基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向mri造影剂的制备方法

专利名称：基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向mri造影剂的制备方法
基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法技术领域
本发明属于核磁共振成像造影剂的制备领域，特别涉及一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法。
背景技术：
一直以来，恶性肿瘤都是危害人类生命的头号杀手，具有死亡率高、难治疗以及恶化迅速等特点。因此，肿瘤的早期诊断和特异性治疗显得尤为重要。目前，肿瘤的检测手段各种各样，主要有:超声成像、CT成像、核医学PET成像以及核磁共振成像(MRI)。随着核磁共振技术的发展，其扫描时间逐渐缩短，分辨率逐渐提高，对于小病灶的检测也更加准确，这也使得核磁共振成像技术成为近几年发展起来的新型疾病检测手段。为了提高MRI成像诊断的灵敏度和特异性，有必要选择合适的MRI造影剂。常规的MRI造影剂主要分为两类:一类是T1加权的MRI造影剂，一类是T2加权的MRI造影剂。T1加权的MRI造影剂主要是Gd基配合物，然而，Gd为重金属元素，小分子Gd试剂在体内停留时间过短，其临床注射剂量较大，且Gd试剂具有很强的肾毒性，特别是对肾功能不全患者危害尤甚。而T2加权的MRI造影剂主要是超顺磁Fe3O4为代表的金属铁氧化物纳米粒子，超顺磁性氧化铁具有独特的磁学性质以及信号强、使用剂量低和好的生物相容性等特点使其成为核磁共振成像的良好造影剂。
作为生物体内MRI造影剂，Fe3O4纳米颗粒必须具有良好的水溶性、稳定性、生物相容性、和较高的T2弛豫率。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)是一种水溶性聚胺，其大分子链上拥有大量的氨基，不仅为磁性Fe3O4纳米颗粒提供了稳定存在的屏障，并且使纳米Fe3O4颗粒表面带上了正电荷和功能性基团，这就为Fe3O4纳米颗粒的表面多功能修饰提供了可行性(Cai et al., ACS Appl.Mater.1nterfaces2013, DO1:10.1021/am302883m;专利公开号 201210277624.9)。聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是高亲水性聚合物，它对纳米颗粒的修饰可以提高纳米颗粒的水溶性和生物相容性，并延长其在体内的血液循环时间(Peng et al., Biomaterials2012, 33, 1107-1119 ；ffen et al., Biomaterials2013, 34, 1570-1580)。叶酸作为一种靶向分子，具有分子量小、无毒、无免疫原性、生物相容性好、稳定性高、廉价易得、易于修饰等多种优势(Shi et al., AdvancedMaterials2008, 20，1671-1678)`。本课题组前期的专利(专利公开号201210277624.9)成果显示聚乙烯亚胺(PEI)修饰的磁性氧化铁纳米颗粒可以通过简易的水热法合成。本发明采用相同的方法合成了具有良好胶体稳定性的PEI包覆的Fe3O4纳米颗粒。随后，Fe3O4纳米颗粒表面的PEG-FA修饰不仅增加了纳米颗粒的水溶性和生物相容性，为进一步的体内成像应用提供了保障；同时也提高了 Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位的靶向性，从而使核磁共振成像诊断更加准确、灵敏。
检索国内外文献，尚没有发现关于用一步水热合成法制备PEI包覆和FA修饰的Fe3O4纳米颗粒及其用于体内肿瘤模型靶向MRI研究的相关报道。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。制备的Fe3O4磁性纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
本发明的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，包括:(I)将亚铁盐溶解于超纯水中，加入NH3 -H2O并于空气气氛下搅拌10 20分钟，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并将0.lg/mL的超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，于130 140°C反应2 4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀磁分离洗涤纯化后，即得PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4-PEI,产物储存于4°C备用，取3mL真空冷冻干燥，干燥产物储存于_20°C ；
(2 )将FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2 4h，然后逐滴加入到NH2-PEg-COOH的DMSO溶液中，搅拌反应2 4天，透析(用截留分子量为1000的透析袋对蒸馏水透析三天(6次，2L/次))，除去副产物和杂质，然后真空冷冻干燥，即得C00H-PEG-FA，储存在_20°C备用；
(3)将步骤(I)中制备的Fe3O4-PEI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，再将DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，搅拌反应I 3天后，产物Fe3O4-PE1-FI分离洗涤，然后分散到DMSO中，并储存在4°C备用；
(4)步骤(2 )中制备的C00H-PEG-FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，搅拌活化2 4h ;然后将活化的C00H-PEG-FA溶液加入到步骤(3)制备的Fe3O4-PE1-FI溶液中，搅拌反应2 4天，再分离洗涤，并分散于超纯水中，得到Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒水溶液，并储存在4 °C备用；
(5)向步骤(4)制备的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20 40分钟；然后向上述溶液中加入乙酸酐，继续搅拌反应20 30小时；分离洗涤并分散于超纯水中，即制得乙酰化的产物Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒，取ImL真空冷冻干燥后储存于-20°C，余下4mL储存于4°C备用。
所述步骤(I)中的亚铁盐为FeCl2.4H20，亚铁盐、超纯水、NH3.H2O的配比为I 1.5g:7.5 8.0mL:6. 0 6.5mL,优选1.25g:7.75mL:6.25mL ;亚铁盐与超支化聚乙烯亚胺PEI质量比为2 3:1，优选2.5:1。
所述步骤(I)中的NH3.H2O质量百分比浓度为25-28%。
所述步骤(I)中的超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。
所述步骤(2)中FA、EDC和NHS的摩尔比为1:0.5 1:0.5 1，优选1:0.9:0.9,FA和NH2-PEg-COOH的摩尔比为I 3:1，优选2:1。
所述步骤(2)中NH2-PEg-COOH的分子量为2000。
所述步骤(3)中FI与Fe3O4-PEI表面氨基的摩尔比为1:45 55，优选1:50。
所述步骤(4)中的C00H-PEG-FA与EDC、NHS的摩尔比为1:4 6:4 6，优选1:5:5ο
所述步骤(4)中的C00H-PEG-FA与Fe3O4纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:4 6，优选1:5。
