脱水穿心莲内酯的新用途
【专利摘要】本发明提供了脱水穿心莲内酯在制备用于抑制与ANO1离子通道蛋白活性相关的肿瘤细胞所引发的疾病的药物中的用途，所述脱水穿心莲内酯可以选择性抑制肿瘤细胞上的ANO1离子通道蛋白活性，从而阻断肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，将其应用于制备肿瘤抑制药物，必将为肿瘤治疗提供新的思路。
【专利说明】脱水穿心莲内酯的新用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种天然小分子化合物的新用途，尤其是脱水穿心莲内酯的新用途。【背景技术】
[0002]大肠癌(Colorectal cancer)是严重威胁人类生存的消化系统恶性肿瘤之一。近年来，由于我国人民生活方式、饮食结构、环境等因素的改变，大肠癌的发病率及死亡率呈逐年上升趋势，在恶性肿瘤发病率中排第四位，在发达国家发病率居恶性肿瘤第二位。在临床上，大肠癌侵袭和/或转移的发生是导致患者死亡的重要原因，根据WHO的统计，被诊断为大肠癌早期阶段的患者其五年生存率为百分之九十，但目前因缺乏有效的早期诊断标准及抗肿瘤、抗转移的治疗靶点，导致早期检出率低，确诊时60%的病例己属中晚期，肿瘤已经发生了局部或远处转移，失去了最佳的治疗时机，此时手术的根治性差，生存率低，术后五年生存率不足30%，因此确定肿瘤的转移潜能及其相关因素对判断预后、指导治疗、提高生活质量具有十分重要的意义。明确肿瘤转移相关基因及蛋白质的作用，筛选和鉴定肿瘤生物学标志物是肿瘤研究的最前沿领域和热点。
[0003]随着肿瘤分子生物学研究的不断深入，越来越多的基因被发现参与了大肠癌的发生过程，目前己明确的主要有ρ53、ρ16、β-catenin、TGF-β等。
[0004]钙激活氯离子通道(ΤΜΕΜ16Α/ΑΝ01)位于人11号染色体长臂I区3带(llql3)的CCND1-EMS1基因座内，编码与C12orf3、Cllorf25及FLJ34272基因产物同源的8个跨膜蛋白。参与了诸如嗅觉、味觉与视觉的产生与传导过程，并对心肌兴奋性、平滑肌收缩、腺体和上皮分泌及受精过程具有重要生理作用。随着氯离子通道研究的深入，发现ANOl表达与许多疾病相关，如高血压，哮喘，腹泻，肺囊性纤维化疾病等。由于离子通道参与细胞的增殖、迁移和凋亡中的作用得到了公认。研究发现，氯离子通道不仅在细胞迁移过程中发挥了重要作用，而且还参与细胞形态 变化过程，并与细胞的侵袭也密切相关。由于ANOl位于11号染色体长臂I区3带，而该区聚集有很多肿瘤相关基因，所以ANOl早就引起肿瘤学家的关注。Katoh M等通过基因扩增的方法，发现ANOl基因在食管癌、膀胱癌、乳腺癌组织中的存在；Robert B.West等通过基因矩阵扫描胃肠间质瘤的基因谱，发现基因ANOl的存在而且具有特异性表达。并因此将其命名为DOGl意为转运阴离子通道1，在头颈部鳞癌中，ANOl的mRNA表达水平比正常组织高17倍左右。
[0005]ANOl在被发现是钙激活氯离子通道前有很多个名称，胃肠道肿瘤间质蛋白I(DOGl) ; 口腔肿瘤过表达2 (0RA0V2);肿瘤扩增和过表达序列2 (TA0S2)。从名称上看，ANOl过表达于某些特定的肿瘤细胞上并与肿瘤相关联。目前ANOl已经是诊断胃肠间质瘤(ICC)和胰腺癌的最敏感指标-生物标记。其家族的另两个成员TMEM16G和TMEM16G被认为与前列腺癌和乳腺癌相关。在某些特定肿瘤的高表达，提示钙激活氯离子通道与肿瘤的发生、凋亡、细胞增殖和迁移相关。因此ANOl成为治疗肿瘤的潜在药物靶点。
[0006]一些证据证明ANOl具有非常重要的生理意义，但是目前人们对其确切的病理和生理意义的认识还很有限。其中最主要的原因是目前还缺乏高亲和力、选择性的ANOl抑制剂作为研究工具。尼氟灭酸(NFA)，9-羧酸蒽(9-AC)，茚基氧乙酸，依他尼酸和他莫西芬等虽能够抑制ANOl通道活性，但需要很高浓度才可以完全抑制剂通道，并且有不理想的副作用。因其缺乏特异性而无法用于ANOl的研究。表明特异性的ANOl离子通道抑制剂对于研究其生理功能以及与其相关的疾病并揭示其分子药理学特性是不可或缺的。
[0007]我国的传统中医药是中华民族几千年灿烂文化的瑰宝，它以“标本兼治”的独特理念和神奇的功效而得到人们广泛的接受。中药中有效成分含量极其丰富，尤其是小分子化合物更加丰富，多种小分子化合物已经被分离、提取、纯化和鉴定，并证明对多种靶点有效。最有说服力的是目前广泛应用于临床的抗疟疾药物青蒿素和抗癌中药小分子紫杉醇。
