人参皂甙Rg1在制备抗内毒素作用于Toll样受体4药物上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人参皂甙Rg1在制备抗内毒素作用于Toll样受体4药物上的应用；该人参皂甙Rg1能阻止内毒素结合到哺乳动物体内的Toll样受体4，从而阻断细菌内毒素的毒性作用，缓解LPS引起的急性炎症过程。
【专利说明】人参皂甙RgI在制备抗内毒素作用于Tol I样受体4药物上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及人参皂甙Rgl的用途，特别是用于制备抵抗内毒素作用于Toll样受体4上的药物。
【背景技术】
[0002]细菌内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性菌裂解时释放出来的细胞壁脂多糖成分Iipopolysaccharide(LPS),是导致人和动物脓毒症或感染性休克的主要致病因素[I]。国外流行病学调查显示，每年全球的脓毒症患者超过1800万例，美国约75万例，欧美每年死于此病的人数超过35万，是ICU病房最常见的死因[2，3]。我国目前尚缺乏详细的流行病学资料。据推算，每年至少有300万个病例，因此病而死亡的人数在100万以上[3]。动物感染革兰氏阴性菌也极其普遍，可见于猪、牛、羊、马、鹿、麝、狐、骆驼、水貂、大熊猫等各种动物。虽然不同动物临床症状不尽相同，但都可以表现为内毒素引起的急性炎症反应。例如，奶牛大肠杆菌引起的超急性乳房炎(peracute mastitis)。病牛可出现乳房局部和全身的急性炎性症状，表现为乳房和乳头局部红、肿、热、痛，挤不出牛奶，全身体温升高，精神萎靡，食欲减退或废绝[4，5]。如不及时抢救可引起病牛死亡，或患病乳腺组织受到严重破坏，导致瞎奶头，造成严重的经济损失[4]。
[0003]近年来对细菌内毒素引起炎症反应的病理机制进行了大量研究。目前认为宿主对侵入机体的病原产生过度免疫反应是导致内毒素性全身炎症反应的主要原因[6]。革兰氏阴性细菌死亡时裂解、释放出LPS，血液中的脂多糖结合蛋白LBP和LPS结合，将LPS传递给巨噬细胞表面的⑶14，形 成⑶14-LPS[7]。巨噬细胞膜上的髓样分化蛋白-2 (MD-2)和Toll样受体4 (TLR4)结合形成MD2-TLR4具有模式识别作用[7，8，9]。TLR4识别LPS之后形成TLR4-MD2-LPS复合物，TLR4的立体构象发生改变，其胞内部分的TIR结构域通过同型互作与衔接蛋白MyD88作用启动信号转导，或与非MyD88依赖的衔接蛋白TRAM和TRIF作用激活NF-K B，诱导巨噬细胞合成和分泌IL-1，IL-6，IFN-β和TNF-α等细胞因子，它们进入血液循环到达下丘脑后作用于体温调节中枢，使调定点上移，引起机体发热[10]。这些释放到细胞外的细胞因子还引起粒细胞、巨噬细胞趋化聚集，毛细血管通透性增高，淋巴细胞浸润等炎症反应。LPS持续刺激的另一个后果是Thl类细胞因子(TNF-α，IFN- Y )分泌减少，Th2类细胞因子(IL-4、IL-10)增加，T细胞对特异性抗原的刺激无应答，引起免疫麻痹，免疫系统清除病原的机能丧失[11]。
[0004]目前对细菌内毒素引起的炎症反应的治疗主要采用抗生素控制感染源和糖皮质激素抑制炎症因子的产生[12]。但研究发现抗生素治疗可诱导内毒素血症的产生，其原因是抗生素治疗后引起大量的细菌死亡，释放出LPS，使循环中的LPS增加，加重全身性炎症反应[13];糖皮质激素可抑制机体的免疫系统，不利于细菌感染的清楚。由于细菌内毒素致病极其普遍，世界各大制药公司竞相研发抗内毒素药物。其中一个思路是采用TLR4拮抗剂通过阻断TLR4信号通路抑制LPS引起的炎症反应。Eritoran (E5564)和TAK-242就是这类药物的代表。E5564是Eisai制药公司开发的化合物，结构上类似于内毒素中的类脂A0 E5564在体外和MD-2分子的疏水区结合，竞争性阻止内毒素中类脂A结合到该部位，进而阻断LPS的致炎作用[14，7] ;TAK-242是Takeda制药公司开发的环己烯衍生物，它能选择性地结合在TLR4的胞内区TIR结构域，通过抑制TRAM的磷酸化阻断TLR4信号转导[7]。动物试验表明，E5564和TAK-242可以显著抑制LPS诱导的内毒素血症的发生，并已通过I期和II期临床试验[7]，但由于它们对严重的毒血症患者没有显著治疗效果，未通过III期临床试验[7]。因此，目前临床上尚无针对细菌内毒素的特异性治疗药物。
[0005]人参阜式Rgl,英文名Ginsenoside Rgl,其具有促进海马神经发生、提高神经可塑性、增强学习、记忆力、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力、辅助抗肿瘤、修复性功能等作用，在高端保健、辅助抗肿瘤、防治老年痴呆等神经退行性疾病方面具有广阔的应用前景。