所述步骤(5)中的三乙胺、乙酸酐与Fe3O4纳米颗粒表面的PEI上伯氨基摩尔比为4 6:4 6:1,优选 5:5:1。
本发明先利用一步水热法合成PEI包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒，然后将FI和PEG-FA先后修饰在纳米颗粒的表面，最后对纳米颗粒的剩余表面氨基进行乙酰化修饰。
本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和生物相容性。与没有叶酸修饰的对照材料相比，叶酸修饰的Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位具有更高的靶向性。该方法制备的叶酸靶向性Fe3O4纳米颗粒在MRI分子影像诊断领域有着潜在的应用。
本发明使用X-射线衍射(XRD)、核磁共振波谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、Zeta电势及动态光散射和透射电子显微镜( Μ)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过磁共振成像仪测定纳米颗粒的T2弛豫性能，然后利用溶血实验、MTT法和相差显微镜评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，再利用流式细胞仪、共聚焦显微成像以及体外和体内核磁共振成像实验检测叶酸修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。具体测试结果如下:
(I)X-射线衍射(XRD )测试结果
通过对比和分析X-射线衍射图谱(如图1),水热法合成的材料和Fe3O4的图谱(ICSD20-596) 一致，表明PEI修饰的Fe·3O4晶体结构为四氧化三铁。
(2)核磁共振分析(1H NMR)的测试结果
通过对比NH2-PEG-C00H、FA和C00H-PEG-FA三者在氘代DMSO中的氢谱谱峰(如图2)可知，C00H-PEG-FA在6-9ppm出现的谱峰证明FA已经成功连接到PEG上，并通过积分峰面积计算可知，每一个PEG上连接了 0.7个FA。
(3)紫外吸收(UV-Vis)测试结果
图3 所示为 Fe3O4-PE1-FI (图 3a)、FI (图 3b)和 Fe3O4-PEI (图 3c)在 300 到800nm的紫外吸收图谱。从图中我们可以看出，Fe3O4-PEI在400到800nm处没有明显的紫外吸收峰，而Fe3O4-PE1-FI在510nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到Fe3O4-PEI纳米颗粒表面。
(4)热重分析(TGA)测试结果
为了检测⑶OH-PEG-FA和对照组中mPEG_C00H在Fe3O4纳米颗粒表面的上载量，我们对修饰前后的纳米颗粒进行了 TGA测试。由图4可以看出，修饰前纳米颗粒的失重量为8.97% (图4a)，按PEI表面氨基与PEG摩尔比例5:1修饰后，Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA和对照材料Fe3O4-PE1-FIiiPEG的失重分别是13.23% (图4b)和14.16% (图4c);经过计算，C00H-PEG-FA和mPEG-COOH的上载率分别为4.26%和5.19%,由此表明C00H-PEG-FA和mPEG-COOH已成功连接到Fe3O4纳米颗粒的表面。
(5)纳米颗粒Zeta电势及动态水力径测试结果
纳米颗粒表面的大量氨基会产生细胞毒性，从而限制了纳米颗粒在生物体内的应用。所以，我们通过对Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA和对照材料Fe304-PEI_F1-mPEG表面氨基进行乙酰化修饰，降低其表面电势，从而改善纳米颗粒的生物相容性。电势测定结果(表I)表明，由于大量表面氨基的存在，Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA和Fe304-PEI_F1-mPEG纳米颗粒的表面电势分别达到了 +31.01^和+31.511^。经过乙酰化反应之后，得到乙酰化的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 纳米颗粒表面电势分别降到了 +16.3mV和+16.4mV。结果显示，纳米颗粒的表面氨基已成功乙酰化。但是，乙酰化后纳米颗粒的表面电势未达到中性，这可能是因为表面部分用来稳定Fe3O4纳米颗粒的氨基不能进行乙酰化反应。乙酰化前后，这些纳米颗粒的水动力直径的测试结果同样如表I所示，乙酰化后纳米颗粒的水动力直径较乙酰化前略微减小，并且制备的纳米颗粒的水动力直径能长时间保持几乎不变，从而说明了制备的纳米颗粒具有良好的胶体稳定性。
(6)透射电子显微镜(TEM)测试结果
通过TEM观察本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和对照组材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒的形态和粒径(如图5所示)。TEM测试结果显示Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和对照材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG纳米颗粒的形貌均是球形或准球形。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和对照材料Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG纳米颗粒的直径分别是15.0nm和15.3nm。
(7) T2弛豫率测量结果
Fe3O4纳米材料可以用作核磁共振成像的阴性造影剂，随着Fe浓度的增加，MRI信号强度逐渐减弱。弛豫率(r2)反映Fe3O4纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间，可通过不同浓度下的弛豫时间(T2)的倒数拟合计算得到。图6为本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这两种Fe3O4纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0-0.04mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和对照材料Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG的弛豫率分别达到了99.64ι Μ 和107.30mM-1s-1、人因此，本发明所制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG均可作为MRI分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。
(8)血液相容性
具有良好的血液相容性对纳米颗粒的体内应用来说是至关重要的，因此本实验评估了本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的血液相容性。图 7 中显示了 Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG (图 7a)和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA(图7b)在不同浓度(50、100、200、400μ8/πιυ下的溶血性测试结果。通过对上层清液的吸光光谱进行测量来定量评价纳米材料的溶血性。如图7a和7b右上角紫外图谱显示，在浓度达到 400μ g/mL 时，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 的溶血率都小于5%，说明制备的这些纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MRI成像。