[0008]现阶段研究发现，爵床科植物穿心莲叶中分离提取出小分子脱水穿心莲内酯具有抗炎解热作用，能抑制炎症时毛细血管通透性的增高和炎性水肿的发展，并能减少炎性渗出量，临床用于呼吸道及肠道感染性疾病的治疗有较好疗效。但对于肿瘤细胞的抑制作用并没有任何相关文献记载。通过对于该脱水穿心莲内酯的深入研究，发现脱水穿心莲内酯对于其他疾病的治疗作用，将具有极大的临床应用价值。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题在于提供脱水穿心莲内酯的新用途。
[0010]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0011]脱水穿心莲内酯在制备用于抑制与ANOl离子通道蛋白活性相关的肿瘤细胞所引发的疾病的药物中的用途。
[0012]优选的，上述脱水穿心莲内酯在制备大肠癌`制药物中的用途。
[0013]优选的，上述脱水穿心莲内酯在制备结肠癌抑制药物中的用途。
[0014]实现上述用途的药物组合物，包含治疗有效量的脱水穿心莲内酯和任选的药学可接受的赋形剂。
[0015]上述药学可接受的赋形剂可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂，特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态，用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂等。
[0016]上述组合物可以制成滴剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射乳剂、注射用无菌粉针等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0017]本发明的有益效果是:
[0018]本发明所述天然小分子化合物脱水穿心莲内酯，以人大肠癌细胞株SW620为研究对象，以分子生物学、电生理学及细胞生物学相关技术为手段，经系统研究发现:(I)天然小分子化合物脱水穿心莲内酯对人大肠癌SW620细胞生长具有抑制作用；(2)人大肠癌细胞株SW620细胞膜上表达钙激活氯离子通道蛋白(AN01/TMEM16A) ；(3)天然小分子化合物脱水穿心莲内酯特异性抑制ANOl离子通道蛋白的活性；(4)AN01离子通道蛋白参与大肠癌SW620细胞的增殖过程；(5)脱水穿心莲内酯抑制ANOl离子通道蛋白诱导的SW620细胞的增殖、迁移和侵袭；(6)脱水穿心莲内酯通过抑制ANOl诱导的MAPK/ERK信号通路的激活而抑制的细胞增殖与迁移。
[0019]可见，脱水穿心莲内酯可以选择性抑制肿瘤细胞上的ANOl离子通道蛋白活性，从而阻断肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，将其应用于制备肿瘤抑制药物，必将为肿瘤治疗提供新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1AN01钙激活氯离子通道蛋白在SW620细胞上的表达与定位；
[0021]图2脱水穿心莲内酯(DHDG)特异性抑制SW620细胞的生长；
[0022]图3脱水穿心莲内酯抑制了 ANOl钙激活氯离子通道蛋白的功能；
[0023]图4脱水穿心莲内酯抑制了 SW620细胞增殖并阻断细胞周期的Gl期；
[0024]图5干扰ANOl钙激活氯离子通道蛋白表达后，抑制了 SW620细胞的增殖；
[0025]图6细胞划痕实验中脱水穿心莲内酯抑制了 SW620细胞的迁移；
[0026]图7Transwell实验中脱水穿心莲内酯抑制了 SW620细胞的的迁移；
[0027]图8Matrigel实验中脱水穿心莲内酯抑制了 SW620细胞的侵袭；
[0028]图9脱水穿心莲内酯通过抑制ANOl诱导的MAPK/ERK信号通路的激活而抑制的细胞增殖与迁移。
【具体实施方式】
[0029]为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
`[0030]其中，待研究化合物脱水穿心莲内酯购自上海同田生物技术股份有限公司，批号:13050531，纯度:> 98%，该脱水穿心莲内酯的化学分子式为C2tlH28O4，分子量332.42，化学结构式如图2A中所示。
[0031]实施例1
[0032]材料与方法
[0033]一、材料
[0034]1.主要试剂
[0035]EDTA (超纯级)、NaOH、NaHC03、Na2HP04、KH2HP04、NaCl、KCl、D_Glucose、丙酮酸钠(BBI)、乙醇、异丙醇、氯仿(北京化工厂)、水饱和酚、DMSO (北京鼎国)、β -巯基乙醇、3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐(MTT)、台盼蓝(Sigma公司)
