抗感染剂及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种包括交联胞壁酰二肽的新型免疫刺激微粒组合物以及他们作为细菌和病毒感染治疗中的抗感染剂的用途。被需求的具有广泛作用的抗感染剂是能够对多个免疫细胞亚群有特异作用、诱导多种细胞因子的协调释放的抗感染剂。本发明的微粒能够激活多个不同的免疫细胞亚群，对广泛诱导固有抗细菌和抗病毒免疫应答具有重要作用。
【专利说明】抗感染剂及其用途
[0001]本申请为申请日2009年4月I日、申请号200980112374.X、发明名称“抗感染剂
及其用途”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及抗感染剂组合物的用途，特别涉及免疫刺激微粒作为抗感染剂用于增强对抗病原体的固有和/或特异免疫应答的用途。
[0003]本发明首先被开发用作具有广泛作用的抗感染剂，其能够作用于免疫细胞以抵御由病原体引起的疾病。下文将引入该申请来描述本明。然而，应理解，本发明不限于这个特定的应用领域。
【背景技术】
[0004]说明书中的任何对现有技术的描述都绝不应当理解为承认该现有技术广为人们所知或构成了该领域的一般公知常识的部分。
[0005]免疫系统包括2 个主要分类:固有(非特异)免疫系统和适应(特异)免疫系统。两个系统协调产生有效的应答，然而它们在很多方面不同。适应免疫系统需要时间来对病原微生物作出反应、抗原特异性和表现免疫记忆。相比之下，固有免疫系统提供对病原体更快的应答，非抗原特异性且不表现免疫记忆。
[0006]适应(特异)免疫系统有2个分支。它们包括体液免疫和细胞介导免疫。体液免疫涉及对外来抗原产生抗体。抗体由B淋巴细胞产生。细胞介导免疫涉及激活T淋巴细胞，其或作用于带有外来抗原的感染细胞，或刺激其它细胞对感染细胞发生作用。哺乳动物免疫系统的两个分支在防治疾病中均具有重要意义。体液免疫是防止细菌病原体和毒素的主防线，然而，辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的诱导似乎对于长寿命的保护性免疫非常关键。
[0007]固有免疫是防止感染的第一道防线，利用对许多微生物来说常见的病原分子模式识别受体(PRRs)来迅速诱导前炎症性及抗病毒细胞因子。这些途径的特定活化剂对于健康的和免疫能力受损的宿主的病毒感染均具有潜在的治疗作用。对PRRs配体的辨别，伴随对它们的信号级联系统的了解的增加，已致使开发出选择性PRR配体作为对给定的病原体优先免疫应答的诱导剂。
[0008]对于使用非特异免疫刺激剂或佐剂作为增强/诱导非特异免疫的手段的兴趣在不断增加。术语“佐剂”被广泛用于描述在施加给个体或原位试验中时，通过诱导免疫细胞特异免疫活性的一般上调来发生作用的化合物。
[0009]尽管很多材料已被表明具有佐剂活性，唯一被许可用于一般医用的佐剂为50年前被首次使用的明矾。仅次于明矾，含有矿物油和灭活的结核杆菌的弗氏完全佐剂(FCA)，开始时被广泛使用并被视为“金牌标准”，但后来由于它形成肉芽肿而被停止使用。