(9) MTT细胞活力和相差显微镜测试结果
通过MTT比色法测定KB细胞(一种人类上皮癌的细胞株)的活力来检测本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的细胞毒性(如图 8)。KB 细胞分别与 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(浓度为10、25、50、75和100 μ g/mL)在37 °C下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS处理的细胞为对照进行比较。与PBS对照组相比，Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA在实验浓度O到100 μ g/mL范围内对KB细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率均在80%以上。这充分说明Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA具有良好的生物相容性，可以应用到生物体内MRI成像诊断。我们通过相差显微镜进一步验证材料对细胞的毒性。如图9所示，不同浓度的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米材料(10、25、50、75 和 100 μ g/mL)处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成材料的良好生物相容。
(10)流式细胞仪检测结果
通过流式细胞仪检测KB细胞对本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG在不同浓度下的吞噬量(如图10)和处理后细胞的平均荧光强度(如图11)来检测叶酸靶向性效果。KB细胞分别与Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (Fe 浓度为 0.125,0.25,0.5,0.75、1.0、1.25 和 1.5mM)在 37°C下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。然后通过流式细胞仪检测细胞的吞噬情况和细胞的平均荧光强度。在图10中，和对照组相比，随着Fe浓度的增加，细胞对Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的吞噬量稍微增加，并且在Fe浓度达到1.0mM时，吞噬量几乎不再增力口。但是随着Fe浓度的增加，细胞对Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的吞噬量却一直明显增加。同样在图11中，随着Fe浓度的增加，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA处理后细胞的平均荧光强度显著增加，而Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG处理后细胞的平均荧光强度增加不明显。这些结果说明叶酸的修饰赋予了纳米颗粒对KB细胞的特异靶向能力。
(11)共聚焦显微镜检测结果
叶酸的靶向性同样通过共聚焦显微镜来验证，如图12所示，KB细胞分别与PBS、本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG (Fe浓度为0.3)在37°C下共培养4小时，然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号。在图12中，经过PBS处理的细胞内没有荧光，Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG处理的细胞内显示出比较微弱的荧光信号，而Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA处理的细胞内显示出很强的荧光信号，这进一步说明叶酸修饰的纳米颗粒对KB细胞有更好的祀向性,从而为该材料成功高效地应用到体内MRI成像提供了可靠的依据。
(12)体外细胞MRI成像结果
在体内实验之前，我们评价了本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的细胞MRI成像效果(如图13所示)，KB细胞分别与 Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(Fe 浓度为 0.1、0.2、0.4和0.8mM)在37°C下共培养6小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。在图13a中，随着 Fe 浓度的增加，Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后的细胞比对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG处理后细胞的MRI信号降低更明显，说明细胞对Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的吞噬量要大大高于Fe304- PEI_Ac-F1-mPEG纳米颗粒。图13b是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI成像信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐减少，而且在相同的Fe浓度下，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后细胞的MRI信号值要明显低于对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MRI成像效果，而且证明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒对KB细胞的特异靶向性。
(13)体内肿瘤MRI成像结果
通过尾静脉注射本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照组材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG来评价肿瘤部位的MRI成像效果(如图14所示)，与注射前的对照组相比较，在注射后30分钟到4小时内，注射对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (Fe:500 μ g)的小鼠肿瘤部位稍微变暗，而注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500yg)的小鼠肿瘤明显变暗，展示出叶酸修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。在注射后24小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去(图14a)。图14b 是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后30分钟到4小时，注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的小鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA的小鼠肿瘤MRI信号值明显降低，在注射后24小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位MRI信号值均有所增加，这与图14a的结果一致。这些结果说明本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MRI肿瘤成像诊断的造影剂。
