专利名称：一种rna及载体在制备预防和/或治疗肝癌产品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA及载体在制备预防和/或治疗肝癌产品中的应用。
背景技术：
目前全世 界现在有3.5亿人感染HBV (乙型肝炎病毒)，在中国约有9300万人慢性感染HBV，大约15-40%的感染人群可能发展为威胁生命的疾病例如肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌等，慢性HBV感染严重危害人们身体健康。现有用于慢性乙肝患者的治疗方法包括a-干扰素(IFN-a )和核苷或核苷类似物(如拉咪呋啶、阿德福韦和恩替卡韦)，干扰素- a是第一个获得临床治疗乙肝病毒感染的药物，作为重要的一线药物，聚乙二醇干扰素-a单一治疗能有效治疗25-40%的慢性乙型肝炎患者，在与核苷酸类似物联合使用能产生更大的持续抗病毒学疗效和在HBeAg阳性患者中病毒e抗原转阴，但干扰素治疗副作用明显，停药后容易反弹，部分患者对干扰素_a反应不敏感，疗效差。核苷类似物疗程长，停药后病毒易反弹，而且引起突变、增加耐药性。在中国肝细胞癌多数由慢性乙肝感染引发，而且目前临床没有有效的药物治疗。因此，迫切需要开发新的乙肝和肝癌治疗性药物以补充或替代现有的抗病毒治疗方案和肝癌治疗。MicroRNA (miRNA)是一类大约22个核苷酸的非编码小RNA，其功能主要是负调控靶基因表达，通常与目标基因的mRNA3’端非编码区互补配对诱导目标基因的翻译抑制，mRNA脱腺苷化和降解。MicroRNA-122 (miR-122)在哺乳动物肝脏中特异性高表达，占肝脏总microRNA含量的70%。
发明内容
本发明的一个目的是提供重组腺病毒载体。本发明提供的重组腺病毒载体，为将miR-122的至少一个编码基因插入pDC312-cmv腺病毒载体中得到的重组腺病毒载体；所述miR-122为序列表中的序列I所示的RNA或序列表中的序列3编码的RNA。序列表中的序列3编码的RNA为序列I所示的RNA的前体。上述重组腺病毒载体具体为如下I)或2):1)所述重组腺病毒载体为将所述miR-122的I个编码基因插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体；2)所述重组腺病毒载体为将所述miR-122的8个编码基因插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体。上述重组腺病毒载体中，所述miR-122的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述miR-122的8个编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。1)所述重组腺病毒载体为将序列表中的序列3所示DNA分子插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体；具体为将序列3所示的DNA分子插入腺病毒表达载体pDC312-cmv的BamHI和Xhol酶切位点之间，得到重组质粒pDC312_miR-122。2)所述重组腺病毒载体为将序列表中的序列4所示DNA分子插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体。具体为将序列表中序列4所示的DNA分子插入腺病毒表达载体pDC312-cmv的BamHI和Xhol酶切位点之间，得到重组质粒pDC312_8miR-122。本发明的另一个目的是提供一种重组腺病毒。本发明提供的重组腺病毒，为将上述的重组腺病毒载体转入宿主细胞，包装得到的重组腺病毒；所述宿主细胞具体为人胚肾细胞；人胚肾细胞进一步具体为人胚肾细胞HEK293。miR-122在制备具有如下I)和/或2)功能的产品中的应用也是本发明保护的范围:I)预防和/或治疗肿瘤；2)减小肿瘤数量和/或肿瘤重量；所述miR-122为序列表中的序列I所示的RNA或序列表中的序列3编码的RNA。上述的重组腺病毒载体在制备具有如下1)-7)中至少一种功能的产品中的应用也是发明保护的范围:I)预防和/或治疗肿瘤；
2)减小肿瘤数量和/或肿瘤重量；3 )抑制乙肝病毒HBsAg抗原和/或HBeAg抗原表达；4)抑制乙肝病毒DNA拷贝；5)抑制肝细胞的HBcAg抗原表达；6)抑制乙肝病毒转录；具体为抑制HBV pgRNA和/或total RNA表达。7)抑制肿瘤细胞增殖。上述的腺病毒在制备具有如下1)-5)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围:I)预防和/或治疗肿瘤；2)减小肿瘤数量和/或肿瘤重量；3 )抑制乙肝病毒HBsAg抗原表达；4)抑制乙肝病毒DNA拷贝；5)抑制肝细胞的HBcAg抗原表达。上述应用中，所述肿瘤为肝癌；所述肿瘤细胞为肝癌细胞，所述肝癌细胞进一步具体为HepG2细胞。上述应用中，所述产品为药物。本发明的实验证明，本发明将表达8个miR-122编码基因导入腺病毒载体中，并且纯化出腺病毒，用其进行动物实验，发现合成的miR-122及重组腺病毒载体或腺病毒可明显抑制乙肝慢性感染引发的肝癌，可开发成为新型肝癌治疗药物。另外，采用pDC312-cmv作为重组腺病毒载体的载体骨架，具有宿主范围广，对人致病性低，在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因，不整合到染色体中，无插入致突变性等优点。
图1为重组腺病毒载体pDC312-8miR_122构建流程2为体内尾静脉注射miR-122治疗HBV转基因小鼠结果图3为体内尾静脉注射表达miR-122腺病毒治疗HBV转基因小鼠结果图4为HBV转基因小鼠体内尾静脉注射合成的miR-122检测肝癌发生结果图5为HBV转基因小鼠体内尾静脉注射表达miR-122腺病毒检测肝癌发生结果图6为miR-122抑制HBV复制能力图7为pSuper-miR-122表达载体抑制HBV复制能力图8为pDC312-miR-122、pDC312_8miR-122腺病毒表达载体抑制HBV复制能力图9为miR-122抑制肝癌细胞IfepG2增殖图10为pSuper-miR-122表达载体抑制肝癌细胞H印G2增殖图11为pDC312-miR-122、pDC312-8miR-122腺病毒表达载体抑制肝癌细胞H印G2
增殖图12为miR-122抑制剂促进HBV复制能力图13为miR-122抑制剂促进细胞增殖
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。HBV表面抗原(HBsAg)检测试剂盒和HBV e抗原检测试剂盒均购自上海科华生物工程股份有限公司，HBV表面抗原批准文号:国药准字S10910113，HBV e抗原批准文号:国药准字 S10910112 ;TriPure Isolation Reagent 购自 Roche，产品目录号 11667165001 ;反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，产品目录号BK3802 ;全血/组织基因组提取试剂盒购自天跟(北京)生化科技有限公司，产品目录号DP304 Southern blot试剂盒购自GE，产品目录号为 RPN3680，RPN3681，RPN3690，RPN3691, RPN3692 ;乙肝病毒 DNA 拷贝数和 pgRNA、totalRNA定量检测引物均在invitrogen公司合成。转染试剂lipo2000购自invitrogen,产品目录号 11668019 ;人肝癌细胞 H印G2 (ATCC number:HB-8065)、Huh_7 (ATCC number:PTA-4583)和人胚肾 HEK293 (ATCC number:CRL_1573)购自 ATCC ;HBV 转基因鼠:购自广州解放军第458医院。实施例1、miR-122、含有miR-122编码基因的重组腺病毒载体及表达miR-122的腺病毒的构建一、miR-122 的获得人工合成miR-122，在广州锐博生物科技有限公司合成。miR-122的核苷酸序列为序列表中序列I。miR-122的阴性对照RNA购自广州锐博生物科技有限公司(为miRNA mimicNcontrol#22产品信息:基本信息:人、小鼠、 大鼠通用的miRNA mimic Ncontrol#22成熟miRNA 名称:cel-miR-239b_5p