[0010]对胞壁酰二肽(MDP)-—种革兰氏阳性和革兰氏阴性类细菌的肽聚糖(Inohara，2003 ；Kufer, 2006)常见的二肽的免疫刺激/调节性质的确认，引发了旨在将MDP作为化学成分明确的、全面活性的免疫佐剂应用于临床的免疫功能研究。这些期望很快受挫，意识到MDP自身不适于临床使用，主要因为它的毒性和差的药动力学特征，也即从MDP身体中迅速清除(Lidgate, 1995 ;Traub, 2006)。反之,为减少或消除热源性的尝试导致衍生物的形成，其中的一些以可溶解的单体形式例如莫拉丁酯(Audibert, 1984 ；Bahr, 1995 ；Vidal, 2001)已经被使用于临床试验中。
[0011]与上述提及的MDP剂形成对比，开发出不具有MDP所具有的不期望的副作用且实现了增强的免疫刺激性质的MDP类似物(澳大利亚专利号732809)。MDP的该非毒性形式起先被开发，大多数作为佐剂来增强对天然蛋白质、重组蛋白质、合成肽以及其它免疫物质的特异免疫应答，也即将它与相关抗原联合使用作为传统的佐剂-抗原复合物。
[0012]传统的细菌佐剂本身不使用于刺激非特异免疫系统以防治感染的免疫治疗。一部分这是因为现有技术的佐剂不能特异地激活相关免疫细胞类型和因此激活相关免疫应答。现有技术佐剂通过不合适的细胞类型诱导细胞因子，导致大量各种细胞因子的全身表达，引起反过来阻止它们作为独立的免疫治疗法的严重和不期望的副作用。
[0013]几种固有免疫应答被认为有利于控制病毒感染。这些效应机制是多面的，包括直接抗病毒活性和在感染宿主的免疫细胞上有助于清除这些细胞的免疫调解效应。直接抗病毒活性可以包括可溶性因子，例如CD8抗病毒因子(CAF)和IFN-α，其能够直接影响病毒转录。由巨噬细胞和树突固有免疫细胞分泌的免疫调节/前炎症细胞因子，例如TNF (与IFN-Y相配合)能够作用于对由TNF调节的细胞裂解表现增加的敏感性的病毒感染细胞。此外，细胞机制例如自然杀伤细胞(NK)介导的对病毒感染细胞的杀害包括固有抗病毒免疫的另一重要方面。
[0014]尽管各式各 样的其它固有细胞因子能够介导控制抗病毒免疫性方面的生物功能，高水平的IFN-α/β似乎在病毒感染中起主导作用并且控制其它固有应答。IFN-α在治疗各种病毒紊乱例如慢性乙肝/丙肝以及广泛的人类癌症中的临床应用，在于其能够诱导抗病毒基因的显性阵列，其驱动防止病毒复制的多效宿主防御途径。目前临床应用的IFN-a产品是重组蛋白或高度纯化单一异构体蛋白，其用作药单治疗或与其它抗病毒剂共同使用。然而这些治疗没有良好的耐受性且应答率低。这增加了对不仅能够诱导生理相关水平的自然发生的多重IFN-α异构体，而且还能够调动很有可能与IFN-α发生协同作用的固有抗病毒免疫的其它方面的新方法的需要。
[0015]NK细胞是功能上不同的固有防御病毒感染的贡献者。通过免疫刺激性化合物来加强NK细胞的内在活性是另外一种临床上相关的抗病毒治疗方法。此外，由于NK细胞能够通过与IFN-α不同的机制识别和破坏病毒感染细胞，它们能够靶向那些对IFN-α的直接效应具有抗性的病毒。IFN-α在激活NK杀害中起中心作用，并进一步与其它关键的固有免疫细胞因子例如TNF-α和IL-12协同来向上调节NK细胞功能和提升适应性细胞介导的免疫性.。因此，为了充分利用NK抗病毒机制，其它固有免疫细胞例如浆细胞样树突状细胞(pDC)和单核细胞的免疫刺激是期望的。
[0016]对于细菌感染，其它固有免疫功能，特别是当吞噬病原体遭受活性氧和氮种物种或被溶酶体酶破坏时的吞噬细胞的功能很重要。巨噬细胞然后可以将退化抗原呈递至T细胞并诱导适应性免疫应答。根据致病菌在巨噬细胞中的宿命可以将它们分为二类，胞外菌在被吞噬后立即被杀死，而除非吞噬细胞被免疫激活，兼性细胞内细菌对细胞内杀害具有抗性。胞外菌引起化脓性感染，而兼性细胞内细菌引起肉芽肿性感染。体液免疫机制(抗体，补充物)主要处理胞外菌，而细胞免疫机制(T细胞，巨噬细胞)处理兼性细胞内细菌。
