Mica结合剂的制作方法

Mica结合剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于使用特异性结合MICA的抗体、抗体片段及其衍生物治疗由MICA表达细胞介导的障碍的方法。本发明还涉及抗体，产生此类抗体的细胞；制造此类抗体的方法；这些抗体的片段、变体以及衍生物；包括其的药物组合物。
【专利说明】MICA结合剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年2月7日提交的美国临时申请号61/595,902和于2012年 4月18日提交的美国临时申请号61/625, 841的权益；将其全部通过引用以其全文结合在 此，包括任何附图。
[0003] 对序列表的引用
[0004] 本申请将与电子格式的序列表一起提交。将该序列表提供为标题为"PCT Seq list MICA_ST25"、创建于2013年2月7日、大小为77KB的文件。电子格式的序列表中的 信息通过引用以其全文结合在此。 发明领域
[0005] 本发明提供了能够与MICA多肽结合的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白在由 MICA表达细胞--特别是肿瘤细胞--表征的障碍的治疗方面具有增加的活性。
[0006] 背景
[0007] 免疫受体NKG2D正常表达于人类T细胞（例如⑶8+T细胞、Y S T细胞）和NK细 胞上。在预激活的⑶8+细胞上，NKG2D经由DAPlO缔合作为⑶28和TCR信号传导的协同共 刺激物起作用，而在NK细胞中，它作为直接激活剂起作用。连接配体后，NKG2D因此经由成 对的DAPlO衔接蛋白传达直接激活或共刺激信号，由此提升癌症和感染性疾病免疫力。
[0008] 已经鉴定并表征了人类NKG2D (hNKG2D)的不同配体，包括主要组织相容性复合体 I类相关链A和B多肽（MICA和MICB)、UL16结合蛋白（ULBP)家族以及视黄酸早期转录 物I(RAETl)家族。MICA经常与由微生物感染诱导的上皮肿瘤相关，并且异常表达于某些 自身免疫性疾病损害中。MICA的结构类似于MHC I类的蛋白质折叠，具有一个a Ia 2平 台结构域和一个近膜端（membrane-proximal) Ig样a 3结构域（Li (李）等人2001Nat. Immunol.(自然免疫学）2:443)。MICA及其近亲MICB(还作为NKG2D的配体）两者都 是多态的并且已经显示这种多态性影响对NKG2D的亲和力（Steinle (施泰因勒）等人 2001Immunogenetics (免疫遗传学）53:279)。
[0009] 在缺乏MHC I类链（MIC)基因的小鼠中，结构上与ULBP相关的蛋白质家族视黄酸 早期（RAE-I)分子作为NKG2D的配体起作用。已经显示RAE-I表达是由致癌物诱导的并且 刺激T细胞的抗肿瘤活性。然而，鼠类NKG2D识别人类MICA多肽（Wiemann (威曼尼）（2005) J. Immunol.(免疫学杂志）175:820-829)。
[0010] MICA在癌症生物学中的作用由于以下事实复杂化，MICA作为可溶态从肿瘤 细胞的细胞表面（例如， #〇19等位基因）并且在外来体的表面0)8等位基因）上被释 放（Ashiru(阿斯苑）等人（2010)Cancer Res?(癌症研究）70(2) :481-489))。可溶性 MICA(sMICA)可以例如在罹患胃肠道恶性肿瘤的患者的血清中以高水平检测到（Salih(萨 利赫）等人，2002J. Immunol.(免疫学杂志）169:4098)。已经报道 MMPs ADAMlO 和 ADAM17 连同二硫化物异构酶Erp5在MICA的裂解和脱落方面具有作用（Waldhauer (瓦尔德豪 尔）（2008) Cancer Research (癌症研究）68 (15) 6368-76 ;Kaiser (凯泽）等人（2007) Nature (自然）；已经 Salih (萨利赫）（2002) J. Immunol (免疫学杂志）169:4098-4102)。已 经报道膜结合MICA下调NKG2D在NK和/或T细胞上的表达（Von Lilienfeld-Toal (冯利 林菲尔德-托尔）等人（2010)Cancer Immunol. Immunother.(癌症免疫学，免疫疗法））。 值得注意地，Wiemann(威曼尼）（2005)(同上）检查了 MICA Tg小鼠并且总结到表面NKG2D 在非转基因脾细胞上的下调在与来自MICA转基因小鼠的脾细胞体外共培养后是最明显 的，并且在用来自H2Kb-MICA小鼠的血清处理后仅是少量的，然而分别用对照细胞和来自 nontgLM的血清温育没有影响并且总结到整体数据说明在H2-K-MICA NK细胞上的减少的 表面NKG2D导致NKG2D功能异常并且总结到NKG2D下调主要由向细胞结合MICA的持续体 内暴露导致。
[0011] 报道还透露NK细胞上的NKG2D被sMICA下调（Groh (格罗）等人（2002) Nature (自 然）；Arreygue_Garcia(阿莱伊格-加西亚）（2008)BMC;Jinushi (基纳施）等人（2005) J. Hepatol.(肝病学杂志）），导致更小反应性的NK细胞。因为已经在其他蛋白质家族（如 Ig样和TNF超家族）中观察到类似的系统，所以可以出现这一基本原理，其他蛋白质家族已 经显示作为可溶态而被释放并且这些分子的释放通过减少配体密度影响细胞间相互作用 并且调节携带各自的受体的NK细胞（Salih (萨利赫）2002)。因此，用于产生抗MICA抗体 的尝试已经聚焦于抑制MICA脱落的抗体的研发。
[0012] 还已经报道NKG2D配体MICA和MICB在健康细胞上的表达可以打破免疫激活与耐 受之间的平衡，并且触发自身免疫。遗传连锁研究已经显示一些MICA等位基因与1型糖尿 病呈正相关，并且疾病在其胰岛细胞上表达Rael的前糖尿病NOD小鼠中的发展可以通过用 NKG2D阻断mAb进行治疗而被完全阻止，这些NKG2D阻断mAb减少自身反应性⑶8+T细胞的 膨胀和功能。MICA和MICB分子在RA滑膜细胞中还被显著上调并且以一种NKG2D依赖性方 式激活T细胞。此外，已经报道类风湿性关节炎患者在血清和发炎的关节中具有高水平的 IL-15和TNF-a，这诱导NKG2D在T细胞的⑶4+⑶28-亚群上的表达。在乳糜泻中，已经报 道上皮内NKG2D+⑶8+cd T淋巴细胞大量浸润在肠中，并且MIC蛋白在罹患活动性疾病的患 者中的上皮细胞的表面上变得强烈表达。在炎性肠障碍中，可以在肠道上皮细胞上发现增 加水平的MIC表达，并且发现表达NKG2D的肠道上皮⑶4+T细胞的数目与肠道炎症相关联。
[0013] 迄今，基于NKG2D系统的用于治疗炎症的途径已经聚焦于NKG2D自身而非其 配体的阻断（Ogasawara (小笠原）等人（2004) Immunity (免疫力）20 (6) : 757-767 ; Andersson (安德森）等人（2011) Arthritis. Rheum?(关节炎与风湿病）63(9) :2617-2629 ; Steigerwald (斯泰格沃德）等人（2009)MAbs 1 (2) : 115-127)。这一焦点在 NKG2D 而非其 配体上的一种可能性归因于靶向NKG2D配体系统的感知到的难度，该配体系统包括多种配 体并且在一些情况下包括大量的等位基因。
[0014] 对于MICA和MICB而言，存在超过50个MICA等位基因以及至少13个识别的MICB 等位基因。跨越a I a 2结构域（该结构域被包含在NKG2D界面中）中的MIC多肽仅存在 43%氨基酸同一性，并且80%的氨基酸取代是非保守的（Steinle(施泰因勒）等人（2001) Immunogenetics (免疫遗传学）53:279-287 ;Steinle (施泰因勒）等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci? U. S. A?(美国科学院院刊）95:12510-12515)，说明获得对一个群体中的大部分 个体而言有效的抗体将是不太可能的。另外，MICA中的位置129处的甲硫氨酸/缬氨酸双 同态决定了 NKG2D结合方面的差异，并且尽管残基129的侧链被部分掩埋并且与谷氨酰胺 136、丙氨酸139以及甲硫氨酸140在第一 a 2螺旋延伸（helical stretch)中形成疏水相 互作用，但是与MICA的缬氨酸129形式相比，它可能与这一结构域中的构象方面的差异相 关（Steinle (施泰因勒）等人（2001) Immunogenetics (免疫遗传学）53:279-287)。
[0015] 总之，对用治疗剂靶向MICA的新途径存在需要。
[0016] 发明概述
[0017] 在一个方面中，本发明尤其源自跨越人类MICA等位基因（以及在非人灵长类MICA 上）发现具有高亲和力的抗体。
[0018] 这些抗体值得注意地结合来自两个主要MICA类群中每一个的一个或多个MICA等 位基因，这两个主要MICA类群被确定代表MICA的主要家族：强烈结合NKG2D的类群1等 位基因（包括MICA #001、#002、#007、#012、#017以及 #018)和微弱结合NKG2D的类群2等位 基因（MICA*004、*006、*008、*009 以及 *019)。通过与存在于亚群 MICA*001、*004、*007 以及 #008或#001、#004、#007、 #008以及#019上的表位结合，这些抗体覆盖存在于几乎全部个体 中的两个类群的等位基因。任选地，这些抗体对于与在其表面表达 #〇〇1的细胞、与在其表 面表达#004的细胞、与在其表面表达#007的细胞以及与在其表面表达 #008的细胞的结合 而言具有至多5 y g/ml，任选地至多3 y g/ml、至多2 y g/ml、至多I y g/ml或至多0. 5 y g/ ml 的 EC50。