成熟miRNA 编号:MIMAT0000295成熟miRNA 序列:UUUGUACUACACAAAAGUACUG)二、含有miR-122的腺病毒重组载体的构建miR-122前体编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3，该基因编码miR-122前体，经过剪切后得到miR-122 (序列I)。重组腺病毒载体pDC312-miR_122构建:将序列3所示的DNA分子插入腺病毒表达载体pDC312-cmv的BamHI和Xhol酶切位点之间，得到重组质粒pDC312_miR-122。上述腺病毒表达载体pDC312-cmv通过如下方法构建:将从pCDNA3.1 ( + )(invitrogen,产品目录号V790-20)克隆得到的含有启动子CMV和多克隆位点的DNA分子(序列5)插入腺病毒表达载体PDC312 (本元正阳，产品目录号ro-01-26)的XbaI和BamHI酶切位点间得到腺病毒表达载体pDC312-cmv。为了避免酶切位点与多克隆位点重复，反复切割，引物设计采用同尾酶的技术，AvrII (XmaJI)和Xbal I ,Bgl II和BamH I为同尾酶，该载体以CMV为启动子，表达能力强。引物设计:CMV-F aat cctagg ATGTACGGGCCAGATATACGCCMV-R aat agatct TTTCCGCCTCAGAAGCCATA重组腺病毒载体pDC312-8miR_122构建:为将序列表中序列4所示的DNA分子插入腺病毒表达载体pDC312-cmv的BamHI和Xhol酶切位点之间，得到重组质粒pDC312-8miR-122: 上述重组腺病毒载体的构建方法也可以(图1)如下所示:以pSuper-miR-122(载体构建方法见实施例3的二的I)为模板，用Pre-miR-122-F和Pre-miR-122-R作为引物进行PCR扩增，得到250bp左右PCR产物经过BamHI和Xhol酶切插入经过同样酶切的pDC312-cmv中得到表达一个miR-122前体的腺病毒表达载体pDC312_miR-122 ;然后pDC312-miR-122经过BamHI和XhoI酶切回收得到250bp左右的preiiR-122片段，再用Bgl II和Xho I酶切pDC312-miR-122回收得到载体骨架，将回收的片段和载体连接转化得到表达2个miR-122前体的腺病毒载体；反复重复,插入8个miR-122前体，得到重组质粒pDC312-8miR-122。设计引物序列如下:Pre-miR-122-F:CGGGATCCTTTCTCTGCTTAGGTCACAATATGTPre-miR-122-R:CCGCTCGAGAGATCT ATCAGATGAACCTTCTTGCTCAA上述pDC312-miR-122和pDC312_8miR-122均为含有miR-122编码基因的重组腺
病毒载体。三、表达miR-122的腺病毒的获得1、质粒大提制备将重组腺病毒载体pDC312-miR-122、pDC312_8miR-122和腺病毒框架质粒pBHGlox A El, 3Cre (本元正阳，产品目录号PD-01-64)分别导入大肠杆菌感受态DH5 a，得到单克隆。按照威格拉斯大提质粒试剂盒说明书操作。以单菌落接种至含适当抗生素的5mL LB培养基中，37°C振荡培养过夜，取5mL过夜培养物加到含抗生素的300mLLB培养基中，37°C振荡培养过夜，于4°C 6，OOOrpm离心15min收集细菌。加入5mL溶液I将菌体充分混匀，并移至50mL离心管中。加入溶液II5mL，轻柔混匀变性5min，溶液透明，再加入5mL的溶液III，立即颠倒混匀至白色絮状物产生，冰上放置15min。将上述裂解液于4°C，12，OOOrpm离心30min,将上清转移至另一管中，再在4°C下12，OOOrpm离心15min,转移上清至新的离心管中，加入IOmL异丙醇，颠倒离心管充分混匀，并于冰上放置15min，然后在4°C 12, OOOrpm离心15min,小心弃去上清,倒置轻轻浙干剩余液体,加入0.5mL溶液I,完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5mL Ep管中，室温放置20min以充分溶解。用台式离心机室温12，OOOrpm离心2min，将上清移入新的Ep管中，用IOOyLBufferIV (杂质清除液A)处理两次,每次轻轻混勻后于12，OOOrpm离心5min,取上清换至新Ep中，然后再用70 ii L Buffer V (杂质清除液B)，轻轻混匀，12，OOOrpm离心lOmin，取上清换至新Ep中，加入0.5mL异丙醇，混勻，室温放置IOmin,在12，OOOrpm离心IOmin,弃上清，用70%乙醇ImL轻轻洗涤2次，弃去上清，倒置晾干后用适量TE溶解沉淀(可在37°C水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)，得到重组腺病毒载体pDC312-miR-122、重组腺病毒载体pDC312-8miR-122和腺病毒框架质粒pBHGlox A El, 3Cre。测定0D260与0D280，计算DNA浓度与纯度。2、表达miR-122腺病毒包装转染前一天将人胚肾细胞HEK293接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到70%左右，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。miR-122腺病毒A的制备:(I)包装:采用上述方法将重组 腺病毒载体pDC312-miR_122和腺病毒框架质粒pBHGlox A El, 3Cre采用lipo2000共转染HEK293细胞，质粒转染比例最佳为质量比1:1，4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。每天观察细胞的病变状况，若细胞密度太大，在转染3-4天将细胞吹打下来转移至IOcm培养皿中，注意不要用胰酶消化，防止出现野生型病毒。在转染10天左右，细胞大部分出现病变，细胞变圆脱落，将细胞吹打下来转移至15ml离心管中，室温2000rpm离心IOmin收集细胞，将上清倒掉，Iml PBS重悬细胞转移至1.5ml离心管中_20°C保存。(2)腺病毒释放:将细胞反复冻融三次，使细胞完全裂解，病毒释放，4°C 12000rpm离心lOmin，收集上清病毒液，分装至1.5ml离心管中_80°C保存，得到miR-122腺病毒A。采用同样的方法将重组腺病毒载体pDC312-8miR_122和腺病毒框架质粒pBHGlox A El, 3Cre采用lipo2000共转染HEK293细胞，包装、释放，获得miR-122腺病毒B0采用同样的方法将腺病毒载体pDC312-cmv和腺病毒框架质粒pBHGlox AE1，3Cre采用lipo2000共转染HEK293细胞，包装、释放，获得对照腺病毒。3、病毒鉴定及功能检测感染前一天将H印G2接种到6孔板，感染时细胞汇合度达到70%左右，提前一个小
时将培养基换成全培养基。将上述获得的IOul miR-122腺病毒A、miR-122腺病毒B和对照腺病毒分别加A H印G2感染48h，分别收集细胞，Trizol裂解提取RNA，RT-PCR Taqman探针检测成熟的miR-122高表达。Taqman检测miR-122方法:在6孔板一个孔中加入Iml的trizol试剂,裂解5min,吸入到1.5ml的进口 EP管中，加入200ul无RNA酶污染的氯仿，混匀15s，4°C 13000rpm离心15min，吸取上清转移到一个新的1.5ml进口 EP管中，加入500ul异丙醇-20°C沉淀过夜，40C 13000rpm离心lOmin，倒掉上清，用DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀一次，晾干，50ulDEPC水溶解，按照说明书，用Taqman反转录试剂盒转录成cDNA，RT-PCR定量检测，检测引物在invitrogen公司合成。Taqman反转录试剂盒:购自invitrogen,产品货号:4366596miR-122 探针:购自 invitrogen，产品目录号:Cat.#4427975，货号:002245U6 内参探针:购自 invitrogen，产品目录号:Cat.#4427975，货号:01093检测结果为腺病·毒A转染组比对照腺病毒转染组细胞中miR-122水平高表达至少10倍，腺病毒B转染组比对照腺病毒转染组细胞中miR-122水平高表达至少14倍。说明miR-122高表达腺病毒效果显著。4、腺病毒的大量扩增及纯化感染前一天将HEK293接种到150mm培养皿中，感染时细胞汇合度达到80%_90%，提前一个小时将培养基换成10ml5%FBS的DMEM培养基，将miR-122腺病毒A病毒液加入培养基中，轻轻混匀，放置37°C，5%C02的培养箱中，1.5小时后补加10ml5%FBS的DMEM培养基继续培养。第二天观察细胞状态，待细胞80%-90%出现病变时收集细胞，反复冻融三次充分裂解细胞，收集上清病毒液_80°C储存待纯化。以下为腺病毒氯化铯密度梯度离心纯化病毒步骤:a)预冷离心转子至4°C。b)在离心管中缓慢加入 8mll.4g/ml 氯化铯(53g+87mll0mM Tris_HCl,pH7.9),再非常轻缓地加入6mll.2g/ml氯化铯(26.8+92mll0mM Tris-HCL, pH7.9)。病毒最终的纯度