[0017]仍然有很多细菌和病菌感染难以采用目前可获得的治疗方法来治疗。例如，结核(TB)是一种最古老的人类病原，是人由于单一细菌剂死亡的最主要的起因。据估计有将近三分之一的人口感染结核杆菌(Mtb)-病原体。每年有接近800万新的TB病例和约200万的死亡。多重抗药性(MDR)和非常耐药性(XDR)结核对死亡率和发病率的控制提出了严峻的挑战。
[0018]结核能够以不明显的小数量存在，并且偶发性地重新激活产生甚至对于药物敏感株都难以治疗的疾病。由于在药物治疗上的难题，用于限制MDR-Mtb的预防性和治疗性疫苗成为越来越可行的一套策略。从历史上看，瘤型麻风的细菌的重负载能够通过BCG疫苗来减少。迫切需要类似的方法来减少或消除MDR-结核的细菌负载。
[0019]对结核的有效控制似乎包括二个阶段的治疗:对初步接触(初种)后感染的建立的预防和为预防疾病的重新激活对接种BCG的个体的免疫激活(免疫接种)。MDR-Mtb控制中的一个主要缺口在于缺少能够满足这些免疫模式的有效疫苗。此外，药物对治疗MDR-Mtb没有效果，因此，需要治疗性疫苗接种。来源于野生型结核分枝杆菌的减毒活疫苗和BCG疫苗的保护性一样好，但是受到安全问题的限制。已鉴定出很多依赖增效剂、在较短的时间期限内提供保护的重组抗原和DNA疫苗。
[0020]很遗憾地，BCG疫苗对儿童结核的成效不一，而对于成人结核或再感染无效。MDR-结核通常是再感染的结果，因此，BCG疫苗对于控制这种药物敏感或MDR-Mtb株无能为力。而且，Mtb隐藏在巨噬细 胞中，暗中破坏免疫识别。甚至减毒BCG疫苗隔离在减少免疫识别的巨噬细胞(ΜΦ)8)和树突细胞(DCs)的特定隔离室内。因此，BCG具有至少二个重要的不足。第一，它不含所有潜在保护性抗原以及第二，它积极地暗中破坏免疫应答。
[0021]结核由强的Thl免疫性控制，Thl免疫性同时被抗体主导的Th2应答和由Mtb衍生产物诱导的抑制性T-调节细胞反调节。因此，对MDR结核的疫苗介导免疫控制要求以牺牲其它T细胞应答为代价，使用优先诱导Thl免疫性的疫苗，突出了将能够影响T细胞分化的佐剂作为理性的疫苗设计的重要成分的作用。遗憾地，对以最少增效剂的剂量就能诱导长久持续的免疫性的佐剂的机制的理解还有很大的距离。
[0022]流感感染导致了儿童和老年人群的主要发病率和死亡率。与流感感染相关的严重并发症包括肺炎，呼吸衰竭，非呼吸条件例如休克和脑病，以及潜在慢性疾病的加重。与流感有关的死亡能够直接与初始病毒感染相关或能够由次级的并发症导致。在某些例子中，从疾病开始到死亡的进程能够迅速发生。虽然接种疫苗可以提供一些保护，每年的遗传漂变的程度意味着疫苗与循环病毒株之间错配的可能性很高。一个优选的疫苗剂型捋是不要求每年重新形成以适应每年发生的快速流感株突变的疫苗。虽然疫苗是控制流感的必要工具，当疫苗失败或流感在没有接种疫苗的个体或没有接种疫苗的人群(流行病)中突发时，固有免疫治疗方法可具有特别的优势。
[0023]鼠疫由从假结核杆菌的肠道致病菌变体而来的鼠疫杆菌引起，其通常导致慢性和相对轻微的疾病。鼠疫菌自然寄生在跳蚤上，但对于老鼠和人类也高度毒性，导致系统性流行病且常常为致命疾病。虽然鼠疫感染在西方世界相对稀少，在欠发达国家它仍然威胁到公众健康。它能够以气溶胶在人与人之间传播，因此被列为A类生物恐怖剂。鼠疫病能够导致动物发病部分是由于它能够内在地减弱对感染的正常的、非传染性免疫应答。在没有目前预防性接种策略下，能够刺激固有免疫应答的治疗方法可以防止肺鼠疫。
