预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属萃取物及其用途
【专利摘要】本发明关于预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属萃取物及其用途，借由一种特定的萃取方法，使其萃取物达到有效的预防和治疗肠道发炎，其萃取物包含绿原酸和阿魏酸作为预防和治疗肠道发炎的成分。
【专利说明】预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属萃取物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明关于一种蟛蜞菊属的植物萃取物在预防和治疗肠道发炎上的运用和产品化。
【背景技术】
[0002]发炎性肠道疾病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一种肠胃道慢性发炎病症，影响范围遍及全球数百万人口。流行病学和病理学上的研究证据显示发炎性肠道疾病发病的起因是经由一种复杂的环境诱因、家族性和遗传性的因子、免疫调节的缺陷以及微生物接触的交互作用，造成不当地持续活化黏膜免疫系统。
[0003]近年来，从草药衍生出的天然健康产品已经发展成常见疾病的另类或辅助疗法。新近的调查报告指出，在发炎性肠道疾病患者之中，最常使用的另类或辅助疗法是草药疗法。膨蜞菊(Wedelia chinensis)是在亚洲国家广泛地被使用的一种重要草药,为草药茶中的一个重要组成成分。在台湾和东南亚，蟛蜞菊是被认为有疗效例如去咳、解热、排毒、消炎以及保护肝脏的效果。蟛蜞菊中的成分近来被报导有缓和雄性素受体的活性以及摄护腺癌的生长。
[0004]由于目前用以治疗发炎性肠道疾病的药物无法根除此疾病的复发且具有副作用，因此对于能有效治疗发炎性肠道疾病的疗法的研发仍有其需求。利用传统药草当作辅助疗法以缓解此种的疾病，已被认为是一种重要的方式。然而，缺乏科学证据以证明传统药草的疗效及安全性，和缺乏萃取方法和品种(species)对药草的影响的调查等问题，仍是在传统药草的研发和应用时需面对的。
[0005]目前已有从传统 药用植物衍生出单一化合物/植物化学物质，例如，Curcuma1nga 的姜黄素[I]、Polygonum tinctorium[2]的色胺酮(tryptanthrin)、Scutelleriabaicalensis 的黄岑素[3], Catalpa Ovata 的梓苷(Catalposide) [4] > CopaiferaOfficinalis的β -石竹烯(β-caryophyllene) [5]以及其他已测试其可能为抗结肠炎的治疗药物。
[0006]然而，在传统药用植物特定组织中，萃取、制备和分离的方法会容易影响药用或膳食的植物材料的最终萃取物样品的药物或营养的特性[6]。Capecka[7]等人研究已发现，在制备唇形科种植物中，新鲜与干燥方式备制的抗氧化活性有显著的差异。
【发明内容】
[0007]在一方面，本发明是关于一种应用蟛蜞菊萃取物方法于预防和治疗肠道发炎疾病上的运用及产品化。对于具有急性肠道炎的小鼠展现出良好的抗肠炎作用，其显示蟛蜞菊具有舒缓或治疗IBD病患因肠道发炎所引起的临床症状和组织病理变化的潜力。
[0008]在另一方面，本发明揭露一种萃取蟛蜞菊萃取物的方法。本发明利用不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括新鲜或阴干的蟛蜞菊所制得的热水萃取物及50%和100%酒精的萃取物，皆能舒缓葡聚醣硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)所诱发的肠道发炎。[0009]前述或其他的实施例将可由以下对较佳实施例的描述及附图更为清楚，然而其改变或修饰并未脱离本发明揭露内容的精神、范围及概念。
[0010]相关附图可说明一个或多个本发明实施例，同时配合文字说明，可用于解释本发明的概念。附图中相同的组件符号用于标示一实施例中的相同或相似组件。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1显示给予具有DSS导入急性结肠炎的鼠WCHF疗法的影响。结肠炎的导入是经由含有2%DSS的饮水为期九天。小鼠同时间地经口服给予载体(1%吐温80)或WCHF(50mg/kg鼠体重)为期7天；之后为期九天的DSS的治疗。图1A显示相对体重的改变。图1B显示疾病活性的指针。图1C显示结肠的长度。图1D显示组织切片。图1E显示组织学评分。图1F显示骨髓过氧化酵素活性。数据以均值土SD (n=5-6)表示。经H&E染色的结肠中段组织切片以40倍和100倍放大。*P < 0.05，#P < 0.005，< 0.001，有显著的不同与对照组相比较。*P < 0.05，林P < 0.005，_P < 0.001，有显著的不同与DSS组相比较。