( 14)体内组织分布结果
为了研究纳米颗粒的生物组织分布情况，ICP-AES用来测量在注射后24小时各个重要器官中铁的含量(图15)。从图中可看出在注射对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500yg)纳米颗粒后，肝、脾和肺中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如:心、肾和肿瘤，铁的聚集较少。同时需要指出的是，注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的小鼠肿瘤部位铁的含量明显高于注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒的情况。这些结果不仅证明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA对肿瘤部位具有很好的靶向性，而且说明本发明制备的纳米颗粒能在小鼠体内正常的代谢清除。
有益.效果
(I)本发明采用简单的“一步”水热法制备水溶性良好的PEI包覆的Fe3O4纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面先后连接FI和PEG-FA分子，最后对纳米颗粒的表面氨基进行乙酰化修饰得到用于MRI造影剂的Fe3O4纳米颗粒；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；
(2)本发明制备的Fe3O4纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象；PEI的包覆增加了 Fe3O4纳米颗粒的稳定性，PEG-FA的表面修饰不仅增加了 Fe3O4纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的靶向特异性；这些优点使制备的叶酸靶向性Fe3O4纳米颗粒可以有效地用作体内MRI成像的阴性造影剂。


图1是本发明制备的Fe3O4-PEI的X-射线衍射图2 是 FA (a)、NH2-PEG-C00H (b)和 COOH-PEG-FA (c)在氘代 DMSO 中的核磁共振氢谱谱图3是本发明制备的Fe3O4-PE1-FI (a)、FI (b)和Fe3O4-PEI (C)的紫外吸收图-1'Tfe1曰；
图4 是本发明制备的 Fe3O4-PE1-FI (a)、Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA (b)和对照材料Fe304-PE1-F1-mPEG (c)的热重分析图5是对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (a, b)和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (c，d)的透射电镜图片和尺寸分布直方图6 是对照材料 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和本发明制备的 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图7是对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (a)和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (b)纳米颗粒的溶血实验紫外图谱，右上角插图显示的是图中放大的紫外吸收图谱，右下角插图从左到右依次是水、PBS、50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL和400 μ g/mL纳米颗粒处理2小时并离心后的人血红细胞图片；
图8是MTT法测试的KB细胞经过PBS缓冲液(对照)、对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(浓度范围在0-100 μ g/mL)处理24小时后的细胞活力；
图9是KB细胞经过PBS缓冲液(对照，a, g)、对照材料Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG(b: 10 μ g/mL, c:25 μ g/mL, d:50 μ g/mL, e:75 μ g/mL, f: 100 μ g/mL)和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(h: 10 μ g/mL, 1: 25 μ g/mL, j: 50 μ g/mL, k: 75 μ g/mL,1:100 μ g/mL)处理24小时后的细胞形态；
图10是KB细胞经过PBS缓冲液(对照，a, i)、对照材料Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG(Fe 浓度范围 b:0.125，c:0.25，d:0.5，e:0.75，f:l.0，g:l.25 和 h:l.5mM)和本发明制备的 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳 米颗粒(Fe 浓度范围 j:0.125，k:0.25，1:0.5,m:0.75, η: 1.0,ο:1.25和ρ:1.5mM)处理4小时后流式细胞分析图11是KB细胞经过PBS缓冲液、对照材料Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe浓度范围在0.125-1.5mM)处理4小时后细胞的平均荧光强度；
图12是KB细胞经过PBS缓冲液(对照，a_d)、对照材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG(e-h)和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(i_l) (Fe浓度为0.3mM)处理4小时后细胞的共聚焦显微成像图片；
图13是KB细胞经过PBS缓冲液、对照材料Fe3O4-PE I _Ac_F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe浓度范围在0.1-0.8mM)处理6小时后的细胞T2MRI成像图片(a)和相应的MRI信号值变化(b)；
图14是尾静脉注射对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe:500 μ g)后不同时间点小鼠肿瘤的T2MRI成像图片Ca)和相应的MRI信号值变化(b)；
图15是尾静脉注射对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe:500 μ g)后24小时，Fe元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾、和肿瘤)的组织分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将1.25g FeCl2.4H20倒入烧杯中，加入7.75mL的超纯水，温和搅拌下，加入6.25mLNH3.H2O,将上述混合液在空气气氛下连续搅拌10分钟，使二价铁充分被氧化，接着将混合溶液转移到高压反应釜中。将0.5g PEI超声溶解于5mL水溶液中，用移液枪将其转入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀，于134°C反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色沉淀Fe3O4-PEI磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复超纯水洗涤五次，以除去杂质，然后重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包覆的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4-PEI )。取3mL纳米颗粒溶液，真空冷冻干燥用于X-射线衍射检测。XRD结果显示了 Fe3O4-PEI纳米颗粒的晶体结构为四氧化三铁(见附图1)。