[0024]同样的，期望的具有广泛作用的抗感染剂将是能够对多个免疫细胞亚群有特异作用、诱导多种细胞因子的协调释放的抗感染剂。所需要的是该种作用模式将对于预防和/或治疗病毒和/或细菌感染(特别是那些难以治疗的)。
[0025]本发明的目的之一是克服或减轻现有技术的不足的至少一个或提供一种有益的替代。
【发明内容】
[0026]本发明一部分基于出于意料的发现即交联到微粒上的胞壁酰二肽含有免疫刺激性的核酸序，其可以解释为什么还发现，如本文所描述的，MDP微粒能够激活对很多固有抗细菌和抗病毒免疫应答的诱导关键的几种不同的免疫细胞亚群。下文中，包括核酸序的MDP微粒将被称为“MDP/DNA微粒”。
[0027]进一步地，MDP/DNA 微粒可以被一个或更多个能够增强固有抗感染免疫应答的附加配体和/或细菌或病毒抗原功能化，以进一步刺激/集中免疫应答。
[0028]根据第一方面，本发明提供一种由病毒和/或细菌引起的感染的预防或治疗方法，其包括向需要它们的对象施加有效量的MDP/DNA微粒。
[0029]优选地，MDP/DNA微粒激活固有免疫应答。
[0030]更优选地，固有免疫应答包括NK细胞，浆细胞样树突状细胞(pDC)或单核细胞的固有免疫应答。
[0031]优选地，MDP/DNA微粒进一步诱导和/或刺激至少一种细胞因子的释放。
[0032]细胞因子优选为免疫/前炎性和/或调节性细胞因子。
[0033]优选地，免疫/前炎性和/或调节性细胞因子为干扰素-α (IFN-α)、干扰素-Y (IFN- Y )、白细胞介素10 (IL-10)、白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素I β (IL-1 β )、肿瘤坏死因子α (TNF-α )、白细胞介素12(IL_12)以及CD8抗病毒因子等。
[0034]优选地，MDP/DNA微粒调动固有抗病毒和/或抗细菌免疫性的其它方面。
[0035]更优选地，上述固有抗病毒和/或抗细菌免疫性的其它方面能够与IFN- α协同作用。
[0036]为了增强固有抗病毒和/或抗细菌免疫应答的功效，可以将MDP/DNA微粒与至少一种结合在微粒上或内、能够刺激在病毒和/或细菌细胞损伤和/或销毁中有效的特异免疫细胞亚群的免疫刺激配体组合。优选地，配体选自TLR1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，N0D-1,N0D-2等或它们的任意组合。
[0037]能够将MDP/DNA微粒设计为支持优先诱导Thl或Th2型免疫性。此外，吸收除了进一步佐剂配体之外的一系列免疫原的能力允许建立能够优选同时输送抗原和佐剂至接种疫苗的靶向细胞的单剂。
[0038]在一个实施方式中,MDP/DNA微粒包括至少一种病毒和/或细菌抗原。合适的抗原的例子包括但不限于结核杆菌抗原例如抗原-85A，抗原-85B，ESAT和CFP-10。也可以使用这些抗原的任意组合。优选的流感抗原来源于循环株的红血球凝集素和神经氨酸酶基因。鼠疫抗原可从毒素成分Fl，V或二者的组合-所谓的Fl-V融合抗原中获得。其它可以与本发明的组分一起使用的病毒和细菌抗原对于本领域所属技术人员来说是已知的。