[0019] 对于有效介导CDC和ADCC的抗体而言，高亲和力结合是尤其有利的。本发明提供 了位于a 1和/或a 2结构域内的MICA上的表位，这些结构域对于诱导高ADCC和/或⑶C 活性而言是最佳抗体结合区，然而仍跨越主要MICA等位基因发现了这些表位。这些表位通 常在a 1和/或a 2结构域的侧面上并且整个在NKG2D结合表面外面或部分与NKG2D结合 表面重叠。另外，鉴定a 3表位展示出增强的ADCC/⑶C和多等位基因结合特征。
[0020] 还鉴定抗体的亚组阻断MICA与NKG2D的相互作用。除了当包括被Fe Y受体结合 的Fc结构域诱导ADCC和CDC活性或当包括基本不被Fe Y受体结合的Fc结构域阻断前炎 性活性之外，这些抗体由于其能够阻断sMICA诱导的NKG2D的下调的能力是有用的。
[0021] 还鉴定抗体的其他亚组不阻断细胞（例如肿瘤细胞、转染子）的表面上的MICA在 NKG2D表达免疫细胞中诱导NKG2D活性的能力，该免疫细胞在抗MICA抗体的存在下与所述 MICA表达细胞进行接触。除了诱导ADCC和⑶C活性以外，这些抗体由于其避免抑制NKG2D， 这样使得NKG2D表达免疫效应细胞仍能够经由NKG2D溶解靶细胞的能力是有用的（例如， 除了任何Fe Y受体介导的机制以外）。
[0022] 重组体和细胞表面结合MICA似乎能够具有不同构象并且结合细胞结合MICA 对MICA蛋白可以具有远程效应。特别出人意料地，当使用重组蛋白时，细胞（例如肿瘤 细胞、转染子）的表面上的MICA通过NKG2D诱导信号转导的能力的阻断不经常与阻断 MICA-NKG2D相互作用的能力相关联（Biacore studie)。还特别出人意料地，虽然发现全等 位基因抗体未完全位于a Ia 2结构域的平台（plateau)上的NKG2D结合区域内，但是MICA 通过NKG2D阻断细胞（例如肿瘤细胞、转染子）的表面上的MICA诱导信号转导的能力不与 结合表位的位置相关联。一些远离NKG2D交互区的抗体能够阻断NKG2D活性的诱导，而一 些靠近NKG2D结合区或与其部分重叠的抗体不阻断NKG2D活性的诱导。抗体此外在随其表 位而变的介导CDC的能力方面存在不同。
[0023] MICA的类群1等位基因通常在残基129处具有M，而类群2等位基因在残基129 处具有V。在一个实施方式中，MICA类群的特征在于该MICA多肽的位置129处的甲硫氨酸 (M)或缬氨酸（V)残基的存在，其中M与强烈结合NKG2D的MICA形式相关并且V与较低的 结合NKG2D相关。
[0024] 在一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体与在位置129处具有甲硫 氨酸的MICA等位基因和在位置129处具有缬氨酸的MICA等位基因交叉反应。在一个方 面中，本发明提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体与在位置129处具有甲硫氨酸的人类 MICA多肽和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽特异性结合。任选地，这些抗体对于 与在其表面表达在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽的细胞以及与在其表面表达 在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽的细胞的结合而言具有至多5 ii g/ml，任选地至 多 3 y g/ml、至多 2 y g/ml、至多 I y g/ml 或至多 0? 5 y g/ml 的 EC50。
[0025] 在一个实施方式中，该抗体进一步与在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽结合 (例如，与SEQ ID NO:6的MICB多肽结合）。
[0026] 发现的这些结合区仍存在于糖基化的MICA上，值得注意地是由人类肿瘤细胞优 先表达的具有糖基化作用的MICA。
[0027] 在一个实施方式中，本发明尤其源自在阻断MICA与NKG2D的相互作用的同时在体 外和体内有效诱导MICA表达肿瘤细胞的效应细胞（例如NK细胞和/或T细胞）溶解的抗 体的发现。阻断NKG2D-MICA相互作用的抗体是有利的，因为此类抗体可以阻止sMICA诱导 的NKG2D的下调，如在此所示。此类阻断抗体对于具有高水平的可溶性MICA(例如在循环 中）的患者的治疗而言可以是特别有用的。在另一个实施方式中，本发明提供了以下抗体， 这些抗体在体外和体内有效诱导MICA表达肿瘤细胞的效应细胞（例如NK细胞和/或T细 胞）溶解并且抑制sMICA诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调而不实质阻 断MICA自MICA表达细胞（例如肿瘤细胞）脱落。此类抗体可以通过抑制MICA与NKG2D的 相互作用来抑制sMICA诱导的NKG2D表达的下调。任选地，该抗体包括9C10、19E9、12A10、 18E8、14B4或10F3的轻链和重链⑶R，任选地在⑶R中具有一个或多个氨基酸修饰。
[0028] 在另一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体在体外和体内有效诱导 MICA表达肿瘤细胞的效应细胞（例如NK细胞和/或T细胞）溶解而不实质阻断MICA自 MICA表达细胞（例如肿瘤细胞）脱落并且不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用。任选地， 该抗体包括6E4、20C6、16A8、15F9、10A7或14B4的轻链和重链CDR，任选地在CDR中具有一 个或多个氨基酸修饰。
[0029] 在一个实施方式中，提供了与a I a 2结构域（该结构域被包含在NKG2D界面中） 结合的抗体，这些抗体与多个MICA等位基因（例如在位置129处具有甲硫氨酸的MICA等 位基因和在位置129处具有缬氨酸的MICA等位基因；MICAsnOOI、#004、#007以及#008等位 基因）交叉反应并且以高亲和力与此类MICA等位基因结合（例如对于与在其表面表达人 类MICA多肽的所述等位基因的细胞的结合而言至多5 ii g/ml，任选地至多3 ii g/ml、至多 2 ii g/ml、至多I ii g/ml或至多0. 5 ii g/ml的EC50)。任选地，这些抗体结合至以下区域，这 些区域在a I a 2结构域上，位于或部分位于NKG2D界面的外面，但是未完全在NKG2D界面 内。
[0030] 可以根据在此的实施例3的方法，使用例如流式细胞术评价与MICA等位基因的结 合以及相关的EC50值。
[0031] 在另一个实施方式中，本发明源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的a 1和/ 或a 2结构域而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自表 达在细胞的表面）。任选地此类抗体的特征可以在于不与hNKG2D竞争与MICA的结合。任 选地，这些抗体不抑制MICA在NKG2D表达细胞中诱导NKG2D活性的能力。任选地此类抗体 的特征可以在于不降低或阻断NKG2D表达效应细胞（例如CD16负效应细胞）溶解MICA表 达靶细胞的能力。这些抗体将任选地不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
[0032] 在一个实施方式中，非阻断a Ia 2结构域抗体结合在SEQ ID NO: 1的MICA多肽上 的表位，该表位包括一个或两个选自由K81和D82组成的组的残基，一个或两个选自由Q83 和K84组成的组的残基，一个、两个或三个选自由H109、Ylll和Ll 16 (任选地残基Dl 13)组 成的组的残基，一个、两个或三个选自由Q131、S132和Q136组成的组的残基，一个、两个或 三个选自由S133、R134和T137组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由M140、 N141、R143和N144组成的组的残基（例如抗体20C6和10A7)。
[0033] 在一个实施方式中，非阻断a I a 2结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个 或两个选自由R6和N8组成的组的残基，一个或两个选自由E97和H99组成的组的残基，一 个、两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、 T104和R105 (任选地残基E115)组成的组的残基，和/或一个、两个或三个选自由L178、 R179和R180组成的组的残基（例如抗体15F9)。
