得自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群A、C、W135和/或Y(优选所有4种)的糖抗原。
[0285]-得自肺炎链球菌的糖或多肽抗原[例如102,103,104]。
[0286]-得自甲型肝炎病毒(诸如灭活病毒)的抗原[例如105,106]。[0287]-得自乙型肝炎病毒的抗原,诸如表面抗原和/或核心抗原[例如106,107]。
[0288]-白喉抗原,诸如白喉类毒素[例如参考文献108的第3章]或CRM197突变体[例如 109]。
[0289]-破伤风抗原,诸如破伤风类毒素[例如参考文献108的第4章]。
[0290]-得自百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的抗原,诸如得自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA),任选地也与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3组合[例如参考文献110和111]。
[0291]-得自流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)B的糖抗原[例如112]。
[0292]-脊髓灰质炎抗原[例如113,114]诸如IPV。
[0293]-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献108的第9、10和11章]。
[0294]-流感抗原[例如参考文献108的第19章 ],诸如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
[0295]-得自粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)的抗原[例如115]。
[0296]-得自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) (B群链球菌)的蛋白抗原[例如116,117]。
[0297]-得自无乳链球菌(B群链球菌)的糖抗原。
[0298]-得自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes) (A群链球菌)的抗原[例如117、118,119]。
[0299]-得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原[例如120]。
[0300]所述组合物可以包含这些其它抗原中的一种或多种。
[0301]在必要时,可以将毒蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式将百日咳毒素脱毒[111])。
[0302]在所述组合物包含白喉抗原的情况下,还优选地包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地,在包括破伤风抗原的情况下,还优选地包括白喉和百日咳抗原。类似地,在包括百日咳抗原的情况下,还优选地包括白喉和破伤风抗原。因此,DTP组合是优选的。
[0303]糖抗原优选地呈缀合物的形式。所述缀合物的载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒素、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白[121]、合成的多肽[122、123]、热激蛋白[124、125]、百日咳蛋白[126、127]、得自流感嗜血杆菌的蛋白0[128]、细胞因子[129]、淋巴因子[129]、链球菌蛋白、激素[129]、生长因子[129]、得自艰难梭菌的毒素A或B[130]、铁摄取蛋白[131]等。一种优选的载体蛋白是白喉毒素的CRM197突变体[132]。
[0304]所述组合物中的抗原通常以每种至少I μ g/ml的浓度存在。一般而言,任意给定抗原的浓度足以引起针对该抗原的免疫应答。
[0305]作为在本发明的免疫原性组合物中使用蛋白抗原的替代方案,可以使用编码抗原的核酸(优选DNA,例如以质粒的形式)。
[0306]优选地将抗原吸附至铝盐上。
[0307]杭体
[0308]针对艰难梭菌TcdA和TcdB的抗体可以用于被动免疫法[例如133、134、135、136、137、138和139]。因此,本发明提供了本文中公开的本发明的抗原组合的对应的且特异性的抗体的组合。优选地,所述组合物包含:对ToxB-GT抗原和/或其表位特异性的抗体和对TcdA抗原和/或其表位特异性的抗体;和/或对ToxA-GT抗原和/或其表位特异性的抗体和对TcdB抗原和/或其表位特异性的抗体。提供根据本发明的抗体的组合用于同时、单独或先后施用。本发明也提供了包含这样的抗体的免疫原性组合物和药物组合物。在本文中,在本发明范围内,术语“抗体”包含本发明的抗体的组合。本发明还提供了包含本发明的抗体的组合的组合物。