[0039]优选地，MDP/DNA微粒的直径为约0.05至3.0微米。更优选直径为0.2至2.0微米。最优选地，直径为0.2至1.0微米或者直径为0.5tol.0微米。
[0040]优选地，MDP/DNA微粒在包含一种或更多种制药或兽医辅料，载体或溶剂的组合物中。
[0041]优选地，由病毒和/或细菌引起的感染的预防或治疗方法进一步包括施加另外一种有效预防或治疗由病毒和/或细菌引起的感染的治疗剂。
[0042]优选地，上述另外一种治疗剂为同时或顺序施加的疫苗和/或抗生素。
[0043]对象优选为哺乳动物或更优选地为人。
[0044]优选地，待治疗的感染选自但不限于流感，鼠疫和结核。
[0045]优选地，MDP/DNA微粒能够作为NK细胞的趋化剂。
[0046]优选地，MDP/DNA微粒能够作为NK细胞毒素的趋化剂。
[0047]MDP/DNA微粒还能够作为抑制病毒和/或细菌复制的可溶性因子的趋化剂。
[0048]根据第二方面，本发明提供具有抗感染活性的药物组合物，包括MDP/DNA微粒，其中MDP/DNA微粒包括核酸和选择性的药学上可接受的载体。
[0049]根据第三方面，本发明提供一种具有抗感染活性的药物组合物，包括MDP/DNA微粒，其中，MDP/DNA微粒包括核酸，组合一种或更多种能够刺激有效损伤和/或破坏和/或抑制细菌和/或病毒的免疫细胞亚群的配体，以及选择性的药学上可接受的载体。
[0050]根据第四方面，本发明提供一种具有抗感染活性的药物组合物，包括MDP/DNA微粒，其中，MDP/DNA微粒包括核酸，组合一种或更多种细菌和/或病毒抗原，以及选择性的药学上可接受的载体。
[0051 ] 合适的药学上或兽医载体和剂型对于本领域所属技术人员是已知的。
[0052]MDP/DNA微粒的核酸成分优选为DNA。更优选的是细菌非甲基化富含CpG的DNA。
[0053]根据第五方面，本发明提供包括MDP/DNA微粒的组合物，其中，MDP/DNA微粒包括DNA。
[0054]优选地，MDP/DNA微粒诱导Thl-型免疫应答。
[0055]应当理解，可以将其它治疗和/或抗感染剂与MDP/DNA微粒组合使用或结合到MDP/DNA微粒上。能够同时或顺序施加MDP/DNA微粒和/或其它抗感染剂。顺序施加可以为任何合适的分钟，小时，天或星期的时限所隔开。
[0056]因此，根据本发明的第六方面，提供包含有效量MDP/DNA微粒的疫苗组合物。
[0057]还应当理解，本文描述的MDP/DNA微粒组合物可以等同有效地使用于适于人类给药的药学剂型和适于兽类应用的剂型。优选地，剂型供人类使用。
[0058]根据第七方面，本发明提供MDP/DNA微粒在制造用于细菌和/或病毒感染的预防或治疗处理药物中的用途。 [0059]除非上下文明确要求，说明书和权利要求书中，词“包括”，“包含”等取与排他的或详尽的意义相对的包容性的意义，也即是说，具有意义“包括但不限于”。
[0060]在本发明的上下文中，“胞壁酰二肽微粒”可以与“微粒”，“MA”，“MDP微粒”，MDP/DNA微粒，“MIS-416”以及“MIS”可交换地使用。在图中，术语“MIS”，“MIS416”和“MDP”相互交换使用，并描述本发明的MDP/DNA微粒。[0061]本文中使用的术语“抗感染”旨在包括MDP/DNA微粒组合物的杀菌活性(即杀害细菌和/或病毒)和抑菌活性(即抑制/防止细菌和/或病毒的生长，繁殖和/或复制)二者。
【专利附图】
【附图说明】
