专利名称：负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法及得到的支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及心血管支架制备领域，具体涉及ー种负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法及得到的支架。
背景技术：
心血管疾病已经成为世界范围内死亡率最高的疾病之一。经皮冠状动脉腔内介入手术在治疗心血管疾病中发挥了重要的作用，但是，植入心血管材料后，由于材料和人体本身的不相容性，会产生一系列的并发症，例如凝血，血栓以及血管再狭窄等，这些问题造成了手术的失败，进而严重影响了治疗的效果。出现并发症主要是由于血液-材料-组织之间的相互接触，以及血管不可避免的损伤导致血小板局部凝集和血管内膜的损伤导致的一系列凝血连锁反应。活化了的血小板和炎症细胞释放的细胞因子刺激了血管内的平滑肌细胞，使其过度増殖，并迁移至血管内膜，同时大量的细胞外基质分泌和沉积，导致血管内腔不断堵塞，造成了再狭窄。损伤的内皮细胞层引起了局部血管损伤的修复反应，造成了血管再狭窄。药物洗脱支架(Drug-eluting stent, DES)已经被广泛用于临床治疗手术后血管再狭窄。药物洗脱支架主要是通过将药物，例如，雷帕霉素(rapamycin)和紫杉醇(paclitaxel)，通过聚合物包埋的方式负载到支架表面，通过这些药物对平滑肌细胞増殖的抑制，来达到降低血管再狭窄的目的。然而，多例临床报告显示，药物洗脱支架存在晩期血栓形成等问题，这主要是由于药物在抑制平滑肌细胞的同时，也抑制了内皮细胞的増殖和功能，内皮化过程不完善，使内膜无法形成和覆盖支架，长时间裸露的支架表面又会形成血栓。内皮细胞构成的内皮层对维持血管的正常生理功能具有很重要的作用，完整的内皮层能够在血管内表面形成 了抗凝血和血栓系统，維持血液在血管中的正常流动，同时还能调节血管中层平滑肌细胞的行为，因此，快速内皮化是降低血管再狭窄的有效手段。因此，需要获得ー种心血管支架，能够在有效促进内皮化的同时，降低木后引起的心血管支架再狭窄率。
发明内容
本发明提供了一种负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，操作简单，且功能基因涂层能够稳定均匀包裹在心血管支架的表面，在生物体内部会快速降解和释放，能够快速促内皮化，有效降低手术后产生的血管再狭窄率。一种负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，包括以下步骤:(I)将聚阳离子电解质溶解在溶剂A中配成聚阳离子电解质溶液；将至少ー种编译特定功能基因溶解在溶剂B中配成功能基因电解质溶液；(2)将心血管支架完全浸泡在聚阳离子电解质溶液中，经过一段时间后取出，用溶剂C洗涤；
(3)将步骤(2)中得到的心血管支架完全浸泡在功能基因电解质溶液中，经过ー段时间后取出，用溶剂D洗涤；(4)重复步骤(2) 步骤(3)若干次后，将心血管支架用氮气吹干，得到所述的心血管支架。聚阳离子电解质溶液首先吸附在心血管支架的表面，改变心血管支架表面的电荷分布，聚阳离子电解质再与带有相反电荷的编译特定功能基因相作用，使编译特定功能基因结合在心血管支架的表面，循环附着聚阳离子电解质和编译特定功能基因若干次后，得到具有功能基因涂层的心血管支架。本发明对于温度无特殊限定，只要能够保持聚阳离子电解质溶液和功能基因电解质溶液为液态即可。现有技术中常用的，在生物体内不会引起排异反应的聚阳离子电解质均可采用，只要能够改善心血管支架的表面电荷状况，使其带正电即可，优选地，所述聚阳离子电解质为硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖或聚こ烯基亚胺。聚阳离子电解质溶液的浓度以及功能基因电解质的浓度均无特殊限定，但是，这两个浓度过低，会大大降低涂层中功能基因电解质的吸附效率，过高则会増加成本，优选地，所述聚阳离子电解质溶液中聚阳离子电解质的浓度为10_5lg/mL，所述功能基因电解质溶液中编译特定功能基因的浓度为10_5 lg/mL，进ー步优选，所述聚阳离子电解质溶液中聚阳离子电解质的浓度为0.1 5mg/mL，所述功能基因电解质溶液中编译特定功能基因的浓度为0.1 5mg/mL，最优选，所述聚阳离子电解质溶液中聚阳离子电解质的浓度为0.1 lmg/mL，所述功能基因电解质溶液中编译特定功能基因的浓度为0.1 lmg/mL。