[0309]本发明还提供了本发明的抗体在医学和在疗法中的用途。例如用于针对CDAD的被动免疫法。本发明还提供了一种用于治疗哺乳动物的方法,所述方法包括下述步骤:施用有效量的这样的组合物。如上面关于免疫原性组合物所述,这些方法和用途允许保护哺乳动物免于CDAD。具体地,本发明的抗体可以用于治疗或预防艰难梭菌感染的方法中,所述方法包括下述步骤:给所述哺乳动物施用有效量的如本文中所述的抗体的组合或包含这样的组合的组合物。在这些方法中,可以同时地、单独地或顺序地施用至少2种(例如2、3或4种)本发明的抗体。
[0310]术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子、及其能够结合抗原的片段。这些包括杂合的(嵌合的)抗体分子[140、141] ;F(ab' ) 2和F(ab)片段和Fv分子;非共价的异源二聚体[142、143];单链Fv分子(sFv) [144] ;二聚体和三聚体抗体片段构建体;微体[145、146];人源化抗体分子[147-、149];和从这样的分子得到的任意功能片段,以及通过非常规方法(诸如噬菌体展示)得到的抗体。优选地,所述抗体是单克隆抗体。得到单克隆抗体的方法是本领域众所周知的。人源化抗体或全人抗体是优选的。可以纯化或分离本发明的抗体和抗体组合。
[0311]本发明还提供了一种用于制备本发明的抗体组合的混合物的方法,所述方法包括以下步骤:混合如上定义的抗体组合中的任一个组合的抗体。例如,本发明提供了一种方法,其包括混合至少2种(即2、3或4种)选自以下的抗体的步骤:(a)识别ToxA-GT抗原和/或其表位的抗体,和识别TcdB抗原和/或其表位的抗体。例如,所述方法可以包括以下步骤:混合识别ToxA-GT抗原和/或其表位的抗体,和识别TcdB抗原和/或其表位的抗体。本发明还提供了一种方法,其包括混合至少2种(即2、3或4种)选自以下的抗体的步骤:(a)识别ToxB-GT抗原和/或其表位的抗体,和识别TcdA抗原和/或其表位的抗体。例如,所述方法可以包括以下步骤:混合识别ToxB-GT抗原和/或其表位的抗体,和识别TcdA抗原和/或其表位的抗体。根据本发明的用于制备抗体混合物的方法可以包括将所述混合物配制为药物的另外的步骤。这样的方法可以进一步包括包装所述制剂用于作为药物进行贮存或分布的步骤。
[0312]鍵
[0313]除非另有说明,否则本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法,这些方法在本领域技术范围内。这样的技术在文献中进行了充分解释。参见,例如,[150-157等]。
[0314]在本发明涉及“表位”的情况下,该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位。可以凭经验鉴定这样 的表位(例如使用PEPSCAN[158、159]或类似的方法),或可以进行预测(例如使用Jameson-Wolf抗原指数[160]、基于矩阵的方案[161]、ΜΑΡΙΤ0ΡΕ [162]、TEPIT0PE[163、164]、神经网络[165]、OptiMer 和 EpiMer [166、167]、ADEPT[168]、T 位点[169]、亲水性[170]、抗原指数[171]或在[172-176等]中公开的方法)。表位是抗原的被抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的部分,也可以被称作“抗原决定簇”。
[0315]在该文件中使用的术语“抗原”和“氨基酸序列”应当用于包括对以上序列中的每一个以及对它们的片段、同系物、衍生物和变体的提及。术语“毒素”表示有毒的物质、特别是蛋白,其由活细胞或生物体产生,且能够在引入受试者的组织中时造成疾病,且经常能够在受试者中诱导中和抗体或抗毒素的产生。
[0316]术语“类毒素”表示,已经经历“脱毒”或“类毒素化”(例如通过重组方式、通过化学修饰等)、但是已经维持它的与抗-毒素抗体结合或诱导抗-毒素抗体产生(例如当施用给受试者时)的能力的毒素或其片段。
[0317]术语“中和滴度”表示,包含抑制或中和传染体(例如毒素)的生物学效应的“中和肽”或“中和抗体”的组合物。
[0318]在抗原“结构域”缺失的情况下,这可能涉及信号多肽、细胞质结构域、跨膜结构域、细胞外结构域等的缺失。
[0319]术语“包含”包括“包括”以及“由...组成”,例如,“包含”X的组合物可以排它地由X组成,或者可以包含其它物质,例如X+Y。
[0320]术语”由……组成”是指“包括且限于”。
[0321]术语”基本上由……组成”是指,所述组合物、方法或结构可以包含另外的成分、步骤和/或部分,但是只有当所述另外的成分、步骤和/或部件不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的 基础特征和新颖特征时。
[0322]与数值X相关的术语“约”是指例如x± 10%。
[0323]对两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比的提及表示,当进行比对时,所比较的两个序列中相同的氨基酸的百分比。使用本领域已知的软件程序,例如在参考文献177的7.7.18部分中描述的那些,可以进行该比对并确定同源性或序列同一性百分Ito通过Smith-Waterman同源性检索算法确定优选比对,所述算法使用仿射缺口检索,其中缺口开放罚分为12,缺口延伸罚分为2,BLOSUM矩阵为62。在参考文献178中公开了Smith-Waterman同源性检索算法。