[0034] 在一个实施方式中，非阻断a I a 2结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个 或两个选自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的Q48和W49组成的组的残基和/或1个、2个、3 个或4个选自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的E51、D52、V53和L54组成的组的残基（例如 抗体6E4)。
[0035] 在另一个实施方式中，本发明尤其源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的 a 3结构域，其中这些抗体不抑制MICA与NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各 自表达在细胞的表面）。任选地，这些抗体不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。任选地，这样 的抗体的特征可以在于不与hNKG2D竞争与MICA的结合。
[0036] 在一个实施方式中，非阻断a 3结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个、两 个或三个选自由S224、H225和D226组成的组的残基，一个、两个或三个选自由T227、Q228 和Q229组成的组的残基，和/或一个或两个选自由W230和D232组成的组的残基（例如抗 体 16A8)。
[0037] 在另一个实施方式中，本发明源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的a 1和 /或a 2结构域并且抑制MICA与NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自表达 在细胞的表面）。任选地这样的抗体的特征可以在于不与hNKG2D竞争与MICA的结合。这 些抗体将任选地抑制sMICA诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调而不实质 阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
[0038] 在一个实施方式中，阻断a I a 2结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个、 两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104 和R105组成的组的残基，一个或两个选自由N121和E123组成的组的残基，和/或一个或 两个选自由T124和E126组成的组的残基（例如抗体19E9、18E8以及10F3)。
[0039] 在一个实施方式中，阻断a I a 2抗体结合这样的表位，该表位包括1个、2个或3 个选自由SEQ ID NO: 1的MICA多肽的N56、K57和T58组成的组的残基，和/或一个或两个 选自由SEQ ID N0:1的MICA多肽的R61和R64组成的组的残基（例如抗体9C10和12A10)。
[0040] 在另一个实施方式中，本发明尤其源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的 a 3结构域，其中这些抗体抑制MICA与NKG2D的相互作用（例如其中MICA和NKG2D被各自 表达在细胞的表面）。任选地，这些抗体不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。任选地，这样的 抗体可以任选地被表征为与hNKG2D竞争与MICA的结合。这些抗体将任选地抑制sMICA诱 导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调。这些抗体可以实质阻断MICA自肿瘤 细胞脱落或可以任选地阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
[0041] 在一个实施方式中，阻断a 3结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个、两个 或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基（抗体14B4)。
[0042] 不希望被理论束缚，相信尽管科学文献假定在MICA(例如，sMICA或膜结合MICA) 和NKG2D下调与效应细胞的损伤之间存在因果关系，但是肿瘤情形（tumor settings)中 的MICA自身不总是导致效应细胞的实质损伤。具体而言，虽然sMICA可以导致NKG2D的下 调，但是在许多情况下出现在体内的sMICA的浓度太低以至于自身不能导致显著的NKG2D 下调（参见实施例9)。此外，在肿瘤情形中（例如确立的疾病或晚期疾病），患者经由多种 非MICA组分（例如TGF-P)通常处于免疫抑制状态，这些组分在其他效应之间具有导致 NKG2D的下调的潜力。因此，阻断或不阻断NKG2D-MICA相互作用并且不抑制MICA脱落的 试剂在癌症的治疗方面是有效的，只要它们能够诱导CDC和/或ADCC。不阻断NKG2D-MICA 相互作用的抗体是有利的，因为MICA表达肿瘤细胞具有保留可被存在的免疫活性效应细 胞上的NKG2D识别的潜力（例如由于在治疗过程中或随后重建免疫活性，对于具有较长持 续时间、重复给予或以高剂量给予的治疗而言）。阻断NKG2D-MICA相互作用的抗体是有利 的，因为此类抗体可以阻止MICA诱导的NKG2D的下调（参见实施例9)。此类阻断抗体对于 具有高水平的可溶性MICA(例如在循环中）的患者的治疗而言可以是特别有用的。
[0043] 在一个实施方式中，本发明提供了 MICA结合化合物，优选与MICA多肽特异性结合 的抗体（抗MICA抗体），而不可检测地减少MICA与NKG2D之间的结合（例如，肿瘤细胞上 的表面MICA与效应细胞上的表面NKG2D的相互作用），例如，而不实质阻断MICA与NKG2D 的相互作用。在一个实施方式中，本发明提供了 MICA结合化合物（例如MICA结合多肽）， 该化合物与MICA多肽结合而不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。在一个实施方式中，本发 明提供了 MICA结合化合物，该化合物与MICA多肽结合而不实质阻断MICA与NKG2D的相互 作用并且不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
[0044] 在另一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体结合人类MICA(特别是 在a 1和/或a 2结构域中）、识别主要的MICA等位基因MICA*001、MICA*004、MICA*008并 且任选地进一步识别MICA #007和/或MICAsnO 19。在一个实施方式中，这些抗体任选地进一 步识别非人灵长类物种（例如食蟹猴）的MICA。在一个实施方式中，这些抗体任选地进一 步识别以下MICB多肽，该多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列。任选地，在另一个实施方 式中，这些抗体不进一步识别MICB。任选地，这些抗体不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。 任选地，这些抗体不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用。
[0045] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与由人类肿瘤细胞表达的糖 基化MICA多肽特异性结合。
[0046] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与由非人灵长类细胞表达的 MICA多肽特异性结合。