实施例2
取17.65mg FA,6.90mg EDC 和 4.14mg NHS 于一反应瓶中，加入 5mL DMSO 使其完全溶解，并搅拌活化3h。取40mg NH2-PEg-COOH溶解于5mL DMSO中。然后将上述活化的溶液(5mL)逐滴加入到NH2-PEg-COOH的DMSO溶液(5mL)中，搅拌反应三天。用截留分子量为1000的透析袋对蒸馏水透析三天(6次，2L/次)，除去副产物和杂质，将产物C00H-PEG-FA冷冻干燥后储存在_20°C备用；
FA、NH2-PEg-COOH和合成的C00H-PEG-FA的核磁氢谱分析如图2所示，C00H-PEG-FA在6-9ppm出现的谱峰说明FA已经成功连接到PEG上。通过积分峰面积计算可知，每一个PEG上连接了 0.7个FA。
实施例3
取实施例1制备的Fe3O4-PEI水溶液6.24mL(30mg)用DMSO洗三次，再将Fe3O4-PEI重新分散于6mL DMSO中，然后将溶解在2mL DMSO中的FI (0.84mg)溶液逐滴加入到上述6mL Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，搅拌反应一天后，磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复纯水洗涤`3次，以除去杂质，然后重新分散于IOmL DMSO中，即得到产物 Fe3O4-PE1-F10 分别取 25 μ L Fe3O4-PEI (实施例 1)、FI 和 Fe3O4-PE1-FI (实施例 3)的DMSO溶液于2mL离心管中，再向其中加700 μ L超纯水，超声均匀，测紫外吸收(见附图3)。紫外可见光谱测试结果表明，Fe3O4-PEI在400到800nm处没有明显的紫外吸收峰，而Fe3O4-PE1-FI在510nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到Fe3O4-PEI纳米颗粒表面。
实施例4
取12.39mg 实施例 2 制备的 C00H-PEG_FA、5.18mg EDC 和 3.1lmg NHS 分别溶于2mLDMS0,并将溶液混合后搅拌活化3h。然后将活化的C00H-PEG-FA溶液(6mL)逐滴加入到5mL实施例3制备的Fe3O4-PE1-FI溶液中，搅拌反应三天，再用超纯水磁分离洗涤3次，产物Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA重新分散于5mL超纯水中，并取0.5mL真空冷冻干燥，同时取对照材料Fe304-PE1-F1-mPEG (对比例 1)0.5mL 和 Fe3O4-PE1-FI (实施例 3)0.5mL 真空冷冻干燥，然后对三种材料进行热重分析(如图4所示XTG测试结果表明，修饰前Fe3O4-PE1-FI纳米颗粒的失重量为8.97%(图4a)，按PEI表面氨基与PEG摩尔比例5:1修饰后，Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA和对照材料Fe3O4-PE1-FIiiPEG的失重分别是13.23% (图4b)和14.16% (图4c);经过计算，C00H-PEG-FA和mPEG-COOH的上载率分别为4.26%和5.19%,由此表明C00H-PEG-FA和mPEG-COOH已成功连接到Fe3O4纳米颗粒的表面。
实施例5
向实施例4制备的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒水溶液(4mL)中加入18 μ L三乙胺(密度为0.726 0.729g/mL,浓度为99.0%)，并搅拌30分钟。然后向上述溶液中逐滴加入12.2μ L乙酸酐(密度为1.08g/mL，浓度为98.5%)(三乙胺、乙酸酐与Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA的表面氨基摩尔比=5:5:1 )，继续搅拌反应24小时。产物用超纯水磁分离洗涤3次，并重新分散到5mL超纯水中，即制得乙酰化的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒。取本发明制备的 Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA (实施例 4)、Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (实施例 5)及对比例 I 中的对照材料 Fe304-PE1-F1-mPEG和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 各 0.lmL，然后用超纯水分别配制成1.5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径(如表I)。电势测定结果表明，由于大量表面氨基的存在，Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA和Fe3O4-PE1-FIiiPEG的表面电势分别达到了 +31.0mV和+31.5mV。经过乙酰化反应之后，得到的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒表面电势分别降到了 +16.3mV和+16.4mV。结果显示，纳米颗粒的表面氨基已成功乙酰化。但是，乙酰化后纳米颗粒的表面电势未达到中性，这可能是因为表面的部分用来稳定四氧化三铁纳米颗粒的氨基不能进行乙酰化反应。乙酰化前后，纳米颗粒的水动力直径的测试结果同样如表I所示，乙酰化后纳米颗粒的水动力直径较乙酰化前略微变小，并且纳米颗粒的水动力直径能长时间保持几乎不变，从而说明了制备的纳米颗粒具有良好的胶体稳定性。
实施例6
分别取乙酰化后的对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (对比例I)和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (实施例5)纳米颗粒水溶液各5 μ L，然后用超纯水配制成100 μ L的纳米颗粒悬浮液。分别取配制的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒悬浮液各5μ L滴 在铜网表面，并在空气中晾干后用于TEM测试(如图5所示)。TEM结果显示Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的形貌均为球形或准球形。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒的直径分别是15.0nm和15.3nm。
实施例7