【专利附图】

【附图说明】
[0324]图1.在该研究中使用的重组毒素片段的示意图。除了在桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)中表达的ToxA_GT以外,在大肠杆菌中表达所有多肽。ED=酶促结构域;GT =葡萄糖基转移酶结构域;CP =半胱氨酸蛋白酶结构域;T =易位结构域;Β =结合结构域。除了不溶性的TcdA的Τ4和ΡΤΑ2结构域以外,所有结构域是可溶性的。
[0325]图2.将ΤοχΑ-Β2设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的6个。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。
[0326]图3.将ΤοχΑ-Β3设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的12个。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。
[0327]图4.将ΤοχΑ-Β5设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的10.5个。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。
[0328]图5.将ToxA-B6设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的11.5个。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。
[0329]图6.将ToxB-B2设计成包括9个假定的形成结合结构域的结构单元中的4个。使用C-端片段的晶体结构作为模板,通过计算机建模,预测TcdB结合结构域的三维结构(参见参考文献41,PDB代码2F6E)。
[0330]图7.B4杂合体的示意图。将ToxB_GT(SEQ ID NO: 18)经由接头肽(SEQ ID NO: 25)与 ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11)融合。
[0331]图8.总结了用于鉴别候选物片段的实验策略的程序框图。
[0332]图9.通过ELISA确定的、针对TcdA (A)和TcdB(B)的子结构域的抗体的几何平均滴度(GMT)。
[0333]图10.体外中和实验的实施例,所述实验显示了 TcdA/B诱导的细胞圆化和针对ToxA_B2+ToxB-GT的血清的中和。
[0334]图11.在仓鼠研究 中使用的毒素结构域片段的示意图。ED =酶促结构域;GT =葡萄糖基转移酶结构域;CP =半胱氨酸蛋白酶结构域;T =易位结构域;Β =结合结构域。
[0335]图12.类毒素A+类毒素B。在粪便中的平均细菌脱落。用BI攻击。
[0336]图13.类毒素A+类毒素B-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA” =有关的组织。Y=轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
[0337]图14.ToxB_B+P5_6_在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(x=轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA” =有关的组织。Y =轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
[0338]图15.在图29中提供的数据的图解表示。
[0339]图16.得自用P5_6+ToxB_B或对照免疫的仓鼠的IOOmg粪便中的艰难梭菌孢子的细菌脱落。用BI菌株攻击。
[0340]图17.P5_6+ToxB_B或对照。用BI菌株攻击。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col”=结肠;“Cae”=盲肠;“LA”=有关的内腔;“TA”=有关的组织。Y=轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
[0341]图18.使用ToxB_GT+P5+6的免疫。在接种疫苗的动物的粪便中的定殖/(仓鼠(上图)和平均(下图))。用630菌株攻击。
[0342]图19.ToxB_GT+P5_6最终定殖结果。用630菌株攻击。
[0343]图20.ToxB_GT+P5_6。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用BI菌株攻击。
[0344]图21.ToxB_GT+P5_6。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(x=轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA” =有关的组织。Y =轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用BI菌株攻击。