[0047] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合（抗 MICA抗体），其中该抗体结合SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽 (MICA*008)。在一个实施方式中，该抗体进一步结合SEQ ID NOl的多肽（MICA*001)。在一 个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合 SEQ ID NO 5的多肽（MICA*019)。在一个实施方式中，该抗体进一步结合SEQ ID NO 3的 多肽（MICA#007)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性 结合，其中该抗体结合SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)、SEQ ID NO 4的多肽（MICA*008)以 及SEQ ID NO 5的多肽（MICA*019)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与 MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO 1的多肽（MICA*001)、SEQ ID NO 2的多 肽（MICA*004)、SEQ ID NO 4 的多肽（MICA*008)以及 SEQ ID NO 5 的多肽（MICA*019)，任选 地进一步其中该抗体结合SEQ ID NO 3的多肽（MICA*007)。通过与跨越MICA等位基因的 类群1和类群2两者的等位基因MICA#001、- #004和#008结合（并且有利地进一步#007和 #〇19)，几乎整个人类群体都将适于用本发明的这样的抗MICA剂的治疗。在任一实施方式 中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括0-聚糖（连接至丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰乳糖胺）。 在任一实施方式中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括核心20-聚糖（包括连接至N-乙酰半 乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的0-聚糖）和/或N联聚糖。在一个实施方式中，该抗体与 MICA多肽结合而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用和/或不实质阻断MICA自肿瘤细 胞脱落。在一个实施方式中，该抗体结合MICA的a 1和/或a 2结构域。在一个实施方式 中，该抗体结合MICA的a 3结构域。
[0048] 优选地，该化合物是一种抗体，任选地包括两条Ig重链和两条Ig轻链的四聚体抗 体。优选地，针对人类MICA多肽，该抗体具有小于10_ 9M，优选小于KTwM或优选小于KT11M 的结合亲和力（Kd)，任选地其中结合亲和力是二价的。优选地，该抗体是一种消耗性抗体， 任选地其中该抗体针对MICA表达肿瘤细胞诱导ADCC和/或⑶C。
[0049] 在一个【具体实施方式】中，本发明提供了一种抗体，该抗体通过NK或T细胞介导 MICA表达肿瘤细胞的消耗（例如在体外或在体内）而不实质抑制NKG2D介导的hNKG2D表 达NK或T细胞的细胞毒性。
[0050] 在一个【具体实施方式】中，本发明的抗体不与hNKG2D竞争与MICA的结合。
[0051] 在一个【具体实施方式】中，当本发明的抗体结合至MICA表达细胞上的MICA时，该 MICA表达细胞经由例如刺激hNKG2D的下调和/或内化而在结合后不实质减少细胞表面 hNKG2D的量，具有高亲和力和缓慢的解离率，与食蟹猴和/或恒河猴MICA交叉反应，并且具 有消耗性同种型（如例如人类IgGl)。
[0052] 在一个方面中，本发明提供了特异性结合MICA的抗体，其中该抗体具有以下特性 中的一个或多个（包括其任何组合，或全部特性）：
[0053] (a)针对与MICA多肽的结合而言，具有小于KT8M,优选小于KT9M,或优选小于 KTiciM的Kd ;
[0054] (b)与对应于以下结构域的残基的区段中的至少一个残基结合，该结构域选自下 组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的1-88、89-181和182-274和/或与 如在此所描述的表位（MICA上的一个或多个氨基酸残基）结合；
[0055] (c)与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的两个、三个、四个或五个结合， 分别包括SEQ ID NO: 1-5的序列；
[0056] (d)不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落；
[0057] (e)不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用（例如，肿瘤细胞上的表面MICA与效应 细胞上的表面NKG2D的相互作用）；
[0058] (f)不导致由效应细胞（例如，NKG2D+⑶16-NK细胞）溶解的MICA表达细胞的实 质降低；
[0059] (g)针对在其表面表达MICA的细胞，诱导补体依赖性细胞毒性（CDC)和/或抗体 依赖性细胞毒性（ADCC);以及
[0060] (h)与抗体 6E4、20C6、16A8、15F9 以及 10A7 竞争结合 MICA 多肽。
[0061] 在本文实施方式的任一个中，本发明抗体的特征可以在于以上（a)-(h)中的任何 一个或多个特征。
[0062] 在一个实施方式中，提供了一种测试抗MICA抗体的方法，所述方法包括：（i)评价 该抗体是否阻断MICA自MICA表达细胞脱落和/或（ii)评价该抗体是否阻断MICA与NKG2D 的相互作用。步骤（i)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与表达MICA多肽的细胞 接触。步骤（ii)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与MICA多肽（例如分离的多 肽或表达于细胞的表面上的多肽）在NKG2D多肽（例如分离的多肽或表达于细胞的表面上 的多肽）的存在下接触。
[0063] 在另一个实施方式中，提供了一种产生抗体的方法，该抗体结合哺乳动物对象体 内的MICA多肽，任选地用于癌症的治疗，所述方法包括以下步骤：a)提供多个抗体，任选地 用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；并且b)进行一个选择步骤以从该多个抗体 中选择抗体，该步骤包括：
[0064] (i)测试抗体是否与人类MICA多肽结合，任选地SEQ ID NO 1-5的多肽中的一个、 两个、三个、四个或所有，并且如果该抗体与这一种或多种人类MICA多肽结合，则选择该抗 体；和/或
[0065] (ii)测试抗体是否阻断MICA自MICA表达细胞脱落，并且如果该抗体不阻断脱落， 则选择该抗体；和/或
[0066] (iii)测试抗体是否阻断MICA (例如表面MICA)与NKG2D的相互作用，优选地测试 其中该抗体是否导致由效应细胞（例如，NKG2D+CD16-NK细胞）溶解的MICA表达细胞的实 质降低，并且如果该抗体不阻断MICA (例如表面MICA)与NKG2D的相互作用，优选地其中该 抗体不导致MICA表达细胞的溶解的实质降低，则选择该抗体。
[0067] 在一个方面中，本发明尤其源自阻断性抗MICA抗体的发现，这些抗体跨越来自两 个主要类群的MICA等位基因的主要人类MICA非人灵长类（以及在非人灵长类MICA和MICB 上）具有高亲和力。在一个实施方式中，MICA类群的特征在于该MICA多肽的位置129处 的甲硫氨酸（M)或缬氨酸（V)残基的存在，其中M与强烈结合NKG2D的MICA形式相关并且 V与较低的结合NKG2D相关。在一个实施方式中，本发明提供了以下阻断抗体，这些阻断抗 体与在位置129处具有甲硫氨酸的MICA等位基因和在位置129处具有缬氨酸的MICA等位 基因交叉反应。在一个方面中，本发明提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体与在位置129 处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽特异性结 合，其中所述抗体抑制MICA介导的hNKG2D活性。在一个实施方式中，该抗体进一步与在位 置152处具有缬氨酸的MICB多肽结合（例如，与SEQ ID NO: 1的MICB多肽结合）。优选 地，所述抗体抑制MICB介导的hNKG2D活性。报道在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽显 示出与可溶性NKG2D的强烈结合。结合在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽以及在位置 129处具有甲硫氨酸的MICA多肽的抗体在以下个体中可以是有利的，这些个体具有较大的 敏感性或由与NKG2D强烈结合的等位基因引起的严重疾病。
[0068] 本发明的阻断性抗MICA抗体还与来自两个主要MICA类群中的每一个的一个或多 个高普遍性等位基因交叉反应（结合），这两个主要MICA类群被确定代表MICA的主要家 族：强烈结合NKG2D的类群1等位基因（包括MICA*001、*002、*007、*012、*017以及*018)和 微弱结合NKG2D的类群2等位基因（MICA*004、*006、*008、*009以及*019)。通过与存在于 亚群MICAsnOOI、#004、#007、#008以及 #019上的表位结合，这些抗体覆盖存在于几乎全部个体 中的两个类群的等位基因。MICA的类群1等位基因通常在残基129处具有M，而类群2等 位基因在残基129处具有V。
[0069] 在另一个方面中，本发明尤其源自以下发现，跨越MICA(以及在非人灵长类MICA 和MICB上）针对某些表位的抗体在NKG2D阻断方面比其他抗MICA抗体或抗NKG2D抗体显 著更有效，并且还比由其结合MICA的能力预期的更有效地阻断NKG2D介导的细胞毒性。具 体而言，具有皮摩尔范围内的亲和力的抗MICA抗体在抑制方面比具有2-log较少亲和力 (Kd)的抗MICA抗体好4-log。
