专利名称：聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-1b及制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质化学领域，涉及一种聚乙二醇修饰的蛋白质及制备方法，更具体的涉及重组人干扰素β -1b氮末端的聚乙二醇定点修饰产物及制备方法。
背景技术：
随着生物技术的发展，多肽和蛋白质等生物大分子治疗药物不断涌现，在疾病治疗过程中得到越来越广泛的应用。蛋白质和多肽药物具有高活性、低毒性、生物功能明确、特异性强的优点。但是也存在着诸如易被酶水解、循环半衰期短、免疫原性高及溶解度低等缺点。因此，开发安全、有效、生物利用度高的给药系统对改善蛋白质药物的临床有效性具有非常重要的意义。经过40多年的发展，蛋白质的聚乙二醇修饰技术已经是一种成熟的改善蛋白质生理性质的技术，可以用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题。经聚乙二醇共价偶联之后的蛋白质与原蛋白相比，其免疫原性更弱，体内半衰期更长，可以显著改善药物的药理药代性质。迄今为止，已经有多种聚乙二醇修饰的药物通过FDA认证[Alconcel, S.N.S., Baas, A.S., Maynard H.D.,等人 FDA-approved poly (ethyleneglycol)protein conjugate drugs.Polymer Chemistry, 2011, 2:1442 - 1448.]。蛋白质的聚乙二醇修饰，通常的修饰位点是蛋白质序列中赖氨酸残基的ε氨基，N末端的氨基，以及半胱氨酸的巯基。由于蛋白质结构上游离的氨基相对较多，对氨基的修饰会出现多种修饰产物，即使经过分离纯化得到单修饰产物也可能出现异构体的情况。而巯基修饰则对蛋白质本身有较高的要求，需要蛋白质本身具有游离巯基或者通过基因工程的方法引入。对于蛋白质的聚乙二醇修饰来说，定点的单修饰是一种发展趋势，因为采用这样的修饰策略产生的是均一的修饰产物，产物的分离纯化大为简化，且有利于蛋白药物的活性保留。具体到氮末端是 丝氨酸的蛋白质，可以采用高度特异性的氧化方法将蛋白质N末端丝氨酸衍生为醛基，与端基能与醛基反应的活化聚乙二醇进行共价偶联，达到对该类蛋白质N末端定点修饰的目的。人干扰素(IFN)是由活化的成纤维细胞和某些上皮细胞产生的细胞因子类蛋白质药物，具有抗病毒感染、抗肿瘤和较强的免疫调节作用。干扰素在应用中大多数都存在半衰期短，免疫原性强的缺点。针对这些问题，干扰素α的聚乙二醇修饰产物Pegintron (PEG-1FN- a -2b)和 Pegasys (PEG-1FN- a -2a)经 FDA 批准分别于 2000 年和2002年上市，与未修饰的原蛋白相比，PEG修饰的干扰素α具有更长的半衰期和更好的药理药代性质，在临床上显示出极大的药用优势[Yagyu, H.，Okada, K.，Sato, S.，等人.Pegylated interferon-a 2b and ribavirin combination therapy inducesHashitoxicosis followed by type I diabetes mellitus.Diabetes research andclinical practice, 2012，95:52-54.]。而已被证实可减少多发性硬化症的复发次数、延长复发的间隔、减轻病痛和残疾的程度、推迟残疾的发生以及改善中枢神经系统脑部和脊髓的组织病理改变的干扰素β虽然同样存在体内半衰期短、具有免疫原性、有一定副作用等问题，但由于它是一种强疏水性的蛋白，在水中的溶解需要添加促溶剂作为辅助，溶液状态下容易形成聚集体，导致其分析和定量存在困难，并且经PEG修饰以后的产物分离纯化也因为聚集体的存在而难以有效进行。多年以来科学工作者对于干扰素β的聚乙二醇修饰进行了一定的探索。例如，Katre等对干扰素β-1a的氨基进行了聚乙二醇修饰(见美国专利号4766106和4917888以及国际公开号W087/00056)，Alessandra对干扰素β -1a的巯基(Cys17)进行修饰(见美国专利号0239529)。对重组人干扰素β-1b来说，其序列上不存在游离巯基，对它的修饰主要集中在氨基上。如Basu等使用多种PEG修饰剂对重组人干扰素β -1b进行了化学修饰，并对相互之间的优劣进行比较[Basu, A., Yang, K., Wang, Μ.L.，等人.Structure-function engineering of interferon-β -1b for improvingstability，solubility，potency，immunogenicity，and pharmacokinetic properties bysite-selective mono-PEGylation.Bioconjugate chemistry，2006，17(3):618-630.]。最近又出现了在有机相溶液中对重组人干扰素β-1b进行化学修饰的新探索，使用聚乙二醇氮羟基琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)修饰重组人干扰素β _lb，相对于水相修饰在有机相中的修饰可以有效地提高修饰率[Su, Z.G., Peng, F., Wang, Y.J.,等人.PEGylation ofProteins in Organic Solution:a Case Study for Interferon beta-lb.Bioconjugatechemistry, 2012, 23:1812-1820.] 0但是这些探索都是针对重组人干扰素β-1b的氨基进行修饰，存在着诸如多修饰、分离困难等问题，最终没有得到均一的定点单修饰产物。对于现在广泛采用的通过控制溶液pH值对蛋白质进行N末端氨基修饰的方法(见日本专利公开号9-25298A)，近期也有报道指出这种方法同样会产生多修饰的产物[Yu，D.Q.，Ghosh.R., Purification of pegylated protein using membrane chromatograph.Journal ofPharmaceutic·al Sciences, 2010, 99(8):3326-3333]。传统的氨基修饰得到的产物其稳定性以及生理活性不能保证，使得这些产物在新药申报的道路上困难重重，目前国内外也没有聚乙二醇修饰的干扰素β药物上市。因此，本领域中需要稳定并且可改善重组人干扰素β -1b的药理药代性质的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-lb。