有赖于密度梯度的质量。c)超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于IO9细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用pH7.9IOmMTris-HCl 调至 20ml。d)平衡离心管，100, OOOXg (SW28转子上为23000rpw) 4°C离心90分钟。e)超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。f)用IOml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。g)在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。h)用带18G针头的5ml注射器从离心管外壁稍低于病毒带(最下的一条带)的位置进行穿刺。1.注意:感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。i)小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。j)取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌15ml离心管。k)加入I倍体积I XTE，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约为1.345 ;得到纯化miR-122腺病毒A。采用同样的方法扩增纯化miR-122腺病毒B和纯化对照腺病毒。5、腺病毒的滴度检测:
采用本元正阳购买的腺病毒滴度检测试剂盒(目录号:K-AD0001)按照说明书进行纯化miR-122腺病毒A、纯化miR-122腺病毒B和纯化对照腺病毒的滴度检测。结果如下:纯化miR-122腺病毒A、纯化miR-122腺病毒B和纯化对照腺病毒的滴度分别为 IX 109IU/ml、5X 109IU/ml、2X 109IU/ml。实施例2、miR-122、含有miR-122编码基因的重组腺病毒载体及表达miR-122的
腺病毒的应用1、miR-122及表达miR-122的腺病毒在治疗HBV转基因小鼠中的应用A、miR-122在治疗HBV转基因小鼠中的应用将6-8周龄的HBV转基因BALB/c小鼠(购自中国人民解放军第四五八医院全军肝病中心)；体重相近，均约为16g的小鼠随机分成2组，每组5只。miR-122 溶液:每 IOnM miR-122 溶于 0.1ml 的 PBS (8g/L NaCl.0.2g/L KCl,3.628g/LNa2HP04 12H20、0.24g/L KH2PO4 和水，pH 值 7.4)中，得到 miR-122 溶液；miR-122的阴性对照RNA溶液:每IOnM的miR-122阴性对照RNA溶于0.1ml的PBS(8g/LNaCl、0.2g/L KC1、3.628g/L Na2HPO4 12H20、0.24g/L KH2PO4 和水，pH 值 7.4)中，得到miR-122的阴性对照RNA溶液。第一组(miR-122组):每只小鼠尾静脉注射溶于0.1ml miR-122溶液；每隔三天注
射一次，持续两周。第二组(阴性对照组):每只小鼠尾静脉注射溶于0.1ml miR-122的阴性对照RNA
溶液；每隔三天注射一次，持续两周。自尾静脉注射结束后第1、3、5、8、12天各检测一次小鼠血清中HBsAg抗原表达水平，在HBsAg降低最明显的第12天检测血清中HBV DNA拷贝数和小鼠肝中的C抗原水平，具体如下:1)、检测体内血清中的HBsAg抗原(HBV S抗原水平)miR-122组和阴性对照组小鼠血清中HBVs抗原采用HBV表面抗原(HBV S抗原水平)检测；操作步骤按照生产商说明书进行。结果见图2A所示，miR-122组注射结束后第1、3、5、8、12天的血清中的HBV S抗原水平分别为
5.2X105、3.1XlO5,2.5X105、2.2X105、2.4X105 ；阴性对照组注射结束后第1、3、5、8、12天的血清中的HBV S抗原水平分别为
5.1X 105、5.0X 105、5.7X 105、5.5X 105、5.3X IO5 ；可以看出，与对照组相比，miR-122组的HBV S抗原在尾静脉注射结束第三天明显下降。第12天，miR-122组平均HBV s抗原值为2.4X IO5比对照组5.3X IO5有显著下调(P〈0.05)。表达miR-122组与对照相比对于HBV s抗原的降低具有显著差异。2 )、检测体内血清中的HBV DNA拷贝数使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(购自中山大学达安基因股份有限公司，产品号Cat.#DA-B051)对miR-122组和阴性对照组小鼠IOOul血清进行DNA拷贝数的绝对定量；按照生产商产品说明书进行操作。HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法:将已知浓度的HBV DNA(4.1kbp)质粒(该质粒记载在 Proc Natl Acad Sci U S A.2001Febl3; 98 (4): 1841-6.Epub2001Feb6.Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors isa critical determinant of viral tropism ;下面又称为质粒 pHBVl.3 ;公众可从中国科学院微生物研究所获得.)依次进行1000倍稀释，I X IOtl-1X 109。标准曲线和定量检测进行三次重复实验，结果取平均值。DNA拷贝数定量检测引物:forward:5’ -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’ ；reverse:5’ -TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3’第12天两组血清中HBV DNA拷贝数结果如图2C左图所示，miR-122组血清中HBV DNA拷贝数为1.5 X IO5 ;阴性对照组血清中HBV DNA拷贝数为 4.5X105；上述结果可以看出，与对照组平均值4.5X105相比，miR-122组平均值为1.5 X 105，HBVDNA 拷贝数明显降低(p〈0.01)。3 )、检测体内肝细胞的C抗原HBcAg尾静脉注射结束后第12天，将miR-122组和阴性对照组小鼠肝脏进行免疫组化(抗体为抗HBcAg抗体(基因科技(上海)有限公司，货号:GB058610)。结果见图2B所示，显示MiR-122组能够显著下调肝细胞的C抗原HBcAg水平，着色细胞明显减少。4 )、检测体内肝细胞的DNA拷贝数采用全血/组织基因组提取试剂盒(购自天跟(北京)生化科技有限公司，产品目录号DP304)提取尾静脉注射结 束后第12天miR-122组和阴性对照组小鼠肝脏组织中的DNA，提取方法详见产品说明书。将上述提取各组的DNA用50ul H2O溶解，RT-PCR定量检测，检测引物为:forward:5’ -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’reverse:5’ -TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3’HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法同A的2)。结果如图2C右图所示，miR-122组肝脏中HBV DNA拷贝数为1.3X IO5 ;阴性对照组肝脏中JBV DNA拷贝数为7.5 X IO5 ;可以看出，与对照组平均值7.5X IO5相比，miR-122组平均值1.3X105，肝脏中HBVDNA拷贝数明显降低。miR-122组能够显著降低肝细胞中的DNA拷贝数(p〈0.01)。B、表达miR-122的腺病毒在治疗HBV转基因小鼠中的应用将6-8周龄的HBV转基因BALB/c (体重相近)小鼠分成三组，每组5只，分别进行尾静脉注射:第一组(PDC312-cmv空腺病毒组):每只小鼠尾静脉注射2X IO8IU/只的纯化对照腺病毒(腺病毒);第二组(pDC312-miR-122腺病毒组):每只小鼠尾静脉注射2X IO8IU/只纯化miR-122 腺病毒 A (表达 pDC312-miR-122 腺病毒)；第三组(pDC312-8miR-122腺病毒组):每只小鼠尾静脉注射2X IO8IU/只纯化miR-122 腺病毒 B (表达 pDC312_8miR-122 腺病毒)；上述三组均为每隔15天注射一次，持续60天。