将本发明制备的Fe304-pE1-Ac-F1-pEG-FA (实施例5 )纳米颗粒和对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (对比例I)通过ICP-AES测试法测得溶液中Fe元素的浓度，再在EP管中用超纯水配制Fe浓度依次为0.0025,0.005,0.01,0.02和0.04mM的水溶液2mL，通过T2磁共振成像测定材料在不同的Fe浓度下的T2弛豫效应(如图6所示)。弛豫率测试结果表明 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 纳米颗粒的 T2 弛豫时间倒数在 Fe浓度为0.0025-0.04mM范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可知Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (99.64ι Μ )和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG (107.30ι Μ 都具有良好的T2弛豫效应和r2弛豫率。因此，本发明所制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG均可作为MRI分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。
实施例8
为了使制备的纳米颗粒能安全地用于体内生物成像诊断，本实验评价了制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的血液相容性。称取冻干的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(实施例5)和对照材料Fe3O4-PE1-Ac-FI_mPEG(对比例I)各Img,分别分散于PBS中配制成lmg/mL的浓度为母液，然后用PBS依次配制浓度为50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL和400 μ g/mL的纳米颗粒悬浮液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm/min，5min)去上清液，然后将血红细胞用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS稀释10倍。再将Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米材料(50-400 μ g/mL)与红细胞混合静置2小时后，IOOOOrpm离心lmin，拍照并测上清液的紫外吸光光谱。该过程以PBS作为阴性对照，超纯水作为阳性对照。图 7 中显示了 Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG (图 7a)和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (图 7b)在浓度50、100、200、400μ g/mL下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光度值定量评价纳米材料的溶血性。如图7a和7b右上角紫外图谱显示,在浓度达到400 μ g/mL时，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的溶血率都小于5%，说明制备的这些纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MRI成像。
实施例9
以KB细胞为模型细胞评价本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒和对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG对细胞增殖的影响。称取冻干的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(实施例5)和对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (对比例I)各lmg，然后分别分散于无菌PBS中配制成lmg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台用无菌 PBS 配制浓度为 10、25、50、75 和 100 μ g/mL 的无菌 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒悬浮液。KB细胞种植于96孔板后分别与Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纟内米颗粒(浓度为 10、25、50、75 和100 μ g/mL)在37°C下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20 μ L ΜΤΤ，继续在37°C下培养4小时后，弃去培养液，并加入150 μ L DMSO,振荡15分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(如图8)。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS为对照进行比较。与对照组相比，Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA在实验浓度O到100 μ g/mL范围内对KB细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在80%以上。这充分说明合成的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA均具有良好的生物相容性，可以应用到生物体内MRI成像检测。我们通过相差显微镜进一步验证了材料对细胞的毒性。如图9所示，不同浓度的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米材料(10、25、50、75和100 μ g/mL)处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的良好生物相容性。
实施例10
通过流式细胞仪检测不同浓度的Fe304-PE1 -Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA处理后KB细胞对材料的吞噬量(如图10)和细胞的平均荧光强度(如图11)评价叶酸靶向性效果。通过ICP-AES测定实施例9中lmg/mL的无菌Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA PBS 溶液中 Fe 的浓度，然后用无菌PBS分别配制成Fe浓度为0.125,0.25,0.5,0.75、1.0、1.25和1.5mM的两种纳米颗粒悬浮液。KB细胞以2X IO5/孔种植于12孔板，过夜培养后再分别与Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(Fe 浓度为 0.125,0.25,0.5,0.75、1.0、1.25 和1.5mM)在37°C下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS清洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于ImL PBS中。通过流式细胞仪检测细胞对纳米颗粒的吞噬情况和处理后细胞的平均荧光强度。图10中，和对照组(PBS处理细胞)相比，随着Fe浓度的增加，细胞对Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的吞噬量稍微增加，并且在Fe浓度达到1.0mM时，吞噬量几乎不再增加。但是随着Fe浓度的增加，细胞对Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA的吞噬量却一直明显增加。同样在图11中随着Fe浓度的增加，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA处理后细胞的平均荧光强度显著增加，而对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG处理后细胞的平均荧光强度增加不明显。这说明叶酸的修饰赋予了纳米颗粒对表达叶酸受体的KB细胞的特异祀向能力。
