专利名称：响应面法优化纳米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺的制作方法
响应面法优化纳米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺技术领域
本发明属于化学技术领域，涉及一种响应面法优化纳米山茱萸中α -葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺。
背景技术：
纳米技术是指在纳米尺度(lX10-9cm)上对物质和材料进行加工、制造的一种高新技术。1998年徐碧辉提出了“纳米中药”的概念，即运用纳米技术制造的、粒径小于100纳米的中药有效成分、有效部位、原药及其复方制剂。纳米中药具有提高生物利用度、靶向给药、增强功效、促进中药制剂的标准化和国际化等优点。响应面分析法(Response SurfaceMethodology,简称RSM)由一组数学和统计学方法组成，能够精确地表述因素和响应值之间的关系，同时可根据数学模型控制响应值，选择不同的操作参数，从而寻求最佳工艺参数。中药在提取过程中常常会受到诸多因素的影响，响应曲面优化法在中药有效成分的提取中，可以确定在试验范围内的任何试验点的预测值，因而在对纳米山茱萸中的降血糖活性成分的优化中，响应曲面优化法比正交设计和均匀设计更合适。
山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的干燥成熟果肉，是世界上三大名贵木本药材之一。临床上多用山萸肉和酒山萸肉，新鲜山茱萸果肉中的主要成分有单糖、多糖、有机酸、苷类、环烯醚萜类、黄酮、蒽醌、制本、内酯等。山茱萸常出现在中医降血糖的组方中，是常用的降血糖药物。现代研究表明，山茱萸的有效成分糖蛋白、熊果酸、齐增果酸、多糖、苷类、鞣质、环烯醚萜类等都具有降血糖效果。发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种响应面法优化纳米山茱萸中α -葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺，本发明采用α -葡萄糖苷酶抑制剂微孔板高通量筛选模型，运用响应面法优化山纳米茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺，为山茱萸降血糖成分的充分提取做了初步探讨，并为 其进一步的开发利用提供科学基础和理论依据。
其技术方案为:一种响应面法优化纳米山茱萸中α -葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺，包括以下步骤:
以1: 25的料液比加样，即称取0.5g的山茱萸粉末于试管中，然后加入12.5ml的53%的乙醇，在超声仪中于50°C的条件下超声19min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为:
本发明响应面分析法通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，其回归方程精度高。因此，用响应面法优化的超声波提取工艺更为精准，对山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的工业化生产有较高的参考价值，也为山茱萸降血糖成分的进一步分离纯化及功能性研究提供了科学依据，奠定了一定的理论基础。
图1是超声时间对抑制率的影响图，超声温度=300C，乙醇体积分数=40%,料液比=I: 10 ；图2是超声温度对抑制率的影响图，超声时间=20min,乙醇体积分数=40%，料液比=1: 10 ；图3是料液比对抑制率的影响图，超声时间=20min，超声温度=30°C，乙醇体积分数=40% ；图4是乙醇浓度对抑制率的影响图，超声时间=20min，超声温度=30°C，料液比=I: 10 ；图5是超声温度和超声时间对抑制率影响的响应面图(A)和等高线图⑶；图6是超声温度和料液比对抑制率影响的响应面图㈧和等高线图⑶；图7是超声温度和乙醇浓度对抑制率影响的响应面图(A)和等高线图(B)；图8是超声时间和料液比对抑制率影响的响应面图㈧和等高线图⑶；图9是超声时间和乙醇浓度对抑制率影响的响应面图㈧和等高线图⑶；图10是料液比和乙醇浓度对抑制率影响的响应面图㈧和等高线图⑶。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细地说明。材料与方法药材山茱萸于2011年10月至11月采集于陕西佛坪，经陕西师范大学植物学教研室鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的干燥成熟果肉，标本存于陕西师范大学生命科学学院。试剂二甲基亚砜(DMSO)，α-葡萄糖苷酶(a-glucosidase,EC3.2.1.20)，4_ 硝基苯-a-D-卩比喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-alpha-d-glucopyranosid, PNPG)均购于 sigma公司，乙醇，磷酸二氢钾(KH2PO4),磷酸氢二钾(K2HPO4.3Η20)，碳酸钠(Na2CO3)均为分析纯。