自尾静脉注射腺病毒结束后第0、15、30、45、60天检测小鼠血清中HBsAg抗原，第60天HBs抗原降低最明显时检测HBV DNA和小鼠肝中的C抗原水平以及肝脏中DNA拷贝数，具体如下:I)、检测体内血清中的HBsAg抗原(HBV S抗原水平)pDC312-cmv 空腺病毒组、pDC312-miR-122 腺病毒组和 pDC312_8miR-122 腺病毒组小鼠血清中HBV S抗原采用HBV表面抗原检测试剂盒；操作步骤按照生产商说明书进行。结果如图3A所示，pDC312-cmv空腺病毒组注射结束后第0、15、30、45、60天的血清中的HBV S抗原水平分别为 4.3X105、2.5X105、3.2X105、3.05X 105、4.8X IO5 ；pDC312-miR-122腺病毒组注射结束后第0、15、30、45、60天的血清中的HBV S抗原水平分别为 4.3 XlO5U.2X105、1.9X105、0.8X105、1.2 X IO5 ；pDC312-8miR-122腺病毒组注射结束后第0、15、30、45、60天的血清中的HBV S抗原水平分别为 4.3X105、0.3X105、0.1 X IO5,0.07X 105、0.05 X IO5 ；可以看出，与第I组空病毒组相比，其它表达miR-122腺病毒的2组的HBsAg抗原在第三天开始下降。表达miR-122腺病毒组比对照组有显著下调，表达8个miR-122的腺病毒组对于HBsAg抗原的降低更加显著。2 )、检测体内血清中的HBV DNA拷贝数使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(购自中山大学达安基因股份有限公司，产品号Cat.#DA-B051)对pDC312_cmv空腺病毒组、pDC312_miR-122腺病毒组和pDC312-8miR-122腺 病毒组小鼠IOOul血清进行DNA拷贝数的绝对定量；按照生产商产品说明书进行操作。HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法同A的2)。结果如图3C左图所示，与pDC312_cmv空腺病毒组平均值为5.2X IO5相比，其它2组腺病毒表达组的HBV DNA拷贝数明显降低，I个miR-122腺病毒组(pDC312_miR-122腺病毒组)平均值为2X 105，8个miR-122腺病毒组(pDC312_8miR-122腺病毒组)平均值为0.8 X 105，第三组较前两组对HBV DNA水平的影响具有明显差异(p〈0.01)。3 )、检测体内肝细胞的C抗原HBcAg尾静脉注射腺病毒第60天，将pDC312-cmv空腺病毒组、pDC312_miR-122腺病毒组和pDC312-8miR-122腺病毒组小鼠肝脏进行免疫组化，抗体为抗HBcAg抗体(基因科技(上海)有限公司，货号:GB058610)。结果如图3B所示，表达miR-122腺病毒组能够显著降低肝细胞中的C抗原HBcAg。8个miR-122腺病毒组较前两组对HBc抗原水平抑制更加明显，着色肝脏细胞量明显降低。4 )、检测体内肝细胞的DNA拷贝数采用全血/组织基因组提取试剂盒购自天跟(北京)生化科技有限公司，产品目录号DP304，提取尾静脉注射结束后第60天pDC312-cmv空腺病毒组、pDC312_miR-122腺病毒组和pDC312-8miR-122腺病毒组小鼠肝脏组织中的DNA，提取方法详见产品说明书，50ulH2O溶解，RT-PCR定量检测，检测引物为:forward:5’ -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’ ；reverse: 5，-TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3，
HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法同A的2)。结果如图3C右图所示，与pDC312-cmv空腺病毒组平均值为8 X IO5相比，其它2组腺病毒表达组的HBV DNA拷贝数明显降低，pDC312-miR-122腺病毒组平均值为
3X IO5, pDC312-8miR-122腺病毒组平均值为I X 105，第三组较前两组对HBV DNA水平的影响具有明显差异(P〈0.01)。2、miR-122及表达miR-122的腺病毒在抑制HBV转基因鼠肝癌的发生中的应用A、miR-122在抑制HBV转基因鼠肝癌的发生中的应用将6-8周龄的HBV转基因BALB/c小鼠；体重相近，小鼠均约为16g，随机分成2组，每组5只。第一组(miR-122组):每只小鼠尾静脉注射0.1ml miR-122溶液；每隔一个月注射一次，持续18个月。第二组(阴性对照组):每只小鼠尾静脉注射0.1ml miR-122的阴性对照RNA溶液；每隔一个月注射一次，持续18个月。18个月后，将各组小鼠处死，检测肝癌的发生、肝脏肿瘤的数量和重量，具体方法如下:I), HE染色检测肝癌的发生所需试剂:
二甲苯，无水乙醇，95%酒精，90%酒精，85%酒精，苏木精，1%盐酸酒精，稀氨水(1%)，伊红，中性树胶试剂配方:盐酸酒精分化液的配制:浓盐酸0.5 Iml, 75%酒精99ml此液用一段时间后需要延长或更换液体，新液分化时间要短。操作步骤:二甲苯I脱腊IOmin.二甲苯II脱腊5min。无水乙醇洗去二甲苯IminX2次。95% 酒精 lmin。90% 酒精 lmin。85% 酒精 lmin。自来水洗2min。苏木精染色lmin至5min。自来水洗lmin。1%盐酸酒精分化20s。自来水洗lmin。稀氨水(1%)反蓝30s。自来水洗或蒸馏水洗lmin。伊红染色20s至5min。自来水洗30s。85%酒精脱水20s。90%酒精30s。95%1酒精lmin。95%II酒精lmin。无水乙醇I 2min。无水乙醇 II 2min。二甲苯 I 2min。二甲苯 II 2min。二甲苯 III 2min。中性树胶或加拿大树胶封片。可以看出，HE染色显示，miR-122组肝癌细胞数量大大减少。
2)、肝脏肿瘤数量和重量的检测将各组小鼠处死后，肝脏取出，将肝脏肿瘤分出计数，并且称量肝脏肿瘤的重量。结果如图4所示，可以看出，左图为肝脏肿瘤数量统计结果，其中，对照组肝脏肿瘤数量为50个，miR-122组8个，具有显著性差异(p〈0.01 )。右图为肝脏肿瘤总重量统计结果，其中，对照组肝脏肿瘤总重量共为490g，miR-122组肿瘤总重量为80g，具有显著性差异(p〈0.01)。B、表达miR-122的腺病毒在体内抑制HBV转基因鼠肝癌的发生将实施例1得到的表达miR-122腺病毒:纯化miR-122腺病毒B (表达pDC312-8miR-122腺病毒)和纯化miR-122腺病毒A (表达pDC312_miR-122腺病毒)及纯化对照腺病毒(表达pDC312-cmv空腺病毒)进行如下实验:将6-8周龄的HBV转基因BALB/c (体重相近)小鼠分成三组，每组10只，分别进行尾静脉注射一月一次，共注射18个月:第一组(PDC312-cmv空腺病毒组):每只小鼠尾静脉注射2 X IO8IU的纯化对照腺病毒，一月一次，共注射18个月；第二组(pDC312-miR-122腺病毒组):每只小鼠尾静脉注射2X IO8IU纯化miR-122腺病毒A,—月一次,共注射18个月；第三组(？00312-811^-122腺病毒组):每只小鼠尾静脉注射2\108叨纯化11^-122腺病毒B,—月一次,共注射18个月；18个月后，将各 组小鼠处死，检测肝癌的发生、肝脏肿瘤的数量和重量，具体方法同上述A，结果如图5所示，左图为肝脏肿瘤数量统计结果，其中，pDC312-cmv空腺病毒组肿瘤数量为65个，pDC312-miR-122腺病毒组肿瘤数量为15个，pDC312_8miR-122腺病毒组肿瘤数量为4个，较对照具有显著性差异(P〈0.01 )。右图为肝脏肿瘤总重量统计结果，其中，pDC312_cmv空腺病毒组肿瘤总重量为600g，pDC312-miR-122腺病毒组肿瘤总重量为310g，pDC312_8miR-122腺病毒组肿瘤总重量为90g，具有显著性差异(p〈0.01 )。可以看出，与对照腺病毒相比，pDC312-miR-122、pDC312_8miR-122腺病毒组肝癌
