一种植物源杀螨剂的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效、低毒、环保的植物杀虫提取物，其对家兔等动物的痒螨和疥螨均有良好的杀灭作用。紫茎泽兰甲醇提取物的杀螨活性成分为：9-羰基-10,11-去氢泽兰酮（euptox A）。Euptox A药液的制备步骤为：叶粉经甲醇超声提取；乙酸乙酯萃取；进行硅胶柱层析，大孔树脂柱洗脱，再反复硅胶柱层析得到euptox A；用吐温-80助溶剂溶解，制成含euptox A不同浓度的药液。在euptox A为2mg/mL时对兔痒螨和疥螨的都有较强杀螨效果，其LT50分别为1.212、0.687h，在2h内对兔痒螨和疥螨LC50分别为0.902mg/mL、1.068mg/mL。
【专利说明】-种植物源杀職剂的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效、低毒、环保型杀峨的植物提取物，尤其是涉及一种用于杀灭 动物峨虫的植物毒素的制备与应用。
【背景技术】
[0002] 动物峨病是峨虫寄生动物体表而引起的一种动物慢性体外寄生虫病，其病原为巧 峨、痒峨，主要发生于秋末、冬季和初春，通过患病动物与健康动物直接或间接接触传染，广 泛传播于牛、羊、马、犬、免、鸡等动物。还可感染人类，在牧区、农牧区和规模化养殖场感染 率和发病率均较高。动物发生该病主要表现为食欲降低或废绝、消瘦、被毛脱落等，影响动 物的生产性能和经济价值，严重制约畜牧业健康发展和经济效益。目前，用于治疗动物峨病 的药物主要为化学合成和抗生素类药物，如伊维菌素、阿维菌素、林丹乳油和峨净等，此类 药物在有效防治动物峨病的同时，由于药物残留和草地污染，引起了公共卫生、食品安全和 生态环境等问题。从天然产物中寻找、筛选防治动物峨病的药物已成为人们广泛关注的研 究热点。
【发明内容】
[0003] 本发明为了对外来入侵植物紫茎泽兰的开发利用提供新的思路，从紫茎泽兰叶片 中分离纯化一种单体化合物化Ptox A，其对家兔等动物的痒峨和巧峨均具有良好杀灭作 用，且效果优于临床常用杀峨药物伊维菌素，有潜力作为一种高效、低毒、环保型的杀峨新 药。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 一种用于杀峨的植物提取物，其特殊之处在于：所述植物提取物为紫茎泽兰甲醇提取 物。
[0005] 上述紫茎泽兰甲醇提取物为己酸己醋部位提取物。
[0006] 上述紫茎泽兰提取物的杀峨活性成分为化Ptox A。
[0007] Euptox A的制备；紫茎泽兰叶粉100 g，甲醇超声提取2-3次，每次60 min,合并滤 液；滤液在4(TC下减压蒸干得到浸膏；用20%的甲醇溶解浸膏，并用等量己酸己醋萃取2-3 次，合并己酸己醋部分在4(TC下减压蒸干得到浸膏；娃胶拌样，干法上样，进行娃胶柱层 析，先用二氯甲焼洗脱除去低极性杂质，继续用二氯甲焼；己酸己醋（98:2, v/v)洗脱，收集 洗脱液，减压蒸干，浸膏溶于甲醇；水；H氯甲焼（85 ;10 ;5，v/v/v)溶剂中，上XAD-2大孔树 脂柱洗脱，W除去色素等杂质，减压除去洗脱剂，残渣样品进行反复娃胶柱层析得到化Ptox A纯品。
[0008] Euptox A的杀峨活性试验；用吐温-80等组溶剂溶解，制成含化Ptox A为不同浓 度的药液。将剂量0. 5、1、2、3和4 mg/mL的Euptox A药液加入24孔板中，用滤纸吸取多 余液体。用挑虫针将10只峨虫依次挑人各孔中，W吐温-80为空白对照，伊维菌素为阳性 对照。每一浓度设5个重复。然后将24孔板放入测试环境（25C，相对湿度75%)培养，每 隔Ih用显微镜观察一次，观察4 h，记录每个时段的死亡情况。当虫体肢节长时间不动或用 针刺激无反应时判定为死亡。
[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下： 1、高效性：我们试验中发现3、4 mg/mL浓度的化Ptox A在4 h内体外可杀死全部供 试巧峨，同样在4 h内4 mg/mL浓度的化Ptox A可杀死全部供试痒峨。Euptox A的该种高 效性，比现有伊维菌素等大环内酷类抗生素好，目前已有系统研究和临床普遍使用的其它 中药及其相关制剂，很少有能达到该种效果的。
[0010] 2、低毒环保；Euptox A来源于外来入侵植物，家畜对该植物有绝食性，相对还是较 安全，且多数天然植物成分在自然环境中可自行降解，不致于在动物产品中长期残留或通 过食物链富集。Euptox A作为从该些植物中得到的活性天然成分，同样具有低毒、安全和环 保的特点。
[0011] 3、变废为宝；紫茎泽兰已成为我国外来入侵物种之首，但目前对紫茎泽兰还没有 有效的防治措施，且紫茎泽兰生物储量巨大，所需成本昂贵。本发明从紫茎泽兰叶片中分 离得到一种具有高效杀峨活性的成分化Ptox A，为紫茎泽兰的开发利用提供新的思路和基 础，可达到变废为宝的目的。