[0062]图1:被人外周血髓系树突状细胞(mDC)，浆细胞样树突状细胞和单核细胞内化的荧光标记的MDP/DNA微粒(MISAF488)。
[0063]图2:用 10 μ g/ml MDP/DNA 微粒(MIS416)培养后的 72h 的人PBMC 分泌的 IFN- Y，IL-10, IL-6, IL-13 和 TNF- α 细胞因子。
[0064]图3:MDP/DNA微粒(MIS)刺激(通过内涵体/溶酶体抑制剂终止刺激)后的pDC分泌物。
[0065]图4:通过MDP/DNA微粒(MIS)对纯化的人⑶56+⑶3-NK细胞的直接免疫刺激。
[0066]图5:在使用MDP-DNA微粒刺激后，单核细胞的TNF分泌的诱导。
[0067]图6:在使用MDP/DNA微粒(MIS)刺激后，人PBMC同步NK杀害活性的增强。
[0068]图7:对HIV-1分支A和BPBMC病毒生物负载的抑制，由从I，5或10 μ g/ml的MDP/DNA微粒(MA)刺激后的PBMC培 养菌中在48h小时收集的培养上清介导。
[0069]图8:MDP/DNA微粒前处理提供抗鼠疫菌气溶胶
[0070]图9:在感染前10天，用MDP/DNA微粒(MDP)对老鼠进行抗鼠疫菌的前处理。
[0071]图10:多种剂量的MDP-DNA微粒(MDP)的抗鼠疫菌的比较。
[0072]图11:在感染建立后，通过MDP/DNA微粒(MIS416)治疗对流感A的发病率和死亡率的抑制。
[0073]图12:MDP/DNA微粒(NT-MDP)预防法抗炭疽毒素。
[0074]图13:MDP/DNA微粒(MIS416)佐剂-OVA免疫原结合物在Thl接种疫苗模式中诱导保护性细胞免疫。
[0075]图14:伴随HLA-DR下调，MDP/DNA微粒(MIS416)上调免疫共刺激分子人CD83和CD86的人PBMC mDC和pDC表达。
[0076]图15:通过与未治疗的动物相比减少的肺Mtb菌落数来衡量MDP/DNA微粒(MIS416)增强Mtb ESTAT抗原的免疫原性。
【具体实施方式】
[0077]没有安全和有效的病毒和/或细菌感染的预防或治疗手段激发了本发明，本发明部分以交联到微粒上的胞壁酰二肽(MDP微粒)对刺激固有免疫系统的独特和有益的性质为基础。出乎意料地发现，MDP微粒含有可能具有细菌起源的DNA片段，这可以解释它对几种不同的、对很多固有和适应抗感染免疫应答的诱导关键的免疫细胞亚群的选择性靶向和激活能力。这种新型包含DNA片段的MDP微粒将在本文中称为“MDP/DNA微粒”。
[0078]虽然本发明的MDP/DNA微粒组合物本身能有效靶向和激活有助于细菌和/或病毒的破坏的免疫系统的相关成分，微粒组合物的功效能够通过能够被偶联到MDP/DNA微粒表面或之内的配体和免疫原/抗原所增强。
[0079]本发明的组合物能够杀死细菌和病毒(即杀菌的)，但同时也能够预防细菌和病毒生长/繁殖/复制(也即抑菌的)。二种活性类型在细菌和/或病毒感染的预防或治疗中均是有利的。
[0080]本文中描述的MDP/DNA微粒已被设计用于诱导高水平的IFN- α和与广谱固有免疫特别是抗毒免疫的诱导临床相关的其它前炎性细胞因子。非常重要地，调解细胞因子例如IL-10的同时产生意味着微粒能够诱导调解免疫应答因而避免与基于免疫的单一治疗关联的高免疫刺激。所有这些已通过利用能够在微粒制剂中诱导期望的广度和程度的免疫应答的特定病原识别受体(PRR)配体的免疫刺激性质实现。这限制了关键固有免疫细胞亚群的微粒吸收，因而避免了不相关细胞类型介导的临床上不能接受的副作用。