[0070] 本发明的阻断性MICA抗体可以由阻止与NKG2D的任何竞争、被其置换、或其残留 结合的能力表征。其他高亲和力NKG2D或MICA抗体可以通过其配体（例如分别为MICA/ ULPBs/RAETl或NKG2D)留下一些开放的置换。而且，如由NKG2D-MICA相互作用的晶体结 构所观察到的，NKG2D作为同源二聚体起作用并且具有两个对称表面（每条NKG2D链上一 个），这些表面与MICAa I a 2平台结构域的顶部相互作用。这两条NKG2D链通过结合至不 对称MICA平台结构域的明显不同的表面都有助于该相互作用（参见例如，Li(李）等人 (2001)Nature Immunol.(自然免疫学）2(5):443-450)。本发明的这些抗体因此可以任选 地完全阻断MICA-NKG2D相互作用，例如通过阻断（例如干扰、竞争）NKG2D同源二聚体中的 两个NKG2D单体与MICA多肽的结合。其他MICA抗体（或NKG2D抗体）可以仅完全阻断两 个NKG2D结合位点中的一个。
[0071] 除了当被用作消耗性抗体（例如IgGl或IgG3同种型）其用于消耗MICA表达细 胞的用途以外，用本发明的阻断性抗MICA抗体进行治疗为靶向相信由MICA和/或B介导 的NKG2D的激活驱动的炎性病症中的MICA(和MICB)提供了一种手段，而不减少引起不想 要的更宽的免疫系统抑制，通过减少可供与其他配体（例如ULBP)的结合使用的NKG2D受 体的数目以及随后的激活。此类完全阻断性抗MICA抗体的可能性还打开了向炎症位点局 部递送抗MICA抗体的可能性（例如，递送进关节炎患者的炎症的关节或其他位点），而不导 致由NKG2D抗体的给予引起的泛发性免疫抑制效应。
[0072] 在一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体在体外和体内抑制MICA表 达细胞的效应细胞（例如NK细胞和/或T细胞）溶解方面是有效的并且实质阻断MICA与 NKG2D的相互作用。
[0073] 在一个实施方式中，特别是当用于治疗炎性障碍或自身免疫性障碍时，本发明的 抗体是一种非消耗性抗体，该非消耗性抗体实质减少或抑制NKG2D激活、NKG2D信号转导、 NKG2D表达NK或T细胞的激活、或效应细胞（例如，NKG2D+⑶16-NK细胞）对MICA表达细 胞的溶解。
[0074] 在一个实施方式中，本发明提供了一种MICA结合化合物，优选与MICA多肽特异性 结合并且减少（例如基本消除）MICA与hNKG2D之间的结合（例如，细胞上的表面MICA与 效应细胞的表面NKG2D的相互作用）的抗体（抗MICA抗体）。
[0075] 在一个实施方式中，抗MICA抗体或结合化合物进一步与MICB多肽特异性结合并 且减少（例如基本消除）MICB与hNKG2D之间的结合。
[0076] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与hNKG2D竞争与MICA(以及 任选地MICB)结合并且阻止hNKG2D与MICA (以及任选地MICB)结合。
[0077] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体抑制或阻断MICA(以及任选 地MICB)多肽与hNKG2D同源二聚体的两条hNKG2D链的相互作用。任选地，该抗体阻断 MICA多肽（以及任选地MICB多肽）的a 1结构域和MICA多肽（以及任选地MICB多肽） 的a 1结构域两者与hNKG2D同源二聚体的相互作用（例如，该抗体抑制MICA a I a 2平台 与hNKG2D同源二聚体的两条hNKG2D链的相互作用）。
[0078] 在一个实施方式中，本发明的抗体不实质与HCMV、UL18、ULBP 1、ULBP2、ULBP 3、 ULBP 4、ULBP 5或ULBP 6多肽结合（参见Champsaur (沙姆普斯劳）等人（2010) Immunol. Rev.(免疫学评论）235:267-285)。
[0079] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与在位置129处具有甲硫氨 酸的人类MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）和在位置129处具有缬氨酸的人类 MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）上的共同决定子特异性结合，任选地进一步与 在位置152处具有缬氨酸的人类MICB多肽（例如天然存在的MICB等位基因）上的共同决 定子特异性结合，其中该抗体减少（例如基本消除）MICA与NKG2D之间（以及任选地MICB 与NKG2D之间）的结合。
[0080] 在另外的实施方式中，本发明尤其源自以下抗体的发现，这些抗体结合人类MICA， 优选在a la2平台结构域（即a 1和/或ci2结构域）中，并且识别主要的MICA等位基 因MICA*001、MICA*004、MICA*008并且任选地进一步识别MICA*007和/或MICA*019,并且任 选地进一步识别非人灵长类物种（例如食蟹猴）的MICA，并且任选地进一步识别MICB。在 一个实施方式中，这些抗体进一步识别以下MICB多肽，该多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸 序列。任选地，这些抗体此外不实质抑制MICA自肿瘤细胞脱落。
[0081] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合（抗 MICA抗体），其中该抗体减少（例如基本消除）MICA与NKG2D之间的结合并且该抗体结合 SEQ ID NO 2的多肽（MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽(MICA*008)。在一个实施方式中， 该抗体进一步结合SEQ ID NO: 1的多肽（MICAsnOOI)。在一个实施方式中，本发明提供了一 种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO: 5的多肽（MICA#019)。 在一个实施方式中，该抗体进一步结合SSEQ ID N0:3的多肽（MICA#007)。在一个实施方式 中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO: 2 的多肽（11〇六*004)、5￡〇10勵:4的多肽（]\0〇六*008)以及5￡〇10勵:5的多肽（]\0〇六*019)。 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体 结合 SEQ ID N0:1 的多肽（MICA*001)、SEQ ID N0:2 的多肽（MICA*004)、SEQ ID N0:4 的 多肽（MICA*008)以及SEQ ID N0:5的多肽（MICA*019)，任选地进一步其中该抗体结合SEQ ID NO: 3的多肽（MICA*007)。通过与跨越MICA等位基因的类群1和类群2两者的等位基 因MICA#001、- #004和#008结合（并且有利地进一步#007和#019)，几乎整个人类群体都将 适于用本发明的这样的抗MICA剂的治疗。在一个实施方式中，该抗体结合MICA的a 1和 /或a 2结构域。
[0082] 优选地，该化合物是一种抗体，任选地包括两条Ig重链和两条Ig轻链的四聚体抗 体。
[0083] 优选地，针对人类MICA和/或MICB多肽（例如在此述及的MICA和/或MICB等 位基因中的任何一个或多个或所有），该抗体具有小于KT 9M,优选小于KTwM,优选小于 KT11M,优选小于KT12M,或优选小于KT 13M的结合亲和力（Kd)，任选地其中结合亲和力是单 价的或二价的。优选地，该抗体是包括两条Ig重链和两条Ig轻链的四聚体抗体并且K d是 二价的。任选地，对于与表达具体的MICA和/或MICB多肽（例如在此述及的MICA和/或 MICB等位基因中的任何一个或多个或所有）的细胞的结合而言,该抗体具有至多IOii g/ ml、5ii g/ml或Iii g/ml的EC50。适合的细胞的实例是ClR-MICA细胞。
[0084] 在一个实施方式中，特别是当该抗体被用于治疗或预防炎性疾病或自身免疫性疾 病时，该化合物是非消耗性抗体（不消耗结合至其上的细胞的抗体）。优选地，该抗体是嵌 合抗体、人源化抗体或人类抗体。优选地，该抗体不包括能够被Fcy3A受体（CD16)结合的 恒定区，例如人类IgG4亚型的抗体或缺少Fc结构域的抗体片段。优选地，该抗体包括人类 IgG4同种型的重链恒定区。
[0085] 在一个实施方式中，该抗体与由非人灵长类细胞表达的MICA多肽特异性结合。在 一个【具体实施方式】中，本发明的抗体对于结合人类MICA而言具有高亲和力和缓慢的解离 率，并且与食蟹猴（cynomolgus，Macaca fascicularis)和/或恒河猴（称猴）MICA交叉反 应。
[0086] 在一个方面中，本发明提供了特异性结合MICA的抗体，其中该抗体具有以下特性 中的一个或多个（包括其任何组合，或全部特性）：