[0012] Euptox A在各种动物的多种峨病的治疗方面展现出广阔的开发利用前景。
【具体实施方式】 [001引 1材料与方法 1.1试验药品及材料 1.1.1供试药材 紫茎泽兰，2012年7月采集于四川省凉山州，叶子阴干，粉碎备用。
[0014] 1.1. 2供试峨虫 采自自然感染的家兔耳廓内。病兔耳廓内多长满血麻，靠近耳道内侧湿润，呈团块状， 外部相对稍干燥，呈卷纸状，患兔瘦痒不安，用小綴子剥取耳道和脚趾内痴皮，置玻璃平皿 内，平皿边缘涂少量峨虫驱避剂一硫软膏，加热37C左右，用挑虫针挑取活力强的峨虫供试 验用。根据峨虫形态，鉴定为兔痒峨如'ei)。
[0015] 1. 1. 3主要仪器与试剂 旋转蒸发仪；循环水式真空粟；真空干燥箱；倒置显微镜；高效液相色谱仪；甲醇；己 酸己醋；二氯甲焼；H氯甲焼；柱层析娃胶；薄层板；吐温-80 ;化Ptox A (标准品）。
[0016] 1. 1. 4 9-撰基-10,11-去氨泽兰丽药液的制备 紫茎泽兰叶粉100 g甲醇超声提取2-3次，每次60 min,合并滤液；滤液在4(TC下减压 蒸干得到浸膏；用20%的甲醇溶解浸膏，并用等量己酸己醋萃取2-3次，合并己酸己醋部分 在4(TC下减压蒸干得到浸膏；娃胶拌样，干法上样，进行娃胶柱层析，先用二氯甲焼洗脱除 去低极性杂质，继续用二氯甲焼；己酸己醋（98 ;2，v/v)洗脱，不同组分用展开剂(石油離： 丙丽为12:1)展开，在286 nm紫外光下显亮蓝色英光，收集与标准品一致Rf的洗脱液，减压 蒸干，浸膏溶于甲醇：水：H氯甲焼（85 ;10 ;5，v/v/v)溶剂中，上XAD-2大孔树脂柱洗脱，W 除去色素等杂质，减压除去洗脱剂，残渣样品进行反复娃胶柱层析得到化Ptox A纯品；得 到的纯品用高效液相色谱法进一步鉴定和定量；用吐温-80等组溶剂溶解，制成含化Ptox A为不同浓度的药液。
[0017] 1.1.5体外杀峨试验 将剂量0. 5、1、2、3和4 mg/mL的化Ptox A药液加入24孔板中，用滤纸吸取多余液体。 用挑虫针将10只峨虫依次挑人各孔中，W吐温-80为空白对照，伊维菌素为阳性对照。每 一浓度设5个重复。然后将24孔板放入测试环境（25C，相对湿度75%)培养，每隔比用 显微镜观察一次，观察化，记录每个时段的死亡情况。当虫体肢节长时间不动或用针刺激无 反应时判定为死亡。
[0018] 1.1.6数据分析 采用互补重对数模型（简称CLL模型）分析拟合时间一剂量效应关系，求出模型参数 及半数致死时间（LTw)和半数致死浓度（LCg。)，所有数据表示为平均值±SD，用SPSS20.0 软件进行统计分析。
[0019] 2 结果 2. 1毒素提取 通过TLC和HPLC共同鉴定所提取物质为化Ptox A，TLC检测在286皿紫外光下显亮 蓝色英光，Rf值为0.62与标准品一致，HPLC下检测出峰时间相同与标准品一致，计算其纯 度为96% W上。
[0020] 2. 2体外杀峨试验 结果显示，Euptox A 5个不同浓度对痒峨和巧峨均有较好的杀灭作用，杀灭效果与毒 素浓度大小成正相关，其中4mg/mL浓度在试验化内杀死全部痒峨，在3、4 mg/mL浓度时化 内杀死全部巧峨，结果详见表1和表2。
[0021] 表1不同浓度的化Ptox A体外对痒峨的杀灭活性。
【权利要求】
1. 杀螨活性成分：本发明植物提取物为紫茎泽兰甲醇提取物、紫茎泽兰乙酸乙酯部位 提取物，紫茎泽兰甲醇提取物的杀螨活性成分为9-羰基-10, 11-去氢泽兰酮。
2. 药液的制备步骤为：紫茎泽兰叶粉100 g，甲醇超声提取2-3次，每次60 min，合并滤 液；滤液在40°C下减压蒸干得到浸膏；用20%的甲醇溶解浸膏，并用等量乙酸乙酯萃取2-3 次，合并乙酸乙酯部分在40°C下减压蒸干得到浸膏；硅胶拌样，干法上样，进行硅胶柱层 析，先用二氯甲烷洗脱除去低极性杂质，继续用二氯甲烷：乙酸乙酯（98 :2，v/v)洗脱，收集 洗脱液，减压蒸干，浸膏溶于甲醇：水：三氯甲烷（85 :10 :5，v/v/v)溶剂中，上XAD-2大孔树 脂柱洗脱，以除去色素等杂质，减压除去洗脱剂，残渣样品进行反复硅胶柱层析得到Euptox A纯品；用吐温-80等组溶剂溶解，制成含Euptox A不同浓度的药。
3. 体外杀螨效果：在Euptox A为2mg/mL时对兔痒螨和挤螨的都有较强杀螨效果，其 LT5。分别为1. 212、0. 687 h，在2 h内对兔痒螨和疥螨LC5Q分别为0? 902 mg/mL、L 068 mg/ mL〇
【文档编号】A61K31/122GK104341285SQ201310320566
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月29日 优先权日:2013年7月29日
【发明者】胡延春, 廖飞, 何洁, 谭辉, 武雷, 罗彪, 罗丽娟 申请人:四川农业大学