[0081]例如，对MDR-Mtb (耐多药结核分枝杆菌)的免疫性取决于⑶4和⑶8依赖的强Thl免疫的诱导，涉及主要细胞因子IFNy、IL-12和TNFa。这些细胞因子通过循环机制激活感染的ΜΦ s和DCs来借由氧化氮和超氧化物的合成准备和消除细胞内Mtb。有趣的是，已知Toll样受体(TLRs)对树突状细胞上的细胞因子的合成进行调节，因而影响保护性Thl应答的扩增。新兴的研究表明TLR信号也可以影响细胞内分枝杆菌的宿命。
[0082]然而应理解，类似的免疫应答对于防止其它细菌和病毒感染是有益的，因此本发明的组合物既可以被用作固有或特异免疫刺激剂来对抗广泛的细菌和病毒感染。本发明组合物的抗感染活性可以杀菌活性形式(即杀死细菌和病毒)或抑菌活性形式(预防细菌和病毒的生长复制)出现，二种活性类型均有助于对对象的细菌或病毒感染的治疗或预防。
[0083]为了增强固有抗病毒和/或抗细菌免疫应答的功效，可以将MDP/DNA微粒与至少一种结合在微粒上或内、能够刺激在病毒和/或细菌细胞损伤和/或销毁中有效的特异免疫细胞亚群的免疫刺激配体组合。合适的配体可以选自描述的病原体分子模式识别受体的已知配体，包括TLRl，2，3，4，5，6，7，8，9，10，NOD-1，N0D-2等。还能够使用这些配体的任意 组合。其它有用的受体在本领域中是已知的，能够为所属领域技术人员容易辨别。
[0084]能够被连接到和保留在MDP/DNA微粒骨架上的功能基团的可获得性允许高密度耦合其它佐剂/免疫刺激配体，其能够以基于它们已知的生物活性的原理方式吸收。例如，N0D-1和N0D-2配体已经被表明与合成磷脂A(TLR4配体)，聚(1:C)，(TLR3配体)以及CpG0DN(TLR-9配体)协同，用于诱导人树突细胞IL-12p70的产生和T细胞关联的IFN-Y的产生。以类似的方式，能够建立MDP/DNA微粒来支持对Thl或Th2型免疫的优先诱导。此外，吸收除了进一步佐剂配体之外的一系列免疫原的能力允许建立能够优选同时输送抗原和佐剂至接种疫苗的靶向细胞的单剂。
[0085]可快速清除或在特定条件例如细胞内体/溶酶体pH降低的条件下可逆的连接剂，对于开发很多生物活性化合物的输送载体有用。MDP/DNA微粒在现有的型式下被生产用于向抗原加工/表现细胞提供免疫原的靶向输送，带有NOD配体和抗核酸TLR9配体共价结合入微粒中的。MDP/DNA微粒含有其它功能基团包括氨基和可氧化碳水化合物基团，用于连接免疫原和TLR配体。能够采用这些功能基团将期望的免疫原和/或配体连接，使用双功能交联反应剂例如琥珀酰亚胺、马来酰亚胺和醛连接剂。此外，存在可氧化碳水化合物基团，其提供直接连接初级和次级氨基基团的化学性质，初级和次级氨基基团可被免疫原和TLR配体均吸收。在药物载体的构建中以及连接药物和载体中，乙缩醛键被广泛用作输送药物的酸不稳定键。醛可以作为酸不稳定构件模块来交联生物活性化合物至MDP/DNA微粒.上的自由氣基基团。[0086]在一个实施方式中，MDP/DNA微粒包括至少一种病毒和/或细菌抗原。合适的抗原离子包括但不限于结合杆菌抗原例如抗原-85A、抗原-85AB，ESAT以及CFP-10。也可以使用这些抗原的任意组合。流感抗原通常来源于红血球凝集素和神经氨酸酶基因，与目前循环株一致。鼠疫抗原可以来源于有毒成分F1，V或二者的组合即所谓的Fl-V融合抗原。