[0012]图2显示鼠具有DSS导入急性结肠炎对于以不同方法萃取出的蟛蜞菊的萃取物的效果。萃取的方法是依照本发明的材料和方法所述。小鼠同时间地经口服给予载体(1%吐温80)或不同的蟛蜞菊萃取物(50mg/kg鼠体重)为期7天；之后为期九天的DSS的治疗。第2A图显示相对体重的改变。第2B图显示结肠的长度。第2C图显示疾病活性的指针。数据以均值土SD (n=5-6)表示。WCHF:经热水新鲜蟛蜞菊萃取物；WCHD:经热水干燥蟛蜞菊萃取物；WC50和WC100:100% (WC100)和50% (WC50)的乙醇新鲜蟛蜞菊萃取物。*P < 0.05，林P < 0.005，_P < 0.001，有显著的不同与DSS组相比较。
[0013]图3显示经热水新鲜蟛蜞菊萃取物和经热水干燥蟛蜞菊萃取物的高效液相色谱法的特性以及候选的指针化学剂。WCHF，WCDF和单一纯化学剂被侦测到在不同的波长下(蓝色=208nm,红色=254nm,绿色=300nm,粉红色=350nm)。箭头指示在WCHF的特性中所显示的特定的高峰，其高峰减低或是并未发现在WCHD的特性中。
`[0014]图4显示试验鼠的重要器官在WCHF的影响下其组织的亚毒性研究。
[0015]图5显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于具有DDS导入急性结肠炎的鼠，丧失其体重的效果。(A)鼠的体重在DSS治疗前。给予鼠口服热水萃取物的A:WC、B:WT、C:WB、D:WP和E:WPR (50mg/kg)、磺胺塞拉金(sulfasalazine, 50mg/kg,正对照组)或载体(无菌水、对照组和DSS组)。(B)鼠的体重在DSS治疗后。将含有2%DSS的饮水喂于鼠，为期七天。同时给予磺胺塞拉金和不同种的蟛蜞菊的热水萃取物。WC=蟛蜞菊、WT=南美蟛蜞菊、WB=双花蟛蜞菊、WP=天蓬草舅、WBR=琉球蟛蜞菊、WPR=大天蓬草舅。数据以均值土 S.E.M(η=14)。*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.001 表示。
[0016]图6显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于在DDS导入结肠炎的小鼠的疾病活性指标的影响。将含有2%DSS的饮水喂于小鼠和接受口服的载体(无菌水、对照组和DSS组)，磺胺塞拉金(50mg/kg，正对照组)或热水萃取物A:WC、B:WT, C:WB、D:WP和E:WPR (50mg/kg)。数据以均值土S.E.M (n=14)。*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 表示。
[0017]图7显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于具有DDS导入急性结肠炎的鼠的病理组织和组织学评分。将含有2%DSS的饮水喂于小鼠和接受口服的载体(无菌水、对照组和DSS组)，磺胺塞拉金(50mg/kg，正对照组)或热水萃取物A:WC、B:WT, C:WB、D:WP和E:WPR(50mg/kg)。H&E染色的中段结肠切片放大于40倍(A)和100倍(B)。(C)组织学评分。数据以均值土S.E.M (η=14)。*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，_Ρ〈0.001 表示。
【具体实施方式】
[0018]定义
[0019]说明书中所使用的用语在该领域中具有其一般定义，包括在本发明的说明内容，以及特定文字内容部份所使用的用语。以下将讨论本发明所使用的特定用语，亦或说明书的其他部分，以作为实施者在实施本发明的导引。为了便利起见，某些词汇将特别标记，例如使用斜体及/或引号标示。这些标记的使用，将不影响该用语的范围或定义；该用语的范围或定义在文中仍然是相同的，无论其是否有标记。相同的事物可用一种以上的方式描述。因此，在此将使用超过一种的其他用语及同义字，该些用语并无其他特殊含义，无论该些用语是否有特别解释或阐述。在本文中使用了一些同义字，列举一或多种同义字并不代表排除了其他未提及或列举的同义字。在实施例或说明书中所使用的用语仅为用以说明，并非限定其本发明或实施例的范围或定义。同样地，本发明并非受限于说明书中的实施例。
[0020]除非另外定义，本文中所使用的技术上或科学上的用语，皆为该领域具有通常知识者所理解在本发明所涉及的一般定义。
[0021]在一方面，本发明是关于蟛蜞菊抗肠炎功效的可能性。本发明对于具有急性肠道炎的小鼠展现出良好的抗肠炎作用，其显示蟛蜞菊具有舒缓或治疗IBD病患因肠道发炎所引起的临床症状和组织病理变化的潜力。