[0006]熊俊等作者于2006年发表的《人参皂甙Rgl对内毒素性肺损伤血管通透性的影响》一文中推测Rgl降低实验性LPS引起的大鼠肺水肿是通过抗氧化作用和维持细胞膜的稳定性；在给药方法上，为采取在注射LPS的同时注射Rgl。
[0007]上文中涉及的参考文献具体如下:
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【发明内容】
`[0022]本发明要解决的技术问题是提供一种人参皂甙Rgl的新用途——人参皂甙Rgl用于制备抗内毒素作用于Toll样受体4的药物。
[0023]为了解决上述技术问题，本发明提供人参皂甙Rgl在制备抗内毒素作用于Toll样受体4药物上的应用。
[0024]作为本发明的人参皂甙Rgl在制备抗内毒素作用于Toll样受体4药物上的应用的改进:人参皂甙Rgl能阻止内毒素结合到哺乳动物体内的Toll样受体4，从而阻断细菌内毒素的毒性作用。
[0025]本发明采用了将人参皂甙Rgl溶解于水，制成水溶液；并实验验证了用该溶液给动物注射后可以抵抗内毒素作用于Toll样受体4上。
[0026]发明人在发明过程中得知:人参皂甙Rgl能阻止内毒素结合到哺乳动物体内的Toll样受体4，从而阻断细菌内毒素的毒性作用，发挥抗LPS的作用；即，从而用于实现抗细菌内毒素；实现缓解细菌内毒素引起的发热、血液中炎症因子升高以及死亡。
[0027]为了证明本发明的上述效果，本发明的实验均在注射LPS之前或者之后注射Rgl，因此更加接近真实情况，即充分证明Rgl能预防或治疗LPS引起的损伤。
[0028]人参皂甙Rgl的实际用法和用量为:将人参皂甙Rgl制成注射剂，用于静脉注射、肌内注射、皮下注射或腹腔注射,每次注射剂量为0.5~5mg/Kg体重，每天注射2~3次。[0029]本发明的优点
[0030]本发明中采用人参皂甙Rgl结合到哺乳动物体内TLR-4受体上，阻断LPS的作用，缓解LPS引起的急性炎症过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0032]图1是人参皂甙Rgl预防LPS对小鼠的致死作用图；
[0033]图2是人参皂甙Rgl对LPS中毒小鼠的治疗作用图；
[0034]图3是人参皂甙Rgl预防LPS对大鼠的致热作用图；
[0035]图4是人参皂甙Rgl预防LPS引起血液白细胞总数升高的作用图；
[0036]图5是人参皂甙Rgl预防LPS引起血液嗜中性白细胞升高的作用图；
[0037]图6是人参皂甙Rgl预防LPS引起血清NO升高的作用图；
[0038]图7是人参皂甙Rgl预防LPS引起血清PGE2升高的作用图；
[0039]图8是人参皂甙Rgl对感染大肠杆菌家兔体温的影响图；
[0040]图9是人参皂甙Rgl对感染大肠杆菌家兔血液白细胞总数的影响图；
[0041]图10是人参皂甙Rgl对感染大肠杆菌家兔血液嗜中性白细胞数的影响图；
[0042]图11是人参皂甙Rgl对感染大肠杆菌家兔血液TNF- α的影响图；
[0043]图12是人参皂甙Rgl对感染大肠杆菌家兔血液IL-1 β的影响图；
[0044]图13是人参皂甙Rgl对感染大肠杆菌家兔血液IL-6的影响图；
[0045]图14是人参皂甙Rgl对LPS诱导RAW264.7细胞产生促炎性细胞因子以及炎症介质mRNA表达的抑制作用图；
[0046]图15是Rgl阻断LPS和RAW264.7细胞结合图。
【具体实施方式】
[0047]实施例1、人参皂甙Rgl预防LPS的致小鼠死亡作用
[0048]将60只BALB/c小鼠(购自上海国家啮齿动物种子中心)随机分为6组，每组10只，分组和处理见表1。组1~4小鼠皮下注射Rgl (购自吉林宏久生物科技股份有限公司)的生理盐水溶液，剂量分别为7.5、15、30、60mg Rgl/kg体重，组5~6小鼠注射生理盐水，注射药液体积均为100 μ1 。药物注射结束后15分钟，组1~5 —次腹腔注射LPS (购自Sigma公司)，剂量为20mg/kg体重(预先配制成每毫升含50mg LPS的生理盐水溶液)，组6腹腔注射相同体积量的生理盐水。观察60小时内小鼠的活动和死亡情况，结果见图1。由图1可知，组6小鼠100%存活，而组5小鼠的存活率只有30%，说明LPS对小鼠有致死作用；预先注射30mg/kg和60mg/kg Rgl的小鼠(组3、4)没有死亡，得到100%保护；预先注射7.5mg/kg和15mg/kg Rgl的小鼠(组1、2)的存活率分别为60%和90%，得到部分保护。
[0049]表1、分组与处理
【权利要求】
1.人参皂甙Rgl在制备抗内毒素作用于Toll样受体4药物上的应用。
2.根据权利要求1所述的人参皂甙Rgl在制备抗内毒素作用于Toll样受体4药物上的应用，其特征是:所述人参皂甙Rgl能阻止内毒素结合到哺乳动物体内的Toll样受体4，从而阻断细菌内毒素的毒性作用。
【文档编号】A61K31/704GK103622982SQ201310508090
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】胡松华, 苏菲 申请人:浙江大学