[0345]图22.ToxA-P5-6+ToxB_GT (减小的剂量)。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用BI菌株攻击。
[0346] 图23.ToxA-P5_6+ToxB_GT (减小的剂量)。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col”=结肠;“Cae”=盲肠;“LA”=有关的内腔;“TA”=有关的组织。Y =轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用BI菌株攻击。
[0347]图24.使用ToxB_GT(PSII)+P5_6的免疫。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用630菌株攻击。一些动物失去了特定时间点,例如在动物于收集当天不能产生粪便(特别是在腹泻阶段以后)或在特定时间点具有腹泻的情况下。
[0348]图25.得自存活的接种疫苗的动物(ToxB_GT (PSII) +P5_6 (H1-H6)或ToxB_GT+P5_6 (H7-8))的粪便中脱落的艰难梭菌的平均数目。
[0349]图26(a和b).ToxB_GT (PSII)+P5_6结果-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA”=有关的组织。Y=轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
[0350]图27.ToxB_GT+ToxA_B2。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用BI菌株攻击。
[0351]图28 (a和b).ToxB_GT+ToxA_B2。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA” =有关的组织。Y =轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用BI菌株攻击。
[0352]图29.ToxB_GT+ToxB_B+P5_6。接种疫苗的动物的粪便中的平均定殖。
[0353]图30.ToxB_GT+ToxB_B+P5_6。用BI攻击。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA”=有关的组织。Y=轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
[0354]图31.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2-100mg 粪便中的艰难梭菌孢子的平均细菌脱落。用BI攻击。
[0355]图32.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2-在淘汰时的定殖。用 BI 攻击。
[0356]图33.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2 (较低剂量)-1OOmg 粪便中的艰难梭菌孢子的平均细菌脱落。用BI攻击。
[0357]图34.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2 (较低剂量)~在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(X =轴是位置:“Col” =结肠;“Cae” =盲肠;“LA” =有关的内腔;“TA”=有关的组织。Y=轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用BI攻击。
[0358]图35.克林霉素处理以后的微生物菌群变化。
[0359]图36.在接种疫苗的动物中对微生物丛的改变。
[0360]图37.重组纯化的片段的SDS-PAGE凝胶。
[0361]图38.抗-ToxA (A)和ToxB (B) IgG滴度(UE/mL),添加明矾或MF59作为佐剂。用重组ToxA(A)和ToxB片段⑶免疫小鼠以后的IgG应答。通过ELISA测量得自小鼠的血清中的抗毒素A和毒素B IgG滴度,所述小鼠用每种片段和Al (OH) 3 (对中的左列)或MF59 (对中的右列)佐剂腹膜内地免疫。将结果显示为至少3个实验的几何平均值土SD。
[0362]图39:得自仓鼠的盲肠样品中针对毒素A(A)和毒素B(B)的IgG抗体,所述仓鼠用TOXA-P5-6+TOXB-GT接种疫苗。在过滤的盲肠样品上进行斑点印迹,所述盲肠样品取自感染急性期(攻击后48小时)(仓鼠1-2)和实验端点(攻击后14天)(仓鼠3-8)的接种疫苗的动物。对照动物仅用佐剂处理并在相同实验条件中感染(仓鼠9-10)。
[0363]图40:用ToxA-P5-6+ToxB_GT组合接种疫苗的仓鼠中的毒素A和B水平。值是细胞圆化所需的稀释倍数。过滤的盲肠样品取自感染急性期(攻击后48小时)和实验端点(攻击后14天)的接种疫苗的动物。对照动物仅用佐剂处理并在相同实验条件中感染。
【具体实施方式】