[0022]在另一方面，本发明揭露一种萃取蟛蜞菊萃取物的方法。本发明利用不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括新鲜或阴干的蟛蜞菊所制得的热水萃取物及50%和100%酒精的萃取物，皆能舒缓葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)所诱发的肠道发炎，其中以新鲜的制备的热水萃取物效果最佳。另外，本发明进一步利用高效液相层析仪分析各种膨蜞菊属(Wedeli·a genus)植物的其他种(species)的鲜品水萃物的代谢物图谱。其结果发现，琉球膨蜞菊(W.biflora var.ryukyuensis)、膨蜞菊(Wedelia chinensis)及南美膨蜞菊(W.trilobata)的高效液相层析仪分析的图谱与其他三者(双花膨蜞菊(W.biflora)、天蓬草舅(W.prostrata)及大天蓬草舅(W.prostrata var.robusta.)有显著的不同；各种的蟛蜞菊亦有独特的波峰可供辨识。本研究也发现数种单一植化物(phytochemicals),如绿原酸(chlorogenic 8(^(1)及阿魏酸(€61'111;^ acid)可能存在于膨蜞菊属植物中，可做为膨蜞菊属植物的鲜品水萃物的指标成分(index compounds),当作商业应用上的质量控管依据。
[0023]在本发明的一实施例中，一种预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属(Wedelia)萃取物，其由蟛蜞菊属植物以水或醇类萃取而得。
[0024]在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该蟛蜞菊属植物选自于琉球膨蜞菊(W.biflora var.ryukyuensis)> 膨蜞菊(Wedelia chinensis)、南美膨蜞菊(W.trilobata)、双花膨蜞菊(W.biflora)、天蓬草舅(W.prostrata)、大天蓬草舅(ff.prostrata var.robusta.)及其任一组合所组成的群组
[0025]在本发明的另一实施例中，其中该蟛蜞菊属植物为新鲜或干燥的植物。
[0026]在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该水为滚烫热水。[0027]在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该醇类为乙醇。
[0028]在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其进一步包含绿原酸(chlorogenic acid)、阿魏酸(ferulic acid)或其混合物。
[0029]在本发明的另一实施例中，一种用于预防或治疗肠道发炎疾病的医药组成物，包括有效剂量的如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物，以及药学上可接受的载体。
[0030]在本发明的另一实施例中，所述的医药组成物，其中该肠道发炎疾病为结肠炎。
[0031]在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物用于制备预防或治疗肠道发炎疾病的药物的用途。
[0032]在本发明的另一实施例中，所述的用途，其中该蟛蜞菊属萃取物具有抗发炎功效以达到预防或治疗肠道发炎疾病的效果。[0033]实施例
[0034]以下将提供本发明的实施例，包括仪器、装置及方法，以及依据该些实施例所得的结果。在实施例中使用的名称及副名称是为了方便阅读，并非用以限制本发明的保护范围。进一步地，在此所揭露的原理，只要发明能够依据说明书所载据以实施，都不应限制本发明的保护范围。
[0035]材料及方法
[0036]蟛蜞菊萃取物的准备
[0037]依先前文献所记载及自行的研究，实验用的植物材料需用肉眼于外观、构造、植物化学和基因图表的特征上作确认。蟛蜞菊购自台北市有声誉的中医药草店或由种植者取得。干燥的蟛蜞菊是将新鲜干净的蟛蜞菊置放于阴凉处两个星期干燥而成。关于经由热水提炼的新鲜(亦称鲜品)或干燥蟛蜞菊萃取物，实验植物材料需称重然后加入适当的滚水(每一百公克的新鲜或干燥蟛蜞菊须一公升的水)煎煮，须煎煮至滚水剩余原来的四分之一。然后使用吸取泵将滚水的萃取物经由滤纸过滤以及使用旋转蒸发器将萃取物浓缩。乙醇提炼的萃取物是将整个新鲜蟛蜞菊浸泡于100%或509ffit0H (WC100或WC50)两星期，之后其萃取物经由上述的方法过滤以及浓缩。全部的萃取物在使用前须经冷冻干燥以及储藏在4°C中。
[0038]小鼠