[0036]谷氨酸胺、膜酶(AMRESC0)、Dulbecco’s Modified Eagle，s Medium-highglucose (DMEM)和F_12Coon’ s (Sigma)、青霉素和链霉素(华北制药)、胎牛血清FBS (GIBCO)、兔抗人ANOl多克隆抗体(Abeam)、Cy3标记的羊抗兔IgG 二抗、DIPA、β-Tubulin、β-actin、琼脂糖、Triton X-100、BSA、尼氟灭酸 NFA (Sigma)、核酸分子量标准品(XHindIII fragments 和 Φ xl74DNA, NaeIII fragments)购于 Promega 公司
[0037]SuperScript II1、Reverse Transcription System 试剂盒、PCR 反应试剂盒、Lipofectamine?2000 (Invitrogen)、PCR 引物合成(上海生工)、DNA marker (北京天根)
[0038]PVDF膜(北京鼎国)、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、SDS、过硫酸铵、TEMED>Protein Molecular Weight Marker、PMSF、_春红、脱脂奶粉、考马斯亮兰 R_250、多聚甲醒、PepstatinA、Leupeptin、Aprotinin (Sigma)、PV-9003Polink_2plus Polymer HRPDetection System For Goat Primary Antibody (北京中衫金桥)[0039]ATP、1noymycin、Calcimycin 和 Carbachol (Sigma)、脱水穿心莲内酯标准品(上海同田生物技术股份有限公司)
[0040]2.主要仪器及数据分析和图像处理软件[0041 ]I) PTC100PCR 仪(加拿大 MJ Reseach 公司)
[0042]2)光学显微镜(日本OLYMPUS公司)
[0043]3)倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)
[0044]4) Hera cel 1150 细胞培养箱(德国 Heraeus 公司)
[0045]5)Heal Force超净工作台(上海力申仪器公司)
[0046]6)Microfuge22R 高速冷冻离心机(美国 Beckman Coulter 公司)
[0047]7)荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)
[0048]8) DYY-1I型多用电泳仪(北京六一仪器厂)
[0049]9)Quantity one凝胶图像分析系统(美国Bio-rad公司)
[0050]10)TM-250电泳系统(大连捷迈科贸有限公司)
[0051]11)电热干燥鼓风箱(天津泰斯特公司)
[0052]12) Adobe photoshop 图形编辑软件、0rigin7.5、Graphpad prism5> imageJ 作图统计分析软件
[0053]13) Fluostar opt ima 酶标仪(德国 BMG 公司)
[0054]14)-80°C超低温冰箱(美国Thermo Forma公司)
[0055]15)恒温水浴箱(德国Edmund Buhler公司)
[0056]16) ND-1000紫外/可见光分光光度计(美国NanoDrop公司)
[0057]17)DYC_Z22A型电泳槽(北京六一仪器厂)
[0058]18)医用微波炉(上海中达医学应用研究所)
[0059]19)膜片钳(德国HEKA公司EPC9)
[0060]20) AG135 电子天平(瑞士 Mettler Toled 公司)
[0061]21)微电极玻璃管电极(产品号B15024F武汉微探科学仪器有限公司)
[0062]22)电极拉制仪(MF_900Narishige)
[0063]23)蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司BQ50-1J)
[0064]24)Epics-XL II FACScan (美国 Beckman Coulte)
[0065]3.主要耗材
[0066]I)细胞培养板(皿)(美国Costar公司)
[0067]2) 24 孔 Transwell (pore-8 μ m)(美国 Costar 公司)
[0068]3) 24 孔 Transwell-coated matrigel (pore-8 μ m)(美国 BD 公司)
[0069]二、实验方法
[0070]1.细胞培养及测试化合物溶液配制