溶剂A无特殊限制，只要能相应地溶解聚阳离子电解质即可，溶剂B无特殊限制，只要能相应地溶解功编译特定功能基因即可。所述溶剂A、溶剂B、溶剂C和溶剂D为同种溶剂，选自去离子水、磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液。作为优选，所述编译特定功能基因为编译肝细胞生长因子质粒DNA(Isaka，Y.，et al.(200 ノ Electroporation—mediated HGF gene transfection protected thekidney against graft injury.Gene Therapyl2 (10):815-820.),编译血管内皮生长因子质粒 DNA(Janavel, G.V., et al.(2006).Plasmid-mediated VEGF gene transferinduces caraiomyogenesis and reduces myocardial infarct size in sheep.Gene Therapyl3 (15):1133-1142.),编译内皮一氧化氮合成酶质粒 DNA (Sharif, F., etal.(2008) Gene-eluting stents:Adenovirus-meaiated delivery of eNOS to theblood vessel wall accelerates re—endotheliaiization and inhibits restenosis.Molecular Therapyl6 (10):1674-1680.)和编译转化因子质粒 DNA(Daddi，N., et al.(2003).Recipient intramuscular administration of naKed plasmidTGF-betalattenuates lung graft reperfusion injury.Journal of Heart and LungTransplantation22 (12): 1323-1334.)中的至少一种。心血管支架在聚阳离子电解质溶液或者功能基因电解质溶液中循环浸泡的次数并无特殊限制，至少在两种溶液中分别浸泡一次，使编译特定功能基因附着在心血管支架的表面，循环浸泡次数越多，则附着的编译特定功能基因量越多，促内皮化效果越好，优选地，所述步骤⑷中重复步骤⑵ 步骤⑶I 200次。在聚阳离子电解质溶液中的浸泡时间无特殊限制，优选地，心血管支架在聚阳离子电解质溶液中浸泡30s 2h，进ー步优选，心血管支架在聚阳离子电解质溶液中浸泡I 30mino在功能基因电解质溶液中的浸泡时间无特殊限制，优选地，心血管支架在功能基因电解质溶液中浸泡30s 2h，进ー步优选，心血管支架在功能基因电解质溶液中浸泡I 30mino与现有技术相比，本发明方法具有以下有益效果:(I)本发明采用层层自组装技术在心血管支架表面构建功能基因涂层，制备方法エ艺简便，所使用的聚阳离子电解质和编译特定功能基因的选择范围广，同时作为基底的心血管支架材料不限，适合エ业化生产与实际应用。(2)本发明采用的层层自组装技术，能够准确地调节负载在心血管支架表面的编译特定功能基因的量，能够很好地控制制备得到的具有功能基因涂层的心血管支架的成本。(3)本发明制备的具有功能基因涂层的心血管支架能够同时负载多种功能基因，实现高效的防止血管再狭窄的功能。(4)本发明制备的功能基因涂层在心血管支架表面均匀分布，同时在受到球囊扩张所产生的张カ时，功能基因涂层仍然能够很好地附着在心血管支架的表面，不会剥离或者脱落。(5)本发明制备的具有功能基因涂层的心血管支架，心血管支架表面的功能基因涂层在生理环境中能够稳 定存在，心血管支架表面的编译特定功能基因不会暴释，在植入血管后，能够稳定存在，不会被血液所腐蚀或者冲走。(6)本发明制备的具有功能基因涂层的心血管支架能够同时转染内皮细胞和平滑肌细胞，促使每种细胞分泌所编译的生长因子，而分泌的生长因子能够实现促进内皮细胞生长或者抑制平滑肌细胞生长或者同时促进内皮生长和抑制平滑肌细胞生长的功能，有效地调节内皮细胞与平滑肌细胞的竞争性。(7)本发明制备的具有功能基因涂层的心血管支架能促进内皮化，能够有效地降低木后血管再狭窄的发生率。
图1是内皮细胞在没有负载功能基因涂层的心血管支架和实施例1所制备的负载HGF-pDNA功能基因涂层的心血管支架上的生长情况图；图2是将没有负载功能基因的心血管支架植入兔子体内后7天的扫描电镜图；图3是将实施例1所制备的负载HGF-pDNA功能基因涂层的心血管支架植入兔子体内后7天的扫描电镜图。
具体实施例方式实施例1(I)配制含有20mM4_羟こ基哌嗪こ磺酸；N_(2_羟こ基)哌嗪-N' _2_こ烷磺酸(Hepes)和150mM氯化钠(NaCl)的缓冲液；(2)利用缓冲液配制质量分数lmg/ml的硫酸鱼精蛋白(PrS)溶液，搅拌至硫酸鱼精蛋白完全溶解；利用缓冲液配制质量分数lmg/ml的编译肝细胞生长因子的质粒DNA(HGF-pDNA)溶液，搅拌至HGF-pDNA完全溶解；(3)将心血管支架先浸泡在硫酸鱼精蛋白电解质溶液中20分钟，用步骤(I)中的缓冲液清洗5次；(4)再浸泡在HGF-pDNA溶液中20分钟，用步骤(I)中的缓冲液清洗5次；(步骤(3)和步骤(4)共同构成ー个双层的制备)(5)重复(3)和⑷过程12次，制备得到12双层的涂层，用步骤⑴中的缓冲液洗涤心血管支架后，用氮气吹干，所制备的心血管支架在植入生物体内后可以有效地降低
血管再狭窄率。由图1可知，负载HGF-pDNA功能基因涂层的心血管支架上内皮细胞増殖速度明显比没有负载功能基因涂层的心血管支架快。由图2和图3可知，负载HGF-pDNA功能基因涂层的心血管支架的内皮化程度明显好于没有负载功能基因涂层的心血管支架。实施例2:`