[0364]发明人鉴别出了 TcdA和TcdB的重组片段,其可以用作免疫原用在预防CDAD的疫苗中。
[0365]丑段
[0366]在图8中提供了实验方案的示意图。发明人设计了一组基于毒素的TcdA和TcdB片段(11种TcdA片段和6种TcdB片段)。在图1中描述了在该研究中使用的基于毒素的片段。选择这些片段来覆盖尽可能远的TcdA和TcdB的完整长度,并基于它们的晶体结构来确定这些片段的边界。在ToxA和ToxB的细胞结合结构域(概要参见图1)的情况下,使用计算机模型。通过使用重组技术,可能使用表达系统(例如大肠杆菌、桥石短芽孢杆菌等)来容易地产生多肽片段,并且其比灭活的类毒素更稳定和更耐受降解,同样还避免许多关于灭活类毒素的应用的安全性担忧。将在实施例中使用的包含ToxA-GT或ToxB-GT的片段脱毒。在图37中显示了用于免疫接种的肽的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。
[0367]重组毒素片段的克隆、表达和纯化
[0368]使用聚合酶不完全引物延伸(PolymeraseIncomplete Primer Extension, PIPE)方法,将序列克隆进petl5b+载体(Nterm-HIS标签)中。正常的PCR产生不完全延伸产物的混合物。使用简单引物设计,将短重叠序列引入在这些不完全延伸混合物的末端,这允许互补链对合和产生杂合的载体/插入物组合。将所有杂合体直接转化进大肠杆菌HKlOO受体细胞中。选择单个氨苄西林抗性菌落,并通过菌落PCR检查重组质粒的存在。用从阳性克隆(ToxA_GT,在桥石短芽孢杆菌中表达)纯化的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将ToxA-p5-6抗原表达为包含SEQ ID N0104的N-端氨基酸序列和SEQ ID N0105的C-端氨基酸序列的杂合多肽。该杂合多肽的氨基酸序列显示在SEQ ID NOlll中。SEQ IDNO: 111由SEQ ID NO: 112的核酸序列编码。
[0369]采用PIPE方法来制备具有废除的酶活性的ToxA-GT (Y283A、D285A、D287A)、TcdA-CP (D589A、H655A和 C700A,相对于 SEQ ID NO:1 编号),ToxB-GT (D270A、R273A、Y284A、D286A 和 D288A)和 ToxB-CP (D587A、H653A 和 C698A)突变体。
[0370]如下诱导蛋白表达:在指数生长期中,将ImM IPTG(异丙基β -D_l_硫代吡喃半乳糖苷)加入到培养物中,随后在25°C温育4小时。将细胞提取物加载上SDS-PAGE凝胶以检查蛋白表达(数据未显示)。 [0371]对于ToxA_GT,将野生型艰难梭菌毒素A的催化域(残基1_541)克隆进pNI_His载体(Takara Bio)中。进行定位诱变,以得到(Y283A、D285A、D287A) ToxA-GT突变体。将质粒电穿孔进桥石芽抱杆菌(B.choshinensis)HPD31-SP3菌株(Takara Bio)中。将桥石芽孢杆菌表达细胞在TMNm中在25°C、1600rpm培养48小时。通过IMAC色谱法纯化蛋白,并使用TO-?Ο脱盐柱(GE)将其缓冲液交换进PBS中。通过BCA测定,进行蛋白定量。
[0372]对于一些实验,在还原端化学修饰重复单元的甘露糖以后,将PSII缀合至2种不同的载体蛋白(艰难梭菌重组蛋白:ToxA_B2和ToxB_GT)。第一步是在IOmM NaPi缓冲液(pH9.0)中在室温用50mM NaBH4(Sigma)还原甘露糖2小时;将还原的PSII通过S印hadexG25色谱法(G&EHealthcare)在水中纯化,然后用15当量的NaIO4(Sigma)在IOmM NaPi缓冲液(PH7.2)中在室温在暗处氧化2小时。然后将氧化的PSII通过S印hadex G25色谱法(G&E Healthcare)在水中纯化。然后使用4:1 (PSII重量/蛋白重量)的化学计量学,在 200mM NaPi/IM NaCl 缓冲液(pH8.0)中和在有 NaBH3CN(2:1, PSII 重量 /NaBH3CN 重量)存在下,将氧化的PSII(10mg/ml)缀合至载体蛋白。将混合物在37°C温育48-72小时,用磁力搅拌器非常轻柔地混合。使用尺寸排阻Superdex75色谱法(G&E Healthcare)在IOmM NaPi/lOmM NaCl缓冲液(pH7.2)中,从多余的未缀合的PSII中纯化缀合物。使用7% Tris-乙酸盐凝胶(NuPAGE,得自Invitrogen)在NuPAGE Tris-乙酸盐SDS运行缓冲液(20x, Invitrogen)中通过SDS-PAGE表征缀合物。通过MicroBCA蛋白测定试剂盒(ThermoScientific)确定蛋白浓度。通过HPAEC-PAD分析确定总糖浓度。将未缀合的糖通过SPEC4疏水相互作用柱(0.5mL树脂,Bioselect, Grace Vydac)分离,并随后通过HPAEC-PAD分析进行估测。
[0373]类毒素A和类毒素B的纯化和灭活