细胞数量和重量大大减少。实施例3、miR-122、含有miR-122编码基因的载体或含有miR-122编码基因腺病毒载体在体外抑制HBV复制能力中的应用一、miR-122在抑制HBV复制能力中的应用转染前一天将H印G2细胞接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到70%左右，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM (life technologies产品目录号:31985070)。miR-122组:将miR-122与质粒pHBVl.3采用lipo2000共转染H印G2细胞，得到HepG2细胞/miR-122 ；RNA与pHBVl.3复制性质粒的转染比例最佳为体积和质量比2.5ul:lug, 4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。阴性对照组:采用同样的方法将miR-122阴性对照RNA与pHBVl.3复制性质粒采用I ipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2细胞/miR-122阴性对照RNA。
在转染后24、48、72h检测各组中的IfepG2细胞/miR-122和IfepG2细胞/miR-122阴性对照RNA培养上清液中HBV表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌、上清液DNA拷贝数以及24h胞内pgRNA、totalRNA表达水平和胞内HBV复制中间体。I) HBV表面抗原HBsAg (HBVs抗原水平)和HBeAg (HBVe抗原水平)检测分别检测转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122和IfepG2细胞/miR-122阴性对照RNA的细胞培养上清液中HBV表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌，采用的检测试剂盒为HBV表面抗原和e抗原检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司，检测方法按照说明书进行；结果如图6A所示，转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122细胞培养上清液中HBV s抗原水平的0D450分别为0.045,0.1,0.16 ；转染后24、48、72h得到的H印G2细胞/miR-122阴性对照RNA培养上清液中HBVs抗原水平的0D450分别为0.08,0.21,0.34 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122培养上清液中HBV e抗原水平的0D450 分别为 0.04,0.09,0.12 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122阴性对照RNA培养上清液中HBV e抗原水平的0D450分别为0.075,0.19,0.28 ；可以看出，miR-122可以显著抑制HBV表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌。2 )上清液HBV DNA拷贝数检测分别检测转染后48h得到的H印G2细胞/miR-122和H印G2细胞/miR-122阴性对照RNA细胞培养上清液中HBV DNA拷贝数。上清DNA拷贝数检测方法:48h时各收集200ul上清培养基，室温12000rpm，2min离心去除细胞碎片，加入IOmM的Mgcl2, 100UI/ml的DNAase I , 37 °C消化3小时，加入1%SDS, 0.5mg/ml的蛋白酶K55°C消化2个小时，苯酚1:1抽提，乙醇沉淀过夜，高速离心，晾干，50ul H2O溶解，RT-PCR定量检测，把没有经过蛋白酶K消化的样品作为阴性对照，确定转染的质粒消化干净，不会干扰定量检测结果。检测引物在invitrogen公司合成。引物具体序列如下:forward:5’ -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’reverse:5’ -TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3’结果如图6B所示，IfepG2细胞/miR-122上清液HBV DNA拷贝数为4.5 X IO5 ;H印G2细胞/miR-122阴性对照RNA培养上清液HBV DNA拷贝数为1.22X 106。可以看出，miR-122可以显著抑制上清液HBV DNA拷贝数，从而反映其可以抑制上清中HBV病毒颗粒的分泌。3 )胞内HBV转录水平检测在6孔板一个孔中加入Iml的trizol试剂,裂解5min,吸入到1.5ml的进口 EP管中，加入200ul无RNA酶污染的氯仿，混匀15s，4°C 13000rpm离心15min，吸取上清转移到一个新的1.5ml进口 EP管中，加入500ul异丙醇_20°C沉淀过夜,4°C 13000rpm离心lOmin,倒掉上清，用DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀一次，晾干，50ul DEPC水溶解，按照说明书，反转录得到cDNA作为RT-PCR定量的模板。RT-PCR定量检测,检测引物在invitrogen公司合成:pgRNA (是HBV保守片段的引物)
forword:5， -TCTTGCCTTACTTTTGGAAG-3，；reverse:5， -AGTTCTTCTTCTAGGGGACC-3，；total RNA (是HBV保守片段的引物)forward:5’ -CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’ ；reverse:5， -TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3’GAPDH (内参)forword:5，-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3，；GAPDH reverse:5’ -CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’ ；结果如图6D所示，H印G2细胞/miR-122胞内HBV pgRNA相对表达量为0.35、HBVtotalRNA相对表达量为0.45 ；HepG2 细胞 /miR-122 阴性对照 RNA 内 HBV pgRNA 相对表达量为 1、HBV total RNA相对表达量为I ;可以看出，miR-122可以显著降低胞内HBV转录水平。4)胞内HBV复制中间体的检测Southern检测胞内HBV复制中间体:将6孔板中转染后48h HepG2细胞/miR-122和ItepG2/阴性对照RNAl收集到1.5ml离心管中，采用全血/组织基因组提取试剂盒(TianGen)提取细胞内的总DNA，并用紫外分光光度计0D260和0D280测定DNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳， 采用GE southern试剂盒检测HBV复制中间体,检测方法详见试剂盒说明书。结果如图6C所示，可以看出，转染miR-122能明显降低HBV复制中间体。HepG2细胞/miR-122的HBV复制中间体明显降低，rcDNA和ssDNA条带肉眼几乎不可见。HepG2细胞/miR-122阴性对照RNA的HBV复制中间体条带灰度较深，浓度高。。