实施例11
进一步通过共聚焦显微镜来验证叶酸的靶向性效果，先将盖玻片放置于12孔细胞培养板中并用1640培养基浸泡12h，然后每孔补充1.0mL培养基并接种5X104个KB 细胞，过夜后分别与 PBS、Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(Fe浓度为0.5mM)在37 °C下共培·养4小时，接着用PBS清洗三次，然后依次用2.5%戊二醛(0.5mL)固定15分钟、hochest33343 (0.8mL)染色30分钟，最后将盖玻片放置于载玻片上，通过油镜观察细胞的形貌。如图12所示，经过PBS处理的细胞内没有荧光，对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG处理的细胞内显示出比较微弱的荧光信号，而Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA处理的细胞内显示出很强的荧光信号，这进一步说明叶酸修饰的纳米颗粒对表达叶酸受体的KB细胞有靶向特异性，从而为该材料成功高效地应用到体内MRI成像提供了可靠的依据。
实施例12
体内成像实验之前，我们评价了纳米颗粒的细胞MRI成像效果，通过ICP-AES测定实施例 9 中 lmg/mL 的无菌 Fe3O4-PE1-Ac-FIiiPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA PBS溶液中Fe的浓度，然后用无菌PBS分别配制成Fe浓度为0.1、0.2、0.4和0.8mM的两种纳米颗粒悬浮液。KB细胞以3X IO6/孔种植于6孔板，培养过夜后，分别与PBS、Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(Fe 浓度为 0.1,0.2,0.4和0.8mM)在37°C下共培养6小时，在培养结束后细胞用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在ImL PBS (含0.5%琼脂糖)中。用核磁共振成像仪测各细胞样品的T2弛豫效应(如图13)。在图13a中，随着Fe浓度的增加，Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在同样的Fe浓度下，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后的细胞比Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG处理后细胞的MRI信号降低更明显，说明细胞对Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的吞噬量要大大高于Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒。图13b是细胞被不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI成像信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐减少，而且在相同的Fe浓度下，Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后细胞的MRI信号值要明显低于Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MRI成像效果，而且证明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒对肿瘤细胞的特异靶向性。
实施例13
将本发明制备的Fe304-pE1-Ac-F1-pEG-FA (实施例5)和对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (对比例I)的水溶液用PBS离心洗涤3次后重新分散于2mL PBS中，并用ICP-AES测定各溶液中Fe的浓度。然后用无菌PBS配制相同体积且含有相同Fe质量的 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 的 PBS 溶液。KB 细胞接种至Ij裸鼠体内，三周后待肿瘤直径达到1.0-1.2cm时，通过尾静脉注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒PBS溶液来评价肿瘤部位的MRI成像效果(如图14所示)。与注射前的对照组相比较，在注射后30分钟到4小时内，注射0.5mL对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (Fe:500 μ g)的小鼠肿瘤部位稍微变暗，而注射0.5mLFe304-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500 μ g)的小鼠肿瘤明显变暗，展示出叶酸修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。在注射后24小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去(图14a)。图14b是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后30分钟到4小时，注射对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的小鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA的小鼠肿瘤MRI信号值明显降低。在注射后24小时，两个实验组的小鼠肿瘤部位MRI信号值均有所增加，这与图14a的结果一致。这些结果说明该制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内肿瘤靶向MRI成像诊断的造影剂。
实施例14
以种有肿瘤的裸鼠(实施例13)为模型动物检测对照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒尾静脉注射24小时后铁的组织分布(图15 )。向裸鼠尾静脉注射0.5mL实施例13配制的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500 μ g) PBS溶液24小时后，处死小鼠，取出各个器官并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水(盐酸/硝酸；体积比3:1)浸泡2天，用ICP-AES测定各个组织 器官中铁的浓度。从图15中可看出在注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500μ g)纳米颗粒后，肝、脾和肺中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如:心、肾和肿瘤，铁的聚集较少。但需要指出的是，注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的小鼠肿瘤部位铁的含量明显高于注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG纳米颗粒的情况。这些结果不仅证明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA对肿瘤部位具有很好的靶向性，而且说明该发明制备的纳米颗粒能在小鼠体内正常的代谢清除。
对比例I