[0374]将艰难梭菌菌株VPI10463孢子储备物接种在BHIS平板(补充了酵母浸出物[5mg/ml]和L-半胱氨酸[0.1% ]的脑心 浸液)上,并在36°C温育2天。将菌落从制备的平板添加至胰蛋白胨-酵母浸出物-甘露醇(TYM)培养基中,并在厌氧室中在35°C温育16小时。将200 μ 190%甘油与800 μ I艰难梭菌培养物(在590nm为10D) —起加入1-ml冷冻瓶中。立即将该瓶放入_80°C冰柜中进行贮存。将100 μ I甘油储备物加入IOml TYM培养基中并在厌氧室中在35°C温育16小时。给每I毫升胰蛋白胨-酵母浸出物(TY)培养基接种种子培养物(1/100稀释度)。将培养物在厌氧室中在35°C温育5天。然后将样品在4°C在3000g离心15分钟,并穿过0.22 μ m孔径过滤器过滤。然后通过切向流过滤浓缩上清液。
[0375]级分1:AS50
[0376]在0°C历时2h将80.03g硫酸铵加入到在胰蛋白胨酵母浸出物培养基(265ml)中的、得自菌株VPI10463的6倍浓缩的培养物上清液(50%饱和度)中。继续在(TC搅拌3h,然后通过在4°C在1000Orpm离心30分钟使沉淀物沉淀。将沉淀物再悬浮于缓冲液A中并在4°C通过 2 次缓冲液更换(A:50mM Tris-HCl,ρΗ7.5,50mM NaCl ;B:50mM Tris-HCl,ρΗ7.5,IM NaCl) (2x11)进行透析,得到27ml (级分I)终体积的浓度为6.118mg/ml的mini BCA0
[0377]级分II =HiTrap Q HP, ρΗ7.5
[0378]通过在2x5ml HiTrap Q HP柱(串联)上的色谱法,分离ToxA和ToxB。以2ml/min,施加30柱体积的从O至100% B的线性梯度。ToxA在20% B附近洗脱,ToxB在50%B附近洗脱(数据未显示)。在Tris-乙酸盐缓冲液中在7% PAA凝胶上分析20 μ I级分1、4、14-44(数据未显示)。
[0379]级分IIIb =HiTrap Q HP, ρΗ5.0
[0380]通过在HiTrap Q HP上的色谱法在ρΗ5.0进一步纯化ToxB (级分IIb)。缓冲液包括 C:20mM 哌嗪-HCl,pH5.0,50mM NaCl ;D,20mM 哌嗪 _HCl,pH5.0,IM NaCl。施加分段梯度:30-60% D, 15柱体积。ToxB在40% D洗脱(数据未显示)。在7% PAA凝胶上在Tris-乙酸盐缓冲液中分析10 μ I每种级分(数据未显示)。
[0381]级分IIIa =HiTrap Q HP, ρΗ7.5
[0382]以2ml/min将30柱体积的B施加于2-20%的分段梯度。ToxA在15% B附近洗脱。在7% PAA凝胶上在Tris-乙酸盐缓冲液中分析20 μ I每种级分(数据未显示)。将洗脱液(Pool)在 2150mM Tris_HCl、50mM NaCl 中在 4°C透析过夜。终体积:52ml (级分 IIIa)。
[0383]进行最终的质量控制。
[0384]对蛋白质印迹,将制品加载到7% Tris乙酸盐SDS-PAA凝胶上,并使用1-Blot机器转移至硝酸纤维素(12min转移)。将膜在TBST中洗涤3次,并用I % BSA(Promega)在TBST中封闭过夜。以1:5000在TBST中加入第一抗体保持Ih。将膜在TBST中洗涤3次各5min。以1:8000在TBST中加入第二抗体(Promega抗-兔AP缀合物)保持45min。将印迹在TBST中洗涤3次并在MilliQ水中洗涤2次各5min。将印迹在稳定化的AP底物(Promega)中显影20秒(数据未显示)。
[0385]发现ToxA和Tox B制品完全没有交叉污染。
[0386]为了持久贮存,进行透析。透析缓冲液包含50mM Tris-HCl、500mM NaCl和10%甘油。通过2次500ml缓冲液更换,透析样品。在透析以后定量样品(数据未显示)。
[0387]类毒素的脱毒
[0388]将制品在PBS中透析。Tris可以与甲醒反应。从1.5mg每种蛋白(ToxA:1.5mg对应于9.375ml (9.7ml),和ToxB: 1.5mg对应于4.411ml (4.5ml))开始。将样品在11每种PBS中在4°C透析40h。将Tox A在20%的PEG20.000于PBS中的溶液中透析4h。体积减小至3.7ml。
[0389]ToxA和ToxB的甲酰化
[0390]ToxA 和 B 的分子量:是大约 300kDa。制品包括 0.25mg/ml ToxA 和 0.35mg/mlToxB0溶解素储备物包含IM的赖氨酸.HCl在PBS中的溶液。在下面的表1 (a和b)中包括了总结:
[0391]表1(a).类毒素A制剂的总结
[0392]
【权利要求】