仪器酶标仪(北京惠安泽泰科技有限公司)，RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，PH计(成都世纪方舟科技有限公司)，XH-B型旋涡混合器(美堰市康健医疗器具有限公司)，ΗΗ-2Β型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，SHB-HIA型循环水式多用真空泵(陕西太康生物科技有限公司)，KQ-600DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DFT-50手提式粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。材料预处理称取已去核的山茱萸干品400g，纳米技术粉碎后放置在干燥器中，备用。纳米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂提取液的制备准确称取纳米技术粉碎的山茱萸粗粉0.5g，放入20mL的试管中，并以一定的料液比加入一定浓度的乙醇，盖上瓶塞，振荡摇勻，放置3h后一定条件下超声三次,抽滤,滤液经旋转蒸发仪蒸发浓缩至40mL,乙醚萃取油脂，静置lOmin，然后旋转蒸发至无乙醚味，定容至40ml并置于锥形瓶中备用。α -葡萄糖苷酶活性的抑制实验
反应体系参照方法，条件优化后为:96微孔板上每孔加磷酸钾缓冲液(ρΗ6.8) 180 μ L，再加入α -葡萄糖苷酶15 μ L，样品溶液4 μ L，混匀，37°C恒温15min后，加Λ 10mmol/LPNPG30 μ L，混匀后37。1:恒温反应15min，于405nm波长下测吸光度A值。每个样品做3份平行，取平均值，计算抑制率。空白组对照组用缓冲液代替α-葡萄糖苷酶和山茱萸提取液；对照组用缓冲液代替山茱萸提取液。实验共设a，b，c，d，e5个组，每组三孔，分别为:a.对照组(缓冲液+酶液+底物)b.空白组对照组(缓冲液)c.样品测定组(样品+酶液+底物)d.样品对照组(样品+缓冲液)e.阳性对照组(Acarbose+酶液+底物)根据本实验方法按下面公式计算样品抑制率:样品的百分抑制率(1%) = [l-(c-d)/(a-b)] X100%单因素试验选取乙醇体积分数、超声时间、超声温度和料液比4个影响α -葡萄糖苷酶抑制剂提取效果的因素，以对α-葡萄糖苷酶的抑制率为指标确定这4个因素的适宜范围。响应面优化试验采用Design-Expert软件研究乙醇体积分数、超声时间、超声温度和料液比4个因素对α -葡萄糖苷酶抑制剂的影响，并用BoxBehnken试验设计方案,进行4因素3水平的响应面试验。结果与分析单因素试验结果:实验结果见图1 4。实验结果显示:超声温度、乙醇体积分数、料液比对α-葡萄糖苷酶抑制作用有较大的影响，超声时间对其影响相对较小。所以，初步选定α-葡萄糖苷酶抑制剂的超声辅助提取最佳工艺条件为超声时间20min、超声温度40°C、乙醇浓度40%、料液比1: 20。响应面的实验设计及结果根据Box-Beknhen试验设计原理,运用Design-Expert软件对超声温度(A)、超声时间(B)、料液比(C)、乙醇体积分数(D)4个因素作进一步的优化。响应面分析因素与水平和实验设计分别见表I和表2。表I响应面因素水平编码表
权利要求
1.一种响应面法优化纳米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤:称取0.5g的山茱萸粉末于试管中，然后加入12.5ml的53%的乙醇，在超声仪中于50°C的条件 下超声19min。
全文摘要
本发明公开了一种响应面法优化纳米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取工艺，以纳米技术粉碎的山茱萸为原料，在单因素实验的基础上，选取乙醇体积分数、超声时间、超声温度和料液比做为响应面分析的因素，通过中心组合设计，以山茱萸乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为响应值，采用响应面分析法研究各因素及其交互作用对山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的影响。响应面分析得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂的最佳提取条件为超声温度50℃，超声时间19min，料液比1∶25，乙醇浓度为53％。此工艺为纳米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发利用提供了理论依据。
文档编号A61K131/00GK103169751SQ20131008267
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者康杰芳, 李慧敏, 刘艳妮, 安莉, 王喆之 申请人:陕西师范大学