将1.25g Fe(II)盐溶解于7.75mL超纯水中，再加入6.25mL NH3.Η20并于空气气氛下搅拌10分钟，然后将混合溶液转移到高压反应釜中。取0.5g PEI溶解于5mL超纯水中，并将该5mL PEI水溶液也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，于134°C反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀磁分离洗涤纯化后，重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包裹的纳米颗粒Fe3O4-PEI,产物储存于4°C备用。产物表征见图1 ;
取6.24mL上述步骤制备的Fe3O4-PEI纳米颗粒(30mg)用DMSO洗涤三次后，重新分散于6mL DMSO中。取0.84mg FI，并将其溶解于2mL DMSO中。然后将DMSO溶解的FI溶液(2mL)逐滴加入到上述6mL Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，搅拌反应一天后，产物Fe3O4-PE1-FI用超纯水磁分离洗涤3次，然后分散到IOmL DMSO中，并储存在4°C备用。产物表征见图3 ；
取10.80mg mPEG_C00H、5.18mg EDC 和 3.1lmg NHS 分别溶于 2mL DMSO,并将溶液混合后搅拌活化3h。然后将活化的mPEG-COOH溶液(6mL)逐滴加入到5mL上述制备的Fe3O4-PE1-FI溶液(5mL)中，搅拌反应三天，再用超纯水磁分离洗涤3次，产物Fe304-PE1-F1-mPEG重新分散于5mL超纯水中后储存于4°C备用。产物表征见图4和表I ;向上述步骤制备的Fe304-PE1-F1-mPEG纳米颗粒水溶液(4mL)中加入18yL三乙胺，并搅拌30分钟。然后向上述溶液中逐滴加入12.2μ L乙酸酐，继续搅拌反应24小时。产物用超纯水磁分离洗涤3次，并重新分散到5mL超纯水中，即制得对照材料乙酰化的Fe304-PE1-AC-F1-mPEG纳米颗粒，取2mL真空冷冻干燥后储存于_20°C，余下3mL储存于4°C备用。产物表征见图5-15和表I。
表1.Fe304-PE1-F1-mPEG，Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG, Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA 和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的电势和水动力直径.
权利要求
1.一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，包括: (1)将亚铁盐溶解于超纯水中，加入NH3.H2O并于空气气氛下搅拌，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并将0.lg/mL的超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，于130 140°C反应2 4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀分离洗涤纯化后，即得PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4-PEI ； (2)将FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2 4h，然后逐滴加入到NH2-PEG-C00H的DMSO溶液中，搅拌反应2 4天，透析，然后真空冷冻干燥，即得C00H-PEG-FA ； (3)将步骤(I)中制备的Fe3O4-PEI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，再将DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，搅拌反应I 3天后，产物Fe3O4-PE1-FI分离洗涤，然后分散到DMSO中； (4)步骤(2)中制备的C00H-PEG-FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，搅拌活化2 4h;然后将活化的C00H-PEG-FA溶液加入到步骤(3)制备的Fe3O4-PE1-FI溶液中，搅拌反应2 4天，再分离洗涤，并分散于超纯水中，得到Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒水溶液； (5)向步骤(4)制备的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20 40分钟；然后向上述溶液中加入乙酸酐，继续搅拌反应20 30小时；分离洗涤并分散于超纯水中，即得。
2.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的亚铁盐为FeCl2.4Η20，亚铁盐、超纯水、NH3 -H2O的配比为I 1.5g: 7.5 8.0mL: 6.0 6.5mL,亚铁盐与超支化聚乙烯亚胺PEI质量比为2 3:1。
3.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的NH3.H2O质量百分比浓度为25-28%。
4.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。
5.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中FA、EDC和NHS的摩尔比为1:0.5 1:0.5 1，FA和NH2-PEg-COOH的摩尔比为I 3:1。
6.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中NH2-PEg-COOH的分子量为2000。
7.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中FI与Fe3O4-PEI表面氨基的摩尔比为1:45 55。
8.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的C00H-PEG-FA与EDC、NHS的摩尔比为1:4 6:4 6。
9.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的C00H-PEG-FA与Fe3O4纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:4 6。
10.根据权利要求1所述的一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的三乙胺、乙酸酐与Fe3O4纳米颗粒表面的PEI上伯氨基摩尔比为4 6:4 6:1。
全文摘要
本发明涉及一种基于叶酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的靶向MRI造影剂的制备方法，包括FA连接到NH2-PEG-COOH上形成COOH-PEG-FA；水热法合成PEI包覆的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4-PEI)；Fe3O4-PEI纳米颗粒表面修饰异硫氰酸荧光素(FI)；COOH-PEG-FA连接到Fe3O4纳米颗粒的表面；最后对Fe3O4纳米颗粒表面PEI剩余氨基进行乙酰化修饰以增加其生物相容性，用于MRI成像诊断。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备的Fe3O4磁性纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性和肿瘤靶向性，在体内肿瘤靶向诊断领域具有潜在的应用价值。
文档编号A61K49/12GK103143041SQ20131010539
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者沈明武, 李静超, 蔡红东, 史向阳, 张贵祥, 郑林丰 申请人:东华大学, 上海市第一人民医院