1.一种免疫原性组合物,其包含艰难梭菌抗原的组合,所述组合包含 a)ToxB-GT抗原和TcdA抗原;或者 b)ToxA-GT抗原和TcdB抗原。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物,其中所述ToxB-GT抗原和/或所述ToxA-GT抗原是脱毒的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物,其中, 所述ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:60具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQID NO: 18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:60具有80%或更多同一性且包含SEQ ID NO: 18或SEQ IDNO:60的表位; 所述ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:56具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQID N0:4或SEQ ID NO:56的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:56具有80%或更多同一性且包含SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:56的表位; 所述TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:1具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID NO:1具有80%或更多同一性且包含SEQ ID NO:1的表位;和 所述TcdB抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO: 2具有80%或更多同一性;和/或b)是SEQ ID NO: 2的至少7个连续氨基酸的片段,或者属于这样的多肽:所述多肽与SEQ ID N0:2具有80%或更多同一性且包含SEQ ID NO:2的表位。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原和I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种TcdA抗原,所述TcdA抗原任选地选自=(I)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO: 3),(2)ToxA-GT 抗原(SEQ ID NO:4)、(3) ToxA-CP 抗原(SEQ ID NO: 5)、(4) ToxA-T 抗原(SEQID N0:6)、(5)ToxA-T4 抗原(SEQ ID NO: 7)、(6) ToxA-B 抗原(SEQ ID NO: 8)、(7) ToxA_PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7 抗原(SEQ ID NO: 10)、(9)ToxA-P5_6 抗原(SEQ IDNO: 11)、(10)ToxA-P9-10 抗原(SEQ ID NO: 12)、(11)ToxA_B2 抗原(SEQ ID NO: 13)、(12)ToxA-B3 抗原(SEQ ID NO: 14)、(13) ToxA_B5 抗原(SEQ ID NO: 15)、(14) ToxA_B6 抗原(SEQID NO: 16)或全长 TcdA 抗原(SEQ ID NO:1)。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物进一步包含I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种另外的TcdB抗原,所述另外的TcdB抗原任选地选自:(I) ToxB-ED 抗原(SEQ ID NO: 17)、(2) ToxB-GT 抗原(SEQ ID NO: 18)、(3) ToxB-CP 抗原(SEQ ID NO: 19) (4)ToxB_T 抗原(SEQ ID NO:20)、(5)ToxB-B 抗原(SEQ ID NO:21), (6)ToxB-B2 抗原(SEQ ID NO: 22) (7) ToxB_B7 (SEQ ID NO: 23)或(8)全长 TcdB 抗原(SEQ IDNO:2)。
6.根据权利要求1-3中的任一项所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含ToxA-GT抗原和I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或更多种TcdB抗原,所述TcdB抗原任选地选自:(l)ToxB-ED 抗原(SEQ ID NO: 17)、(2) ToxB-GT 抗原(SEQ ID NO:18),(3)ToxB-CP 抗原(SEQ ID NO: 19) (4) ToxB-T 抗原(SEQ ID NO: 20)、(5) ToxB-B 抗原(SEQ IDN0:21)、(6)ToxB-B2 抗原(SEQ ID NO:22) (7) ToxB_B7 (SEQ ID NO:23)或(8)全长 TcdB 抗原(SEQ ID NO:2)ο
