2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮在系膜细胞病变中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及2′-羟基-4′-甲氧基苯乙酮的新医药用途，具体地说涉及2′-羟基-4′-甲氧基苯乙酮在系膜细胞病变的新用途。本发明人应用现代实验技术-细胞膜亲和色谱技术发现，2′-羟基-4′-甲氧基苯乙酮可以与系膜细胞的细胞膜结合，起到治疗系膜细胞病变的作用，本发明具有很高的原创性和实用价值。
【专利说明】2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮在系膜细胞病变中的应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮的新医药用途，具体地说，涉及2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮作为防治系膜细胞病变新医药用途，属于医药【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]系膜细胞是肾小球固有细胞成分之一，对肾小球毛细血管袢有支持保护、调节血流量的作用，此外，还具有分泌生长因子、参与免疫反应等多种功能。正常条件下，系膜细胞更新缓慢，但在许多病理条件下，如IgA肾病、狼疮性肾炎、淀粉样变性肾炎、膜增生性肾炎、糖尿病肾病等，系膜细胞表现出增生、肥大或凋亡。随着社会的发展和生活的富足、环境等因素的改变，糖尿病的发病率逐年升高，系膜细胞病变发生率也越来越高，其中以系膜增生性肾炎最为常见，多伴有不同程度系膜细胞增生及系膜基质的增加。系膜的病理改变可引起肾小球基底膜通透性发生改变而导致蛋白质滤过增加。如何抑制系膜细胞增生及系膜基质的增多，减少蛋白的丢失，纠正血脂代谢紊乱，延缓肾病综合征肾病理慢性进展已成为当前临床肾病工作者急需解决的问题。因此，本研究的发现，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮具有较好的治疗系膜细胞病变的疗效。
[0003]2’ -羟基_4’ -甲氧基苯乙酮(paeonol, Pae)又称牡丹酹或丹皮酹，是毛蓑科植物牡丹PaeoniaSuffrutiCCosa Andr根皮和萝摩科植物徐长卿Py Cno s t e ImaPan i Cu I atum (Bunge) KSChum干燥根或全草的主要有效成分,具有药理作用广泛和毒性低的特点。文献报道了 2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮及其类似物具有抗炎、镇痛、抗肿瘤的活性。
【发明内容】
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[0004]本发明在采用生物膜亲和色谱技术研究中发现，2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮能与内皮细胞和系膜细胞膜结合，并应用系膜细胞病变的动物模型进行效应验证，发现其具良好的对抗系膜细胞病变的活性，此外2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮具有高效低毒的特点，可以作为一种系膜细胞病变长期服用的预防和治疗的药物。
[0005]本发明研究发现，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮体内外具有对抗系膜细胞病变发生发展的作用。离体实验结果表明，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮对高糖和糖基化终产物(AGE)诱导的肾小球系膜细胞、视网膜周细胞的增殖异常有明显的改善作用，对链脲佐菌素诱导的I型糖尿病大鼠模型和自发型II型糖尿病db / db小鼠的系膜细胞病变有明显的改善作用。目前对于系膜细胞病变尚无有效的专用治疗药物，而2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮可作为一种安全有效的防治系膜细胞病变的有效新药应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1:2’_羟基-4’-甲氧基苯乙酮对高糖诱导的肾小球系膜细胞过度增殖的影响
[0007]图2:2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮对STZ诱导的糖尿病大鼠模型肾脏系膜区病理学的影响
[0008]图3:2’_羟基-4’-甲氧基苯乙酮对STZ诱导的糖尿病大鼠模型肾脏系膜区VEGF，纤连蛋白表达的影响
[0009]图4:2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮对db / db鼠肾脏系膜区病理学的影响
[0010]图5:2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮对db / db鼠肾脏系膜区VEGF，纤连蛋白表达的影响
【具体实施方式】:
[0011]实施例1:2’_羟基_4’_甲氧基苯乙酮对高糖诱导的肾小球系膜细胞过度增殖的影响
[0012]消化长满的肾小球系膜细胞，调节细胞浓度至4X IO4 / ml，加入96孔板，每孔加入100 μ l。放入37°C，5% CO2培养箱孵育12-16h。更换不含血清的1640培养基。15小时后，第一列加入101 μ l不含血清的培养基，第二至十二列加入100 μ l高糖的培养基(HG)，第三列加入1μ 175%乙醇，第四列开始加入1μ l浓度梯度的药物，继续孵育16小时。每孔加入20 μ lMTT溶液，继续培养4h。中止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入15(^101^0，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光度值。如图1所示，HG组和HG+EtoH组与N组相比较有显著性差异，说明加入高糖培养基后MC过度增殖；1X 10' 1X 10' 1X 10' 1X 10' 1X Kr9组与HG+EtoH组相比较有明显差异，说明2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮抑制了 MC的过度增殖。
[0013]附图1说明:N为加入不含血清的1640培养基；HG为加入高糖1640培养基；HG+EtoH为加入75%乙醇；_5为加入1X 10-5浓度的2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮溶液；_6为加入1X 10-6浓度的2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮溶液，
[0014]实施例2:2’_羟基-4’-甲氧基苯乙酮对链脲佐菌素诱导的I型糖尿病大鼠模型肾脏系膜区病理学的改善作用。