(I)配制含有20mM4_羟こ基哌嗪こ磺酸；N_(2_羟こ基)哌嗪-N' _2_こ烷磺酸(Hepes)和150mM氯化钠(NaCl)的缓冲液；(2)利用缓冲液配制质量分数lmg/ml的硫酸鱼精蛋白(PrS)溶液，搅拌至硫酸鱼精蛋白完全溶解；利用缓冲液配制质量分数lmg/ml的编译血管内皮生长因子的质粒DNA(VEGF-pDNA)溶液，搅拌至VEGF-pDNA完全溶解；(3)将心血管支架先浸泡在硫酸鱼精蛋白电解质溶液中20分钟，用步骤(I)中的缓冲液清洗5次；(4)再浸泡在VEGF-pDNA溶液中20分钟，用步骤(I)中的缓冲液清洗5次；(步骤(3)和步骤(4)共同构成ー个双层的制备)(5)重复(3)和⑷过程12次，制备得到12双层的涂层，用步骤(I)中的缓冲液洗涤心血管支架后，用氮气吹干，所制备的心血管支架在植入生物体内后可以有效地降低血管再狭窄率。实施例3:(I)配制含有20mM4-羟こ基哌嗪こ磺酸；N_(2_羟こ基)哌嗪-N' -2-こ烷磺酸(Hepes)和150mM氯化钠(NaCl)的缓冲液；(2)利用缓冲液配制质量分数lmg/ml的硫酸鱼精蛋白(PrS)溶液，搅拌至硫酸鱼精蛋白完全溶解；利用缓冲液配制质量分数lmg/ml的编译血管内皮生长因子的质粒DNA(eNOS-pDNA)溶液，搅拌至eNOS-pDNA完全溶解；(3)将心血管支架先浸泡在硫酸鱼精蛋白电解质溶液中20分钟，用步骤(I)中的缓冲液清洗5次；
(4)再浸泡在eNOS-pDNA溶液中20分钟，用步骤(I)中的缓冲液清洗5次；(步骤
(3)和步骤(4)共同构成ー个双层的制备)(5)重复(3)和⑷过程12次，制备得到12双层的涂层，用步骤⑴中的缓冲液洗涤心血管支架后，用氮气吹干，所制备的心血管支架在植入生物体内后可以有效地降低
血管再狭窄率。上述实施例只是为了让熟悉此项技术的认识能够了解本发明多的内容并据以实施，并不能够以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1.一种负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将聚阳离子电解质溶解在溶剂A中配成聚阳离子电解质溶液；将至少ー种编译特定功能基因溶解在溶剂B中配成功能基因电解质溶液； (2)将心血管支架完全浸泡在聚阳离子电解质溶液中，经过一段时间后取出，用溶剂C洗漆; (3)将步骤(2)中得到的心血管支架完全浸泡在功能基因电解质溶液中，经过一段时间后取出，用溶剂D洗涤； (4)重复步骤(2) 步骤(3)若干次后，将心血管支架用氮气吹干，得到所述的心血管支架。
2.按权利要求1所述的负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，所述聚阳离子电解质为硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖或聚こ烯基亚胺。
3.按权利要求1所述的负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，所述聚阳离子电解质溶液中聚阳离子电解质的浓度为1(T5 lg/mL。
4.按权利要求1所述的负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，所述功能基因电解质溶液中编译特定功能基因的浓度为10_5 lg/mL。
5.按权利要求1所述的负载功能 基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，所述溶剂A、溶剂B、溶剂C和溶剂D为同种溶剂，选自去离子水、磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液。
6.按权利要求1所述的负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，所述编译特定功能基因为编译肝细胞生长因子质粒DNA，编译血管内皮生长因子质粒DNA，编译内皮一氧化氮合成酶质粒DNA和编译转化因子P I质粒DNA中的至少ー种。
7.按权利要求1所述的负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，其特征在于，所述步骤⑷中重复步骤⑵ 步骤⑶I 200次。
8.一种具有功能基因涂层的心血管支架，其特征在于，利用如权利要求1 7任一所述的制备方法制备得到。
全文摘要
本发明公开了一种负载功能基因涂层的心血管支架的制备方法，包括以下步骤(1)将聚阳离子电解质溶解在溶剂A中配成聚阳离子电解质溶液；将至少一种编译特定功能基因溶解在溶剂B中配成功能基因电解质溶液；(2)将心血管支架完全浸泡在聚阳离子电解质溶液中，经过一段时间后取出，用溶剂C洗涤；(3)将步骤(2)中得到的心血管支架完全浸泡在功能基因电解质溶液中，经过一段时间后取出，用溶剂D洗涤；(4)重复步骤(2)～步骤(3)若干次后，将心血管支架用氮气吹干，得到所述的心血管支架。本发明还公开了一种利用所述方法制备得到的心血管支架。本发明的制备方法，操作简单，且功能基因涂层能够稳定均匀包裹在心血管支架的表面。
文档编号A61L31/16GK103083734SQ20131002538
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者计剑, 任科峰, 常皓 申请人:浙江大学