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物进一步包含I种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种另外的TcdA抗原,所述另外的TcdA抗原任选地选自:(I)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP 抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T 抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ΤοχΑ-Τ4 抗原(SEQ ID NO: 7)、(6) ToxA-B 抗原(SEQ ID NO: 8)、(7) ΤοχΑ_ΡΤΑ2 抗原(SEQID NO:9)、(8)ΤοχΑ-Ρ5-7 抗原(SEQ ID NO: 10)、(9)ΤοχΑ-Ρ5_6 抗原(SEQ ID NO: 11)、(10)ΤοχΑ-Ρ9-10 抗原(SEQ ID NO: 12)、(11)ΤοχΑ_Β2 抗原(SEQ ID NO: 13)、(12)ΤοχΑ_Β3 抗原(SEQ ID NO: 14 )、(13)ΤοχΑ_Β5 抗原(SEQ ID NO: 15)、(14)ΤοχΑ_Β6 抗原(SEQ ID NO: 16)或全长 TcdA 抗原(SEQ ID NO:1)。
8.根据任意前述权利要求所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原和TcdA抗原,其中所述TcdA抗原选自ΤοχΑ-Ρ5-6和ΤοχΑ_Β2。
9.一种免疫原性组合物,其包含:i) ToxA-GT抗原或ToxB-GT抗原;和ii)至少一种选白 ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5_7、ToxA-P5_6、ToxA-P9_10、ToxA_B2、ToxA_B3、ToxA_B5 和/或ToxA-B6的TcdA抗原;和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA_B7的TcdB抗原。
10.一种免疫原性组合物,其包含:i)ToxA-GT抗原和ToxB-GT抗原jPii)至少一种选自 ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5_7、ToxA-P5_6、ToxA-P9_10、ToxA_B2、ToxA_B3、ToxA_B5 和/或ToxA-B6的TcdA抗原;和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA_B7的TcdB抗原。
11.根据任意前述权利要求所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原、TcdA抗原和另一种TcdB抗原,任选地其中所述组合物包含:(a)ToxB-GT+ToxA-B2+ToxB-B,或(b)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5_6。
12.根据任意前述权利要求所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原、ToxA-GT抗原、另一种TcdA抗原和另一种TcdB抗原,任选地其中所述组合包含 ToxB-GT+ToxA-GT+ToxA-B2+ToxB-B。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物,其中所述组合物中的至少2种所述抗原是呈杂合多肽的形式。
14.根据权利要求1-12中的任一项所述的免疫原性组合物,其中所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物,其中所述组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的中和滴度。
16.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少一种其它艰难梭菌抗原,任选地其中所述其它艰难梭菌抗原是糖抗原。
17.作为疫苗组合物的根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物。
18.根据权利要求17所述的疫苗组合物,所述疫苗组合物进一步包含佐剂。
19.用作药物的根据权利要求17或权利要求18所述的疫苗组合物。
20.用于在哺乳动物中引起免疫应答的根据权利要求17-19中的任一项所述的疫苗组合物。
21.根据权利要求20所述的疫苗组合物,其中所述哺乳动物是人。
22.用于治疗或预防艰难梭菌相关的疾病的根据权利要求18-21中的任一项所述的疫苗组合物。
23.一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法,所述方法包括下述步骤:给所述哺乳动物施用有效量的根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物或疫苗。
【文档编号】A61K39/08GK103974718SQ201280060487
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2011年12月8日
【发明者】M·斯卡塞利, M·皮萨, R·里犹兹, M·阿科, M·马丁内利, G·多斯 申请人:诺华股份有限公司
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