[0087] (a)对于与MICA多肽的结合而言，具有小于KT9M,优选小于KTkiM,优选小于 KT11M,优选小于10_12M，或优选小于KT13M的K D，优选地其中针对每个MICA多肽等位基因 MICA#001、#004和#008,优选地进一步针对#007和/或 #019,该抗体具有所述Kd的亲和力； [0088] (b)与对应于以下结构域的残基的区段中的至少一个残基结合，该结构域选自下 组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的1-88或89-181，和/或与如在此所 描述的表位（MICA上的残基）结合；
[0089] (c)与在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽（例如天然存在的MICA等位 基因）和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽（例如天然存在的MICA等位基因）结 合，其中该抗体减少（例如基本消除）MICA与NKG2D之间的结合；和/或与在位置152处具 有缬氨酸的人类MICB多肽（例如天然存在的MICA等位基因）结合；
[0090] (d)与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的两个、三个、四个或五个结合， 分别包括SEQ ID NO: 1-5的序列；
[0091] (e)不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落；
[0092] (f)抑制和/或实质阻断MICA与NKG2D的相互作用（例如，肿瘤细胞上的表面 MICA与效应细胞上的表面NKG2D的相互作用），任选地其中这些抗体阻断MICA与NKG2D同 源二聚体内的两条NKG2D链的相互作用；
[0093] (g)能够减少或抑制MICA介导的NKG2D激活、NKG2D信号转导、NKG2D表达NK或 T细胞的激活、或效应细胞（例如，NKG2D+⑶16-NK细胞）对MICA表达细胞的溶解；
[0094] (h)针对在其表面表达MICA的细胞，实质诱导或不实质诱导（例如，取决于该mAb 是否被CD16发现，取决于该抗体的Fc区的性质）补体依赖性细胞毒性（CDC)和/或抗体 依赖性细胞毒性（ADCC);
[0095] (i)能够减少或抑制sMICA介导的NKG2D在NKG2D表达细胞（例如T细胞或NK细 胞）的表面上的表达的下调；
[0096] 以及
[0097] (j)与抗体 9C10、19E9、12A10、18E8 或 10F3 竞争与 MICA 多肽的结合。
[0098] 在本文实施方式的任一个中，本发明抗体的特征可以在于以上（a)-(j)中的任何 一个或多个特征。
[0099] 在一个实施方式中，提供了一种测试抗MICA抗体的方法，所述方法包括：（i)评价 该抗体是否以商未和力与在残基129处具有甲硫氣酸的MICA多肤和在残基129处具有缴 氨酸的MICA多肽两者（以及任选地进一步，在残基152处具有甲硫氨酸的MICB多肽）结 合，并且（ii)评价该抗体是否阻断MICA (以及任选地MICB)与NKG2D的相互作用。在一个 实施方式中，提供了一种测试抗MICA抗体的方法，所述方法包括：⑴评价该抗体是否以高 亲和力与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的两个、三个、四个或五个结合，这些多 肽分别包括SEQ ID NO: 1-5的序列并且（ii)评价该抗体是否阻断MICA与NKG2D的相互作 用。步骤（i)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与表达MICA多肽的细胞接触。步 骤（ii)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与MICA多肽（例如分离的多肽或表达 于细胞的表面上的多肽）在NKG2D多肽（例如分离的多肽或表达于细胞的表面上的多肽） 的存在下接触。在步骤（i)中结合所述MICA多肽并且在步骤（ii)中阻断MICA与NKG2D 的相互作用的抗体可以被鉴定和/或选择为用于炎性障碍或自身免疫性障碍的候选治疗。
[0100] 在另一个实施方式中，提供了一种产生抗体的方法，该抗体结合哺乳动物对象体 内的MICA多肽，任选地用于癌症的治疗，所述方法包括以下步骤：a)提供多个抗体，任选地 用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳动物或产生抗体的噬菌体展示文库；并且b)进行 一个选择步骤以从所述多个抗体中选择抗体，该步骤包括：
[0101] ⑴测试抗体是否以高亲和力与人类MICA多肽，任选地MICA*001、*004、*007、*008 以及*019等位基因中的一个、两个、三个或所有，例如分别包括SEQ ID NO: 1-5的序列的多 肽结合，并且如果抗体以高亲和力与所述MICA多肽结合，则选择该抗体；和/或
[0102] (ii)测试抗体是否阻断MICA(例如，表面MICA，MICA*001、*004、*007、*008 #&*019 等位基因中的任何一个、两个、三个或所有）与hNKG2D的相互作用，和/或是否减少或抑制 NKG2D激活、NKG2D信号转导、NKG2D表达NK或T细胞的激活、或效应细胞（例如，NKG2D+T 细胞、NKG2D+CD16+NK细胞、NKG2D+CD16-NK细胞）对MICA表达细胞的溶解，并且如果抗体 阻断MICA与hNKG2D的相互作用，则选择该抗体；和/或。
[0103] (iii)当NKG2D表达细胞与可溶性MICA多肽在抗体的存在下进行接触时，测试该 抗体是否减少或抑制所述NKG2D表达细胞中的NKG2D下调（降低细胞表面表达），并且如果 抗体减少或抑制NKG2D下调，则选择该抗体。
[0104] 该方法可以任选地包括选择步骤（iv)，其包括测试抗体是否阻断MICA自MICA表 达细胞脱落，并且如果该抗体不阻断脱落，则选择该抗体。
[0105] 在一个实施方式中，本发明的抗体结合表位，该表位包括选自以下组的人类MICA 多肽的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、 Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、 D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、 S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 以及 D232(参照 SEQ ID NO 1-5 中的任一个的 MICA)。
[0106]在一个实施方式中，本发明提供了 MICA结合化合物（优选抗MICA抗体），该化合 物至少部分地、或任选地完全地结合在MICA多肽的a 1和/或a 2结构域内。a 1和a 2 结构域分别位于氨基酸残基1至88 (任选地1-85)和89至181 (任选地86-181)内，参照 SEQ ID NO 1的MICA多肽。任选地，在本文实施方式的任一个中，该抗体与在MICA多肽的 a 1结构域内的氨基酸残基（SEQ ID NO 1的残基氨基酸残基1至88 (任选地1-85))结合。 任选地，在本文实施方式的任一个中，该抗体与在MICA多肽的a 2结构域内的氨基酸残基 (SEQ ID NO 1的残基氨基酸残基89至181 (任选地86-181))结合。任选地，在本文实施方 式的任一个中，该抗体与MICA多肽的a 1和a 2结构域内的氨基酸残基结合。
[0107] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由Q48和W49组成 的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由E51、D52、V53和L54组成的组的残基（抗 体 6E4)。
[0108] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括1个、2个或3个选自由N56、K57和 T58组成的组的残基，和/或一个或两个选自由R61和R64组成的组的残基（抗体9C10和 12A10)。
[0109] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由K81和D82组成 的组的残基，一个或两个选自由Q83和K84组成的组的残基，一个、两个或三个选自由H109、 Ylll和L116 (任选地残基D113)组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S133、R134和 T137组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由M140、N141、R143和N144组成 的组的残基（抗体20C6)。
[0110] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由K81和D82组成 的组的残基，一个或两个选自由Q83和K84组成的组的残基，一个、两个或三个选自由H109、 Ylll和L116(任选地残基D113)组成的组的残基，一个、两个或三个选自由Q131、S132和 Q136组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由M140、N141、R143和N144组成 的组的残基（抗体10A7)。