从上述结果可以看出，miR-122可以显著抑制HBV表面抗原、HBeAg和上清HBV病毒颗粒的分泌(上清中病毒的拷贝数就代表了病毒颗粒的数目)，胞内HBV转录水平下降，胞内HBV复制中间体显著下调。二、含有miR-122编码基因表达载体的构建及其在抑制HBV复制能力中的应用1、含有miR-122编码基因表达载体pSuper-miR-122质粒构建miR-122前体的编码基因，其核苷酸序列为序列表中的序列3，该基因编码miR-122的前体后，经过剪切加工得到成熟miR-122，成熟miR-122的核苷酸序列为序列表中的序列I。将序列3所示的DNA分子插入哺乳动物表达载体pSuper(Int J Cancer.20100ctl;127(7):1507-16.do1:10.1002/ijc.25159.RNA1-mediateddownregulation of uPAR synergizes with targeting of HER2through the ERK pathwayin breast cancer cells.;公众可从中国科学院微生物研究所获得)的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒pSuper-miR-122，为含有miR-122编码基因载体。2、pSuper-miR-122质粒在抑制HBV复制中的应用转染前一天将H印G2接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到90_95%，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。pSuper-miR-122 组:将质粒 pSuper-miR-122 与 pHBVl.3 复制性质粒采用lipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2细胞/pSuper-miR-122 ;两个质粒的转染比例最佳为质量比1:1，4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。阴性对照组:采用同样的方法将空载体pSuper与pHBVl.3复制性质粒采用lipo2000共转染HepG2细胞，得到HepG2细胞/pSuper。I) HBV表面抗原HBsAg (HBV s抗原水平)和HBeAg (HBV e抗原水平)检测检测转染后24、48、72h 得到的 IfepG2 细胞 /pSuperniR-122 和 IfepG2 细胞 /pSuper培养上清液中HBV表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌，检测方法同一的I)。结果如图7A和7B所示，转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/pSuperniR-122培养上清液中HBV s抗原水平的0D450分别为0.3,0.62,0.8 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/pSuper培养上清液中HBVs抗原水平的0D450 分别为 0.4,0.8、1.15 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/pSuperniR-122培养上清液中HBV e抗原水平的 0D450 分别为 0.12,0.26,0.45 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/pSuper培养上清液中HBV e抗原水平的0D450 分别为 0.2,0.4,0.62。2 )上清液HBV DNA拷贝数检测分别检测转染后48h得到的HepG2细胞/pSuper-miR-122和HepG2细胞/pSuper培养上清液HBV DNA拷贝数，检测方法同一的2 )。结果如图7C所示，HepG2细胞/pSuperniR-122上清液HBV DNA拷贝数为3.25 X IO5 ；HepG2 细胞 /pSuper 培养上清液 HBV DNA 拷贝数为 5.24 X IO5。3 )胞内HBV转录水平检测检测转染后48h HepG2 细胞 /pSuper-miR-122 和 IfepG2 细胞 /pSuper 胞内 HBV 转录水平检测,检测方法同一的3 )。结果如图7D所示，HepG2细胞/pSuperniR-122胞内HBV pgRNA相对表达量为0.54、HBV total RNA 相对表达量为 0.62 ；HepG2细胞/pSuper内HBV pgRNA相对表达量为1、HBV total RNA相对表达量为
I;从上述结果可以看出,miR-122表达载体pSuperniR-122可以显著抑制HBV表面抗原和上清HBV病毒颗粒的分泌、胞内HBV转录水平下降。三、含有miR-122编码基因的腺病毒表达载体pDC312-miR-122、pDC312_8miR-122的构建及其在抑制HBV复制中的应用转染前一天将H印G2接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到90_95%，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。pDC312-miR-122 组:将质粒 pDC312_miR-12`2 与 pHBVl.3 复制性质粒采用lipo2000共转染HepG2细胞，得到HepG2细胞/pDC312niR-122 ；2个质粒转染比例最佳为质量比1:1，4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。pDC312-8miR-122 组:采用同样的方法将质粒 pDC312_8miR-122 与 pHBVl.3 复制性质粒采用lipo2000共转染IfepG2细胞，得到IfepG2细胞/pDC312_8miR-122。阴性对照组:采用同样的方法将空载体pDC312-cmv采用lipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2细胞/pDC312-cmv。
I) HBV表面抗原HBsAg (HBV s抗原水平)和HBeAg (HBV e抗原水平)检测检测转染后48h得到的IfepG2细胞/pDC312_miR-122、HepG2细胞/pDC312-8miR-122 和 IfepG2 细胞 /pDC312_cmv 培养上清液中 HBV 表面抗原 HBsAg 和 HBeAg的分泌,检测方法同一的I)。结果如图8A和8B所示，转染后48h得到的H印G2细胞/pDC312_miR-122培养上清液中HBV s抗原水平的0D450和HBV e抗原水平的0D450分别为0.5和0.32 ；转染后48h得到的H印G2细胞/pDC312-8miR-122培养上清液中HBV s抗原水平的0D450和HBV e抗原水平的0D450分别为0.25和0.15 ；转染后48h得到的IfepG2细胞/pDC312-cmv培养上清液中HBVs抗原水平的0D450和HBVe抗原水平的0D450分别为0.73和0.5 ;2 )上清液HBV DNA拷贝数检测分别检测转染后48h得到的H印G2细胞/pDC312_miR-122、HepG2细胞/pDC312-8miR-122和IfepG2细胞/pDC312_cmv培养上清液HBV DNA拷贝数，检测方法同一的
2的 2)。结果如图8C所示，HepG2细胞/pDC312niR-122上清液HBV DNA拷贝数为
3.5 X IO5 ;IfepG2 细胞/pDC312-8miR-122 培养上清液 HBV DNA 拷贝数为 2.0XlO5 ；HepG2 M胞/pDC312-cmv培养上清液HBV DNA拷贝数为5.2X 105。3 )胞内HBV转录水平检测