发明内容
本发明基于重组人干扰素β -1b的N末端为丝氨酸的结构，将蛋白质N末端丝氨酸氧化为醛基，与端基能与醛基反应的活化聚乙二醇进行共价偶联，得到N末端单修饰的重组人干扰素β-lb。本发明的具体技术方案如下:在第一方面，本发明提供了一种聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素β _lb，其特征在于，所述修饰产物结构如式I所示:PEG-1FN-^-1b (I)其中，所述重组人干扰素β -1b的N末端为丝氨酸，所述聚乙二醇与所述重组人干扰素β -1b的N末端共价偶联；优选地所述聚乙二醇的端基结构如式II所示:PEG-A (II)其中，A为氨基(-NH2)、氧氨基(-O-NH2)或酰肼基(-CO-NH-NH2)；优选地所述聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
在本发明的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-lb中，所述聚乙二醇和所述重组人
干扰素β _lb的连接键可以为亚胺
权利要求
1.一种聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素β-lb，其特征在于，所述修饰产物结构如式I所示: PEG-1FN-^-1b (I) 其中，所述重组人干扰素β-1b的N末端为丝氨酸，所述聚乙二醇与所述重组人干扰素β -1b的N末端共价偶联； 优选地所述聚乙二醇的端基结构如式II所示: PEG-A(II) 其中，A为氨基(-NH2)、氧氨基(-O-NH2)或酰肼基(-CO-NH-NH2)； 优选地所述聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-lb，其特征在于，所述聚乙二醇和所述重组人干扰素β -1b的连接键为亚膨
3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-lb，其特征在于，所述聚乙二醇为直链、支链或者多臂聚乙二醇，优选为直链聚乙二醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-lb，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量范围为2000Da-80000Da，优选为5000Da_50000Da，更优选为10000Da_30000Da。
5.如权利要求1-4中任一项所述的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-lb的制备方法，其特征在于，所述方法包括将重组人干扰素β -1b的N末端的丝氨酸氧化为醛基，之后与端基为氨、氧氨或酰肼的聚乙二醇共价偶联。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (A)将重组人干扰素β-lb的N末端的丝氨酸氧化为醛基，如式(I)所示:
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(A)中使用的氧化剂为氯化铵三氧化铬、二氧化锰、高碘酸和高碘酸盐，优选为高碘酸盐，更优选为高碘酸钠。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(B)中使用的还原剂为硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠，优选为氰基硼氢化钠。
9.一种药物组合物，其包含如权利要求1至4中任一项所述的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β -1b0
10.如权利要求1至4中任一项所述的聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-1b在制备药物中的应用，所述药物用于预防和治疗急性、慢性及复发性病毒感染疾病以及神经系统炎性免疫性疾病,缓解并治疗复发型多发性硬化疾病，以及治疗恶性肿瘤如宫颈上皮内肿瘤、肿瘤性胸腔积液、毛细胞性白血病、乳腺肿瘤或子宫内膜肿瘤。
全文摘要
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-1b(IFN-β-1b)及其制备方法。通过将重组人干扰素β-1b的氮末端丝氨酸(Ser)氧化为醛基，再与带有能与醛基反应的聚乙二醇衍生物(PEG-NH2、PEG-O-NH2、PEG-HZ)进行共价偶联，制备得到重组人干扰素β-1b的氮末端聚乙二醇定点修饰产物。本发明的聚乙二醇修饰重组人干扰素β-1b仍具有重组人干扰素β-1b的生理活性，但在免疫原性、药理、药代及药效等方面优于原有蛋白。
文档编号A61P35/02GK103113466SQ201310066150
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者张竞, 周展, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所