[0071]人大肠癌高转移潜能细胞株SW620和人大肠癌低转移潜能细胞株SW480来自同一亲本、遗传背景一致，购于中国科学院上海细胞库。大鼠甲状腺滤泡上皮细胞株FRT由美国加州大学旧金山医学院Verkman.S.Alan教授惠赠。新鲜的小鼠脾脏细胞来源于纯系C57/BL6小鼠(吉林大学白求恩医学部SPF级实验动物中心)
[0072]1.1.主要液体和化合物配制:[0073](I)PBS (磷酸盐缓冲液)液:精确称取 NaC18.0g, KC10.2g，Na2HPO4.12Η203.49g，KH2PO40.24g，溶于三蒸水中，定容至1000ml，高压，除菌，分装，4°C保存。
[0074](2)细胞消化液(0.25%胰蛋白酶):精确称取胰酶粉末0.25g，加PBS液充分溶解后定容至100ml，0.22 μ m滤器过滤，除菌，分装，_20°C保存。
[0075]( 3 )化合物溶液配制
[0076]贮液配制:脱水穿心莲内酯和NFA分子量分别为332.42和282.22。不同工作浓度的脱水穿心莲内酯和NFA，使用细胞培养液分别将其贮液进行稀释即可。细胞培养液中的DMSO浓度〈0.1%即可避免引起细胞毒性。
[0077]脱水穿心莲内酯20mM:称取脱水穿心莲内酯粉末0.0Olg，溶于150 μ I DMSO中，摇
匀，放4°C保存即可。
[0078]尼氟灭酸(即4)20禮:称取即4粉末0.0018，溶于20(^1 DMSO中，摇匀，放4°C保
存即可。
[0079]1.2.细胞的培养:
[0080]1.2.1细胞复苏
[0081]I)实验前提前将水浴锅加热到37°C，无菌操作台紫外照射20min。
[0082]2)无菌操作台关闭紫外，吹风5min。取一个`无菌的15ml管，向其中9ml加入不含抗生素的DMEM或者F-12Coon’ s基本培养液。
[0083]3)液氮罐中取出细胞，速速放入37°C在水浴锅中快速融化后转入已含有基本培养液离心管中，盖紧封口，1000rpm/min离心5min。
[0084]4)在无菌操作台中用无菌枪头弃去上清液，加入Iml完全培养液(10% FBS, 100U青/链霉素2mM谷氨酰胺)重悬细胞沉淀，将悬液加入已经还有8ml完全培养液的IOcm细胞培养板，37 0C，5%C02孵箱中培养。
[0085]5)培养12到24h后，弃去培养液，加入新鲜的9ml完全培养液(10% FBS, 100U青/链霉素2mM谷氨酰胺)继续培养。
[0086]1.2.2细胞传代
[0087]I)在操作台中吸掉IOcm培养板的培养液，加入无菌8mlPBS，润洗后吸去PBS。
[0088]2)再用PBS洗一次后，加入500 μ I配置好的0.25%胰酶消化，放入细胞培养箱作用 3min 或 lOmin。
[0089]3)加入Iml的完全培养液终止反应，并用枪头吹打数次，使成团的细胞成单个细胞。
[0090]4)取500 μ I细胞悬液转入新IOcm板，加入9ml完全培养液，继续培养。
[0091]1.2.3细胞冻存
[0092]I)选用对数生长期细胞，在操作台中吸掉IOcm培养板的培养液，加入无菌8mlPBS，润洗后吸去PBS。
[0093]2)再用PBS洗一次后，加入500 μ I配置好的0.25%胰酶消化，放入细胞培养箱作用 3min 或 lOmin。
[0094]3)细胞从培养板上消化下来后，加入Iml的完全培养液终止反应，用枪头吹打数次，使成细胞吹成单个细胞。
[0095]4)取500 μ I细胞悬液转入提前加入有500 μ I细胞冻存液(60%基本培养液，20%DMS0, 20%FBS)的无菌冻存管中，充分混合均匀后，先放入4°C 30min，后放入冻存盒中置于-80°C冰箱或液氮中保存。
[0096]2.总RNA的提取及RT-PCR分析
[0097]2.1.1 待 SW620、SW480 及稳定转染 FRT-pcDNA3.1-hANOl-EGFP 细胞长满 IOcm 细胞培养板后弃培养液并加入3ml变性液(表1)中，10分钟后，分装到1.5ml离心管中，600 μ I/管。
[0098]表1变性液成分
[0099]
【权利要求】
1.脱水穿心莲内酯在制备用于抑制与ANOl离子通道蛋白活性相关的肿瘤细胞所引发的疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的脱水穿心莲内酯在制备大肠癌抑制药物中的用途。
3.根据权利要求1所述的脱水穿心莲内酯在制备结肠癌抑制药物中的用途。
4.实现权利要求1-3之一所述用途的药物组合物，其特征在于:包含治疗有效量的脱水穿心莲内酯和任选的药学可接受的赋形剂。
【文档编号】A61K31/365GK103494803SQ201310497255
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】李丽华, 翁志勇, 胡杰华 申请人:李丽华