检测转染后48h HepG2 细胞 /pDC312_miR-122、HepG2 细胞 /pDC312_8miR-122 和HepG2细胞/pDC312-cmv胞内HBV转录水平检测，检测方法同一的2的3)。结果如图8D所示，HepG2细胞/pDC312_miR-122胞内HBV pgRNA相对表达量为0.62、HBV total RNA 相对表达量为 0.54 ；HepG2 细胞 /pDC312_8miR-122 内 HBV pgRNA 相对表达量为 0.31、HBV total RNA相对表达量为0.22 ；IfepG2 细胞/pDC312-cmv 内 HBV pgRNA 相对表达量为 1、HBV total RNA 相对表达量为I ;从上述结果可以看出，MiR-122腺病毒表达载体pDC312-miR-122、pDC312-8miR-122可以显著抑制HBV表面抗原和上清HBV病毒颗粒的分泌，胞内HBV转录水平下降。实施例4、miR-122、含有miR-122编码基因表达载体或含有miR-122编码基因的腺病毒载体在抑制肝癌细胞HepG2增殖中的应用一、miR-122在抑制肝癌细胞IfepG2增殖中的应用转染前一天将H印G2接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到60_70%，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。miR-122 组(miR-122+pHBVl.3):将 miR-122 与 pHBVl.3 复制性质粒采用 lipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2细胞/miR-122 ；RNA和质粒的转染比例最佳为质量比3ul:lug, 4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。阴性对照组(对照+pHBVl.3):采用同样的方法将与pHBVl.3复制性质粒采用lipo2000共转染HepG2细胞，得到H印G2/阴性对照RNAl。
转染第二天上午将细胞消化计数重铺96孔板,一个孔细胞为2000个,设置三个重复孔，在转染后24、48、72h，每孔换液100ull0%FBS，DMEM，再分别在不同的时间段加入IOul的 CCK8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)孵育 2h, 450nm 酶标仪检测吸光值,分别检测 24、48、72h
细胞增殖。结果如图9 所示，miR-122 组(miR-122+pHBVl.3)转染后 0、24、48、72h 后 0D450 的吸光值分别为 0.167,0.34,0.6,1.2 ；阴性对照组(对照+pHBVl.3)转染后0、24、48、72h后0D450的吸光值分别为0.18、0.42,0.8,1.57 ；可以看出，miR-122和pHBVl.3共转染肝癌细胞H印G2后CCK8检测可以抑制细胞增殖。二、含有miR-122编码基·因的pSuperniR-122表达载体在抑制IfepG2细胞增殖中的应用·转染前一天将H印G2接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到90-95%，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。pSuper-miR-122 组(pSuper_miR122+pHBVl.3):将 pSuper-miR-122 与 pHBVl.3 复制性质粒采用lipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2/pSuper-miR-122 ;质粒的转染比例最佳为质量比1:1，4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。阴性对照组(pSuper+pHBVl.3):采用同样的方法将pSuper与pHBVl.3复制性质粒采用lipo2000共转染HepG2细胞，得到H印G2/pSuper。转染第二天上午将细胞消化计数重铺96孔板,一个孔细胞为2000个,设置三个重复孔，在转染后24、48、72h，每孔换液100ull0%FBS，DMEM，再分别在不同的时间段加入IOul的 CCK8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)孵育 2h, 450nm酶标仪检测吸光值,分别检测 24、48、72h
细胞增殖。结果如图10 所示，pSuper-miR-122 组(pSuperiiR-122+pHBVL 3)转染后 0、24、48、72h 后 0D450 的吸光值分别为 0.154,0.37,0.53,0.9 ；阴性对照组(pSuper+pHBVl.3)转染后0、24、48、72h后0D450的吸光值分别为
0.16,0.43,0.69,1.2 ；可以看出，pSuper-miR122和pHBVl.3共转染肝癌细胞H印G2后CCK8检测可以抑
制细胞增殖。三、含有miR-122编码基因的腺病毒表达载体pDC312-miR-122、pDC312_8miR-122在抑制HepG2细胞增殖中的应用转染前一天将H印G2接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到90_95%，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。pDC312-miR-122 组:将 pDC312_miR-122 与 pHBVl.3 复制性质粒采用 lipo2000 共转染H印G2细胞，得到H印G2/pDC312-miR-122 ;质粒的转染比例最佳为质量比1:1，4_6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。pDC312-8miR-122 组:采用同样的方法将 pDC312_8miR-122 与 pHBVl.3 复制性质粒采用 lipo2000 共转染 IfepG2 细胞，得到 H印G2/pDC312-8miR-122。pDC312-cmv组；采用同样的方法将pDC312-cmv与pHBVl.3复制性质粒采用Iipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2/pDC312_cmv。转染第二天上午将细胞消化计数重铺96孔板,一个孔细胞为2000个,设置三个重复孔，在转染后24、48、72h，每孔换液100ull0%FBS，DMEM，再分别在不同的时间段加入IOul的 CCK8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)孵育 2h, 450nm酶标仪检测吸光值,分别检测 24、48、72h
细胞增殖。结果如图11所示，pDC312-miR-122组转染后0、24、48、72h后0D450的吸光值分别为 0.22,0.57,0.79,1.31 ；pDC312-8miR-122 组转染后 0、24、48、72h 后 0D450 的吸光值分别为 0.25,0.5、
0.65,1.12 ；pDC312-cmv 组转染后 0、24、48、72h 后 0D450 的吸光值分别为 0.24,0.62,0.98、
1.56 ；可以看出，pDC312-miR-122、pDC312-8miR-122可以抑制细胞增殖。实施例5、miR-122抑制剂及相关应用一、miR-122抑制剂在促进HBV复制能力中的应用1、miR-122抑制剂和阴性对照RNA的合成miR-122抑制剂 及其阴性无关对照在广州锐博生物科技有限公司合成，miR-122抑制剂的核苷酸序列是一个长度为22个核苷酸，miR-122抑制剂的序列如序列表的序列2所示。miR-122抑制剂阴性对照RNA购自广州锐博生物科技有限公司(产品信息:基本信息:人、小鼠、大鼠通用的miRNA inhibitor Ncontrol#22成熟miRNA 名称:cel-miR-239b_5p成熟miRNA 编号:MIMAT0000295成熟miRNA 序列:UUUGUACUACACAAAAGUACUG)2、miR-122抑制剂在促进HBV复制能力中的应用miR-122抑制剂组:将miR-122抑制剂与pHBVl.3复制性质粒采用lipo2000共转染HepG2细胞，得到HepG2细胞/miR-122抑制剂。阴性对照组:采用同样的方法将miR-122抑制剂阴性对照RNA与pHBVl.3复制性质粒采用lipo2000共转染H印G2细胞，得到H印G2/miR-122抑制剂阴性对照RNA。I) HBV表面抗原HBsAg (HBV s抗原水平)和HBeAg (HBV e抗原水平)检测检测转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122抑制剂和IfepG2/miR-122抑制剂阴性对照RNA培养上清液中HBV表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌，检测方法同实施例3的一的I)。