[0039]七到八个月大的C57BL/6以及ICR雌小鼠是从National Laboratory AnimalCenter (台湾台北)购买的。小鼠安置固定的温度和湿度下，维持以12h/12h/日/夜的循环。小鼠给予食物和水持续至小鼠达到实验所需的理想体重。其步骤是依照中研院的实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)的标准流程进行。
[0040]导入急性结肠炎
[0041]待小鼠适应环境之后，体重达到标准的雌小鼠(20-25公克)随机分置对照、结肠炎-对照和治疗等组。全部的小鼠给予正常的饮水从第-7天到第O天。为了导入急性结肠炎，除了对照组之外，其余的小鼠给予含有2% (w/v)葡聚醣硫酸盐(DSS，分子量:36000-50000Da,MP Biochenicals，Solon，Ohio，USA)的饮水从第 O 天到第 8-9 天。DSS溶液每两天更换一次，DSS的饮用量以均值(mean)纪录。在整个实验的期间,对照组和DSS组的小鼠经由口服给予其对照试验萃取物的载体(vehicle) (1%吐温80, Sigma-Aldrich,St.Louis, MO, USA)。治疗组给予以不同方式提炼的蟛蜞菊萃取物，将萃取物溶解于载体，经由管喂(oral gavage)、口服的方式,其剂量为50mg/kg。为了评估结肠炎的程度,每天对小鼠的体重、排便状况以及粪便中的血液含量进行观察；结肠炎的疾病活动指数(diseaseactivity index)是根据Cooper[8]等人的改良准则所计算的。在每个实验结束之后，将全部的试验小鼠测量体重并牺牲。小鼠的大肠被切除后，测量结肠长度，移除盲肠之后，洗浸于0.9%的生理食盐水，最后浸泡置10%中性福尔马林中。
[0042]结肠炎的组织病理学的评估
[0043]结肠组织检验的中段结肠的组织评分是根据Cooper等人所描述的评分系统。将已浸泡于福尔马林中的结肠分成三等段(equal segments)分别是前、中和后段，使用石蜡包埋，切片(2um)然后染色于苏木色素和伊红。DSS导入的结肠炎的损伤以肠道腺窝的丧失、肠道腺窝的再生、黏膜下层的水肿、发炎以及出血(纤维组织母细胞的渗透)来评分。根据Shackleford[9]等人所描述的方法(参见表一)，其损害程度是以依照前述每项严重度I到5分来进行评分，最高总分为25分。
[0044]表一在亚急性毒性试验中分析WCHF对于试验鼠的血液参数(A)和血液生化(B)的影响
[0045]⑷血液参数
[0046]
【权利要求】
1.一种预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属(Wedelia)萃取物，其由蟛蜞菊属植物以水或醇类萃取而得。
2.如权利要求1所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该蟛蜞菊属植物选自于琉球蟛蜞菊(W.biflora var.ryukyuensis)> 膨蜞菊(Wedelia chinensis)、南美膨蜞菊(W.trilobata)、双花膨蜞菊(W.biflora)、天蓬草舅(W.prostrata)、大天蓬草舅(W.prostrata var.robusta.)及其任一组合所组成的群组。
3.如权利要求1或2项所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该蟛蜞菊属植物为新鲜或干燥的植物。
4.如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该水为滚烫热水。
5.如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物,其中该醇类为乙醇。
6.如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物，其进一步包含绿原酸、阿魏酸或其混合物。
7.一种用于预防或治疗肠道发炎疾病的医药组成物，包括有效剂量的如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物，以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7项所述的医药组成物，其中该肠道发炎疾病为结肠炎。
9.一种将如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物用于制备预防或治疗肠道发炎疾病的药物的用途。
10.如权利要求7项所 述的用途，其中该蟛蜞菊属萃取物具有抗发炎功效以达到预防或治疗肠道发炎疾病的效果。
【文档编号】A61K36/28GK103565872SQ201310320940
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年7月26日 优先权日:2012年7月27日
【发明者】温致群, 萧培文, 黄文经, 林淑惠, 黄郁婷, 林文晴, 杨宁荪 申请人:中央研究院, 万宝禄生物科技股份有限公司