[0111] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个、两个或三个选自由E100、 DlOl和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105组成的组的残 基，一个或两个选自由N121和E123组成的组的残基，和/或一个或两个选自由T124和E126 组成的组的残基（抗体19E9和18E8)。
[0112] 在一个实施方式中，这些抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由R6和N8 组成的组的残基，一个或两个选自由E97和H99组成的组的残基，一个、两个或三个选自由 E100、DlOl和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105 (任选地 残基E115)组成的组的残基，和/或一个、两个或三个选自由L178、R179和R180组成的组 的残基（抗体15F9)。
[0113] 在一个实施方式中，本发明提供了 MICA结合化合物（优选抗MICA抗体），该化合 物至少部分地结合在MICA多肽的a 3结构域内。a 3结构域分别位于氨基酸残基182至 274内，参照SEQ ID NO 1的MICA多肽。在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一 个、两个或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基（抗体14B4和16A8)。在一个 实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个、两个或三个选自由S224、H225和D226组成的 组的残基，一个、两个或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基，和/或一个或两个 选自由W230和D232组成的组的残基（抗体16A8)。
[0114] 任选地，与SEQIDNO: 1的野生型MICA多肽的结合相比，该抗体与在a1和/或 a2结构域内的上述残基中的任一个处具有突变的MICA多肽的结合被实质减少。
[0115] 本发明提供抗MICA抗体的使用对于例如人类对象的癌症、炎性障碍以及自身免 疫性障碍的治疗而言可以是有用的。
[0116] 在一个方面中，不抑制NKG2D与MICA之间的相互作用的抗体、或抑制NKG2D与 MICA之间的相互作用的抗体将是消耗性抗体。此类抗体在癌症的治疗方面是特别有用的， 但是也可以用于炎症和自身免疫性障碍。抗体可以在或不在偶联至毒剂或其他试剂的情况 下使用，取决于这些抗体的所希望的效果或用途。在一个实施方式中，该抗MICA抗体是"裸 抗体"并且未被偶联至毒剂，任选地该裸抗体包括被修饰以增加与Fe Y受体（例如CD16) 的结合的Fc区。在一个实施方式中，裸抗体或偶联抗体包括重链，该重链包括结合Fcy受 体（例如⑶16)的人类Fc区（例如IgGl)。任选地，针对在其表面表达MICA的细胞，这样 的抗体诱导补体依赖性细胞毒性（CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性（ADCC)。
[0117] 任选地，在任一实施方式中，该抗体（例如IgGU抗体片段等）进一步包括对细胞 有毒的毒剂（例如化疗剂）。
[0118] 在一个方面中，抑制MICA诱导的NKG2D在效应细胞中的活性的抗体将是非消耗性 抗体（不消耗结合至其上的细胞的抗体）。在一个方面中，该抗体是嵌合抗体、人源化抗体 或人类抗体。在一个方面中，该抗体不包括能够被Fcy3A受体（CD16)结合的恒定区，例如 人类IgG4亚型的抗体或缺少Fc结构域的抗体片段。在一个实施方式中，该抗体包括IgG4 重链，根据EU索引（EU-index)，该重链在残基228中包含丝氨酸至脯氨酸突变。优选地，该 抗体包括人类IgG4同种型的重链恒定区。此类抗体在炎症和自身免疫性障碍的治疗方面 是特别有用的。
[0119] 本披露进一步提供了特异性结合人类MICA的抗体、抗体片段以及衍生物。本发明 提供了此类抗体组合物，同样提供了它们在本发明的这些方法的任一个中治疗、预防以及 诊断癌症、炎性障碍以及自身免疫性障碍的用途。
[0120] 在一个实施方式中，针对人类MICA多肽（例如，SEQ ID NO 1-5的MICA*001、*004、 *007、*008以及*019等位基因中的一个、两个、三个或所有的多肽，优选地针对MICA*001、 #004以及#008中的每一个）而言，这些抗体具有小于10_8M，优选小于10_ 9M，或优选小于 KT10M的结合亲和力（Kd)。
[0121] 在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体可以具有重链和/或轻链， 该重链和/或轻链具有一个、两个或三个选自下组的抗体的对应的重链和/或轻链的 CDR,该组由以下各项组成：6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 以及 14B4。
[0122] 在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体与以下单克隆抗体中的任 一个或任何组合竞争与MICA多肽的结合，这些单克隆抗体是6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、 12A10、10A7、18E8、10F3、15F9以及14B4。在一个实施方式中，本发明的抗体与选自下组的 抗体竞争与MICA多肽的结合，该组由以下各项组成：
[0123] (a)分别具有SEQ ID NO: 7和8的VH和VL区的抗体（6E4);
[0124] (b)分别具有SEQ ID NO: 20和21的VH和VL区的抗体（20C6);
[0125] (c)分别具有SEQ ID NO: 33和34的VH和VL区的抗体（16A8);
[0126] (d)分别具有SEQ ID NO:46和47的VH和VL区的抗体（19E9);
[0127] (e)分别具有SEQ ID NO: 57和58的VH和VL区的抗体（9C10);
[0128] (f)分别具有SEQ ID NO:68和69的VH和VL区的抗体（12A10);
[0129] (g)分别具有SEQ ID NO: 79和80的VH和VL区的抗体（10A7);
[0130] (h)分别具有SEQ ID NO:90和91的VH和VL区的抗体（18E8);
[0131] ⑴分别具有SEQ ID NO: 101和102的VH和VL区的抗体（10F3);
[0132] (j)分别具有SEQ ID NO: 112和113的VH和VL区的抗体（15F9);以及
[0133] (k)分别具有 SEQ ID NO: 123 和 124 的 VH 和 VL 区的抗体（14B4)。
[0134] 在一个实施方式中，该抗体是适合人类的。在一个实施方式中，该抗体是嵌合的， 例如包含非鼠类（优选人类）恒定区。在一个实施方式中，该抗体是人类的或人源化的。 在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体的同种型是人类IgG，任选人类IgGU 1 862、1863或1864。在一个实施方式中，该抗体包括人类？(3结构域或具有被？(：￥1?(例如 Fe YRIIIA)结合的同种型，例如IgGl或IgG3同种型的抗体。
[0135] 在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体是选自以下各项的抗体片 段：Fab、Fab' 4&13'-3114(&13'）2、？1双抗体、单链抗体片段、或包括多个不同抗体片段的多 特异性抗体。任选地，本发明的抗体此外是四聚体的（两条重链和两条轻链）并且因此是 二价的（例如IgG抗体）。
[0136] 在某些实施方式中，本发明的这些抗体进一步包括毒剂。在一个实施方式中，这些 抗体包括能够直接导致表达MICA的细胞死亡的毒剂。在一个实施方式中，例如在体外测定 中，这些抗体能够直接诱导（例如不存在免疫效应细胞时）至少20%、30%、40%或50% MICA表达细胞的细胞死亡。
[0137] 在一个方面中，本发明提供了使用本发明的抗MICA抗体进行治疗的方法。这些抗 体可以被用作预防性或治疗性治疗；在本文实施方式的任一个中，治疗有效量的该抗体可 以与预防有效量的抗体交换。在一个方面中，本发明提供了一种治疗罹患癌症、自身免疫 性障碍或炎性障碍的患者的方法，该方法包括向该患者给予药学有效量的根据本发明的与 MICA多肽特异性结合的抗原结合化合物。
[0138] 本发明的治疗方法以及根据本发明的抗MICA抗体可以被用于与第二治疗剂组合 治疗个体，该第二治疗剂包括当用于治疗癌症时的抗癌剂（例如化疗药物、肿瘤疫苗、与肿 瘤细胞上的肿瘤特异性抗原结合的抗体、针对肿瘤细胞诱导ADCC的抗体、增强免疫应答的 抗体等），或用于治疗自身免疫或炎症的试剂。在一个实施方式中，该第二治疗剂是结合并 激活活化受体或结合并阻断效应细胞（例如NK细胞、T细胞）上的抑制性受体的试剂（例 如抗体）。在一个实施方式中，该第二治疗剂是上调NKG2D配体在肿瘤细胞上的表达的试 剂（例如化疗剂）。例如，可以使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，丙戊酸钠和肼酞嗪增加 MICA/B表达并且降低脱落。（Chavez-Bianco (查韦斯-布兰科）2011Int J Oncol(国际肿 瘤学杂志）39 (6) : 1491-1499)。