结果如图12A所示，转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122抑制剂培养上清液中HBV s抗原水平的0D450分别为0.12,0.46,0.92 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2/miR-122抑制剂阴性对照RNA培养上清液中HBVs抗原水平的0D450分别为0.07,0.12,0.35 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2细胞/miR-122抑制剂培养上清液中HBV e抗原水平的 0D450 分别为 0.12,0.45,0.88 ；转染后24、48、72h得到的IfepG2/miR-122抑制剂阴性对照RNA培养上清液中HBVe抗原水平的0D450分别为0.05,0.13,0.32 ；可以看出，miR-122抑制剂可以显著提高HBV表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌。2 )上清液HBV DNA拷贝数检测分别检测转染后48h得到的H印G2细胞/miR-122抑制剂和对照转染H印G2细胞2培养上清液HBV DNA拷贝数，检测方法同实施例3的一的2)。结果如图12B所示，HepG2细胞/miR-122抑制剂上清液HBV DNA拷贝数为
8.8 X IO5 ；HepG2/miR-122抑制剂阴性对照RNA培养上清液HBV DNA拷贝数为1.8X 105。可以看出，miR-122抑制剂可以显著提高上清液HBV DNA拷贝数，从而反映其可以提高上清中HBV病毒颗粒的分泌。 3 )胞内HBV转录水平检测检测转染后48h HepG2细胞/miR-122抑制剂和H印G2/阴性对照RNA2胞内HBV转录水平检测，检测方法同实施例3的一的3)。结果如图12D所示，HepG2细胞/miR-122抑制剂胞内HBV pgRNA相对表达量为1.75、HBVtotal RNA 相对表达量为 1.6 ；IfepG2/miR-122抑制剂阴性对照 RNA 内 HBV pgRNA相对表达量为 1、HBV total RNA相对表达量为I ;可以看出，miR-122抑制剂可以显著提高胞内HBV转录水平。4)胞内HBV复制中间体的检测采用实施例3的一的4)的方法检测转染后48h HepG2细胞/miR-122抑制剂和H印G2/阴性对照RNA2。结果如图12C所示，HepG2细胞/miR-122抑制剂的HBV复制中间体明显增加，条带亮度高；HepG2/miR-122抑制剂阴性对照RNA的HBV复制中间体相对少，rcDNA，ssDNA条带很淡。从上述结果可以看出，miR-122抑制剂可以显著促进HBV表面抗原和上清HBV病毒颗粒的分泌，胞内HBV转录水平增加，胞内HBV复制中间体显著上调。二、miR-122抑制剂在促进肝癌细胞Huh7增殖中的应用转染前一天将Huh7接种到6孔板，转染时细胞汇合度达到60_70%，提前一个小时将培养基换成opt1-MEM。miR-122 抑制剂(miR-122 抑制剂 +pHBVl.3):将 miR-122 抑制剂与 pHBVl.3 复制性质粒采用lipo2000共转染Huh7细胞，得到Huh7/miR-122抑制剂；RNA和质粒的转染比例最佳为质量比3ul:lug, 4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2mllO%FBS的DMEM全培养基。阴性对照组(对照+pHBVl.3):采用同样的方法将miR-122抑制剂阴性对照RNA与pHBVl.3复制性质粒采用lipo2000共转染H印G2细胞，得到Huh7/阴性对照RNA2。转染第二天上午将细胞消化计数重铺96孔板,一个孔细胞为2000个,设置三个重复孔，在转染后24、48、72h，每孔换 液100ull0%FBS，DMEM，再分别在不同的时间段加入IOul的 CCK8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)孵育 2h, 450nm酶标仪检测吸光值,分别检测 24、48、72h细胞增殖。结果如图13所示，miR-122抑制剂(miR-122抑制剂+pHBVl.3)转染后0、24、48、72h 后 0D450 的吸光值分别为 0.19,0.6、1.2、1.89 ；阴性对照组(对照+pHBVl.3)转染后0、24、48、72h后0D450的吸光值分别为0.21、
0.5、1、L 5 ;可以看出，miR-122抑制剂和pHBVl.3共转染肝癌细胞Huh7细胞后CCK8检测可以促进细胞增殖 。
权利要求
1.一种重组腺病毒载体，为将miR-122的至少一个编码基因插入pDC312_cmv腺病毒载体中得到的重组腺病毒载体； 所述miR-122为序列表中的序列I所示的RNA或序列表中的序列3编码的RNA。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于: 所述重组腺病毒载体为如下I)或2): 1)所述重组腺病毒载体为将所述miR-122的I个编码基因插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体； 2)所述重组腺病毒载体为将所述miR-122的8个编码基因插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒载体，其特征在于: 所述miR-122的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ； 所述miR-122的8个编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。
4.根据权利要求2或3所述的重组腺病毒载体，其特征在于: 1)所述重组腺病毒载体为将序列表中的序列3所示DNA分子插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体； 2)所述重组腺病毒载体为将序列表中的序列4所示DNA分子插入pDC312-cmv腺病毒载体的多克隆位点间得到的载体。
5.一种重组腺病毒，为将权利要求1-4中任一所述的重组腺病毒载体转入宿主细胞，包装得到的腺病毒；所述宿主细胞具体为人胚肾细胞。
6.iR-122在制备具有如下I)和/或2)功能的产品中的应用: 1)预防和/或治疗肿瘤； 2)减小肿瘤数量和/或肿瘤重量； 所述miR-122为序列表中的序列I所示的RNA或序列表中的序列3编码的RNA。
7.权利要求1-4中任一所述的重组腺病毒载体在制备具有如下I)-7)中至少一种功能的广品中的应用: 1)预防和/或治疗肿瘤； 2)减小肿瘤数量和/或肿瘤重量； 3)抑制乙肝病毒HBsAg抗原和/或HBeAg抗原表达； 4)抑制乙肝病毒DNA拷贝； 5)抑制肝细胞的HBcAg抗原表达； 6)抑制乙肝病毒转录； 7)抑制肿瘤细胞增殖。
8.权利要求5所述的重组腺病毒在制备具有如下I)-5)中至少一种功能的产品中的应用: 1)预防和/或治疗肿瘤； 2)减小肿瘤数量和/或肿瘤重量； 3)抑制乙肝病毒HBsAg抗原表达； 4)抑制乙肝病毒DNA拷贝； 5)抑制肝细胞的HBcAg抗原表达。
9.根据权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于:所述肿瘤为肝癌；所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
10.根据权利要求6-9中任一所 述的应用，其特征在于:所述产品为药物。
全文摘要
本发明公开了一种RNA及载体在制备预防和/或治疗肝癌产品中的应用。本发明提供了一种重组腺病毒载体，为将至少一个miR-122的编码基因插入pDC312-cmv腺病毒载体中得到的重组腺病毒载体；所述miR-122为序列表中的序列1所示的RNA或序列表中的序列3编码的RNA。本发明的实验证明，本发明将miR-122编码基因导入腺病毒载体中，并且纯化出腺病毒，用其进行动物实验，发现miR-122及重组腺病毒载体或腺病毒可明显抑制乙肝慢性感染引发的肝癌，可开发成为新型肝癌治疗药物。
文档编号A61P31/20GK103088061SQ20131001389
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者孟颂东, 郝军莉, 李长菲, 胡俊 申请人:中国科学院微生物研究所