[0087]MDP/DNA微粒优选为耐降解。优选地，MDP/DNA微粒剂型耐胃蛋白酶、极限pH和变性状态下的处理。特别是，MDP/DNA微粒剂型耐a)在pH3.5下用胃蛋白酶处理，b)pH，其中PH小于I (ImM HCl)或大于11 (ImM NaOH)以及c)变性状态，例如6M尿素或6M盐酸胍。MDP/DNA微粒的DNA组分优选耐核酸例如例子DNAse I
[0088]MDP/DNA微粒组合物可以通过合适的手段给药。根据本发明，使对象具有对某种疾病免疫或治疗有病的对象的方法可以采用很多方法将将疫苗组合物形成的液体溶液施加。示例性的给药方法是 肌肉注射、皮下注射、静脉注射、腹腔内注射、滴眼液、通过饮水、喷雾，或鼻腔喷雾。到施加给动物时，任何合适的兽药剂型可以使用。除了上面描述的那些，剂型还可以是粉或膏形式，可以通常的方式加入到饲料或口服给药。合适的剂型和赋形剂能够在标准文本中找到，例如Remington:科学和药学实践，19版本，1995 (Mack PublishingC0.Pennsylvania,美国)，英国药典，2000 等。
[0089]虽然不希望收到任何关于本发明如何工作的理论的限制，MDP/DNA微粒剂型的处理广谱感染剂的能力起源于对固有杀死细胞(NK)和其它固有免疫细胞例如浆细胞样树突状细胞(PDC)和单核细胞的激活，以及由MDP/DNA微粒组分中的核酸对多重细胞因子的释放的诱导/刺激。
[0090]仅是通过举例的方式，参考附图描述本发明的优选实施方式。尽管通过举例的方式描述本发明，应当理解，可以在不背离本发明范围的情况下作出变形。此外，当特定特征存在已知的等同特征时，这些等同特征作为在本发明中特别提及的引入。
[0091]实施例
[0092]例1-MDP/DNA微粒的制各
[0093]从丙酸杆菌腺胞分离出来的胞壁酰二肽(MDP)的多个重复形成了本例中MDP/DNA微粒载体复合物的核结构。优选的单体亚基的化学组分显示如下:
[0094]
【权利要求】
1.MDP/DNA微粒单独在制造预防或治疗细菌和/或病毒感染的药物中的用途，其中，该药物激活固有免疫应答。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述固有免疫应答包括NK细胞，浆细胞样树突状细胞(PDC)和/或单核细胞的激活。
3.根据前述权利要求1所述的用途，其中药物进一步诱导和/或刺激至少一种细胞因子的释放。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述细胞因子选白干扰素-a(IFN-a)、干扰素-Y (IFN- Y ),白细胞介素-10 (IL-10),白细胞介素-6 (IL-6),白细胞介素-1 β (IL-1 β ),白细胞介素I β (IL-1 β),肿瘤坏死因子- a (TNF- α )，白细胞介素-12 (IL-12)和/或⑶8抗病毒因子。
5.根据前述权利要求1所述的用途，其中对象为哺乳动物。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的用途，其中待治疗的感染选自流感，鼠疫或结核。
【文档编号】A61P31/16GK103990120SQ201310567851
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2009年4月1日 优先权日:2008年4月1日
【发明者】弗朗克·B·戈尔德, 吉利安·爱力森·韦伯斯特 申请人:伊耐特免疫治疗有限公司