[0015]所有雄性Wistar大鼠适应性喂养一周后，随机分组:对照组10只，造模组35只。造模组按30mg.kglTZ ip,次H ipCFA每只0.1mL, STZ和CFA均每周I次，连续3周，对照组注射相应体积的缓冲液。造模结束后，测定餐后血糖，剔除血糖过高过低者，合格动物30只随机分组:模型组10只，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮大剂量组10只，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮小剂量组10只。2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮大剂量组33.75!^.!?-1^,-羟基-4’-甲氧基苯乙酮小剂量组11.25mg.kg_S每日灌胃一次，连续13周，2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮临用前用3%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混悬。全部大鼠在同一动物房内分笼饲养，标准饮食。
[0016]病理学研究表明，肾脏病理学评分越高，系膜基质百分比越高，肾脏损害程度越高。石蜡切片和HE及PAS染色显示正常对照组动物肾皮质肾小囊内未见纤维素及炎细胞渗出，肾小球毛细血管球细胞及系膜、基底膜无增生，肾小球未见硬化，肾小管上皮细胞未见变性、坏死，肾间质血管未见充血、水肿和炎细胞浸润；模型组动物少量肾脏肾小管上皮细胞重度空泡变性、坏死，肾间质大量炎细胞浸润，多数肾脏肾小管上皮细胞中度空泡变性，肾小球系膜及基底膜中度增生；2’ -羟基_4’ -甲氧基苯乙酮11.25mg / kg治疗动物少数肾脏肾小管上皮细胞中度空泡变性，多数肾脏肾小管上皮细胞轻度空泡变性，肾小球系膜及基底膜轻度增生；2’-羟基_4’甲氧基苯乙酮33.75mg / kg治疗动物多数肾脏肾小管上皮细胞轻度空泡变性，肾小球毛细血管球细胞及系膜、基底膜未见明显增生(图2)。
[0017]实施例3:2’_羟基-4’-甲氧基苯乙酮对链脲佐菌素诱导的I型糖尿病大鼠模型肾脏系膜区VEGF和Fib表达的改善作用。
[0018]免疫组化结果显示，VEGF和Fibernectin主要在DN大鼠肾小球表达增加，间质小管部位也有所增加，阳性部位主要以肾小球系膜细胞、内皮细胞以及管周毛细血管为主，经2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮治疗后，VEGF和Fibernectin表达明显下调，其中，2’ -羟基-4’-甲氧基苯乙酮33.75mg / kg治疗动物VEGF和Fibernectin表达下调最为明显(图3)。
[0019]实施例4:2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮对db / db小鼠糖尿病肾脏系膜区病变的改善作用。[0020]雄性db / db鼠45只，小鼠自由进食、进水，保持垫料干燥，正常饲养一周以适应环境。分为正常对照，模型，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮小剂量，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮大剂量四组，分笼饲养，模型组灌CMCNa，2’ -羟基-4’ -甲氧基苯乙酮小剂量组按13mg / (kg*d)灌胃，2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮大剂量组按39mg / (kg*d)灌胃，连续13周，定期测血糖，正常对照组常规饲养，连续13周。实验周期结束后，迅速剥取肾脏，去除包膜，置10 %福尔马林溶液中固定，脱水，石腊包埋，常规HE及PAS染色，光学显微镜观察病变，肾脏病变包括(I)肾小球系膜基质增生程度；(2)肾小管有无变性；(3)肾小管有无糖原沉积；(4)间质及肾盂有无炎症、纤维组织增生及其严重程度。正常组肾皮质肾小囊内未见纤维素及炎细胞渗出，肾小球毛细血管球细胞及系膜、基底膜无增生，肾小球未见硬化，肾小管上皮细胞未见变性、坏死，肾间质血管未见充血、水肿和炎细胞浸润。模型组肾脏出现的病变有肾小管上皮细胞变性、坏死、萎缩，肾间质大量炎细胞浸润，纤维结缔组织增生，肾小球系膜及基底膜重度增生，部分肾小球萎缩。2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮13mg /kg组出现肾小管上皮细胞变性、坏死、萎缩，肾间质大量炎细胞浸润，纤维结缔组织增生，肾小球系膜及基底膜轻度、中度和重度增生，肾小管上皮细胞水样变性一系列病变。2’ -羟基-4’-甲氧基苯乙酮39mg / kg组出现肾小管上皮细胞变性、坏死、萎缩，肾间质大量炎细胞浸润，纤维结缔组织增生，部分肾小球系膜及基底膜轻度、中度和重度增生(图4)。
[0021]实施例5:2’ -羟基-4-甲氧基苯乙酮对db / db小鼠肾脏系膜区VEGF和纤连蛋白表达的影响。
[0022]免疫组化结果显示，VEGF主要在db / db糖尿病小鼠肾小球表达增加，间质小管部位也有所增加，阳性部位主要以肾小球系膜细胞、内皮细胞以及管周毛细血管为主，经2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮治疗后VEGF表达明显下调，两组不同用药量治疗结果之间显示下调程度相近。FN同样主要在db / db糖尿病小鼠肾小球表达增加，间质小管部位也有所增加，阳性部位主要以肾小球系膜细胞、内皮细胞以及管周毛细血管为主，经2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮治疗后FN表达明显下调(图5)。
【权利要求】
1.本发明提供了2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮或其类似物在制备用于系膜细胞病变治疗的新应用。
2.根据权利要求1所述，其中所述的系膜细胞病变，包括由于系膜细胞病变引发的各种疾病。
3.根据权利要求1所述，2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮或其类似物可以单独或者与其它物质联合，制成适合的剂型用于系膜细胞病变的治疗。
4.本发明上述所述的应用，其中所述的2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮是天然分离的或者人工合成的。优选地，本发明上述所述的应用，其中所述的2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮是从毛蓑科植物牡丹(PaeoniaSuffrutiCcosaAndr)或者萝摩科植物徐长卿(Pycnostelma PaniCulatum(Bunge) KsChum)中提取得到的。
【文档编号】A61P13/12GK103893159SQ201310537650
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】李璇, 时贞平, 崔小兵, 李丹霓 申请人:南京中医药大学