[0139] 循环中增加水平的sMIC的存在与预后不良和/或MIC表达肿瘤相关。本发明进 一步涉及用于选择罹患对使用本发明的抗MICA剂（例如与MICA多肽结合的抗体）的治疗 应答的癌症的对象的方法，该方法包括确定所述对象体内的肿瘤细胞是否放出（shed)MICA 多肽（例如，如通过循环中的sMIC的水平所评价的），MICA多肽自肿瘤细胞脱落的存在是 应答对象的指征。
[0140] 本发明进一步涉及一种用于选择摧患对使用本发明的抗MICA剂（例如与MICA多 肽结合的抗体）的治疗应答的障碍（例如，癌症、自身免疫性障碍、炎性障碍）的对象的方 法，该方法包括确定所述对象体内的细胞（例如肿瘤细胞、前炎性细胞等）是否表达MICA 多肽，MICA多肽的表达是应答对象的指征。在一个实施方式中，该方法包括确定所述对象 体内的细胞（例如肿瘤细胞、前炎性细胞等）是否表达选自由SEQ ID NO 1-5组成的组的 MICA多肽。在一个实施方式中，该方法包括确定所述对象体内的细胞是否表达选自下组的 MICA多肽，该组由以下各项组成：MICA #001、#004、#007、#008以及#019多肽，这些多肽分别 包括SEQ ID NO: 1-5的序列，其中MICA多肽的表达是应答对象的指征。在一个实施方式 中，确定所述对象体内的细胞是否表达MICA多肽的步骤包括使来自该对象的生物样品（例 如，通过进行活检和/或获得癌细胞细胞、血液或任何组织样品等）与本发明的抗MICA抗 体（例如与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的一个、两个、三个、四个或所有结 合的抗体）接触。在一个实施方式中，该方法包括确定所述对象是否包括脱落的MICA(例 如检测循环中的sMICA或检测外来体（例如，等位基因 #008)的表面上的MICA的存在）。
[0141] 任选地，在这些方法的任一个中，该方法进一步包括向应答对象给予与MICA多肽 结合的抗体（例如本发明的抗MICA抗体）。
[0142] 在一个优选实施方式中，使用MICA特异性配体确定MICA多肽在疾病相关细胞中 的表达。优选地，该配体是抗体或其片段或衍生物。
[0143] 在另一个方面中，本发明包括一种方法（例如，一种进行诊断测定、应答测定等的 方法），该方法包括评价患者是否具有表达MICA多肽（例如被本发明的抗体结合的MICA多 肽（一个或多个MICA等位基因））的疾病相关细胞（例如，肿瘤细胞）。所述方法可以包括 例如从包括疾病相关细胞的患者获得生物样品，使所述疾病相关细胞与这样抗体接触并且 评价该抗体是否与疾病相关细胞结合。疾病相关细胞表达MICA的发现表明该患者罹患由 MICA表达细胞表征和/或适于用本发明的抗MICA抗体治疗的病症。可以进一步用适于由 MICA表达细胞表征的具体疾病的疗法治疗该患者。任选地，用该抗MICA抗体治疗该患者。 在一个实施方式中，该方法用于选择罹患癌症的对象，并且这些疾病相关细胞是癌细胞。
[0144] 本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括：
[0145] a)确定该患者是否具有致病的MICA表达细胞，并且
[0146] b)如果确定该患者具有致病的MICA表达细胞，则给予本发明的抗原结合化合物 (例如，抗体）。
[0147] 本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括：
[0148] a)确定该患者体内脱落的MICA的水平，并且
[0149] b)如果确定该患者具有升高水平的脱落的MICA，则给予本发明的抗原结合化合 物（例如，抗体），该化合物抑制sMICA导致NKG2D在免疫效应细胞上的下调的能力。
[0150] 可以在别处进一步描述本发明的这些以及另外的有利方面和特征。
[0151] 附图简述
[0152] 图IA和IB示出了获得自第一、第二以及第三免疫系列的抗体与MICA表达CRl转 染子细胞 C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007 以及 C1R-MICA*008 的结合，如通过流 式细胞术所分析。
[0153] 图2A-2G示出了 MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这 些突变的氨基酸残基导致（以不同组合）抗体结合的损失。NKG2D结合位点示于中等阴影 的MICA多肽的顶部（并且还在结合至MICA的带状图（ribbon diagram)中）。
[0154] 图3示出了叠合的传感图，示出了单独在NKG2D-FC芯片上注射MICAWl-BirA或 与同种型对照或嵌合的抗MICA抗体一起预温育。在注射结束时，将传感图在Y轴归一化并 且在X轴对齐。传感图代表两个独立的实验。
[0155] 图4示出了针对MICA-NKG2A阻断的功能测定的结果，示出了抗MICA抗体减少或 抑制NKG2D+CD16-NK92细胞介导的MICA*019转染的BaF/3的杀伤的能力，如通过测量靶细 胞释放的 51Cr所确定。
[0156]图 5A、5B 和 5C 示出了叠合的传感图，示出了在 ULBP-l-Fc(Fcl)、MICB-Fc(Fc2)、 ULBP-2-Fc (Fc3)以及ULBP-3-Fc (Fc4)上注射抗MICA抗体。在注射开始时，将传感图在X 轴对齐。
[0157] 图6示出了抗MICA抗体与食蟹猴MICA的结合。
[0158] 图7示出了在针对阻断MICA脱落的能力的测定中，由抗a 3结构域BAM03而非由 16A8介导的MICA脱落的抑制，如通过在将MICA表达细胞与抗MICA抗体温育过夜后测量上 清液中可溶性MICA浓度所评价。
[0159] 图8显示NKG2D在增加剂量的重组体二价MICA#019 #Fc蛋白（R&D系统）的存在下 被下调了其初始水平的30%至40%，并且显示在实施例5B的细胞毒性测定（表E)中阻断 NKG2D-MICA相互作用的抗MICA抗体阻断表达于NK细胞上的NKG2D与MICA*019-Fc的相互 作用，从而逆转由MICA #019-Fc蛋白诱导的NKG2D下调。
[0160] 图9示出了指示Raji-MICAWl细胞在人类补体的存在下的生活力。结果显示抗 MICA(同种型匹配的）导致死细胞数目增加并且能够以表位依赖性方式诱导CDC。
[0161] 图IOA显示与阴性对照（人类IgGl同种型对照抗体）相比，抗MICA各自通过人 类KHYG-Ih⑶16V NK细胞系诱导C1R-MICA*008细胞的特异性溶解，由此显示这些抗体针对 MICA#008表达靶细胞诱导ADCC。图IOB示出了结合至细胞的抗体的水平。
[0162]图11示出了在小鼠长期RAJI-MICA#01肿瘤模型中的测试的结果。用嵌合的抗 MICA或 IC(300iig IP 2x/周，持续3 周）或PBS 处理植入 Raji-MICAOl Highl5M IV 的 Nod SCID小鼠的存活。本发明的抗MICA抗体增加存活。
[0163] 发明详述
[0164] 介绍
[0165] 本发明的抗体能够直接并特异性靶向MICA表达细胞，值得注意地是肿瘤细胞以 及在炎性或自身免疫过程中涉及的细胞。本发明提供了多种具有这样的特性的抗体，这些 抗体结合类群1和类群2等位基因两者并且此外跨越这些类群内的主要人类MICA等位基 因。进一步提供了用于具体途径的不同抗体。一些抗体阻断MICA-NKG2D相互作用并且阻 止可溶性MICA(sMICA)诱导的NKG2D表面表达的下调；这些抗体由此用于重建患者体内 的NKG2D表达。此类抗体还可以由于其阻断由被淋巴细胞上的NKG2D结合MICA而导致的 NKG2D激活的能力而被使用并且在炎症和自身免疫性障碍的治疗方面将是特别有利的。其 他抗体不与NKG2D竞争与MICA的结合并且在其中希望维持NKG2D对效应细胞的功能的情 况下的癌症的治疗方面将是有利的。任选地，这些抗体将不阻断MICA自MICA表达肿瘤细 胞脱落。任选地，这些抗体结合MICA的a I a 2结构域（由a 1结构域和a 2结构域形成 的MICA蛋白的部分）。进一步提供了跨MICA等位基因存在的a Ia 2结构域和a 3结构域 上的表位并且可以被抗体以高结合亲和力靶向。
[0166] MICA(PERB11. 1)是指MHC I 类多肽相关序列 A (参见例如，UniProtKB/Swiss-Prot Q29983)，其基因和cDNA及其基因产物，或其天然存在的变体。MICA基因和蛋白的命名 法连同参照不同等位基因的序列的登录号描述于Frigoul (弗里洛尔）A.和Lefranc (勒 弗朗），M-P. Recent Res. Devel. Human Genet.(人类遗传学的最新研究与进展）， 3(2005) :95-145ISBN:81-7736-244-5中，将其公开内容通过引用结合在此。MICA基因和蛋 白质序列（包括在蛋白质和DNA水平的多态性）还可获得自由巴赫拉姆博士（Dr. Bahram) 的实验室维护的 http://mhc_x. u-strasbg. fr/human. htm。
[0167] MICA的氨基酸序列首先被描述于Bahram (巴赫拉姆）等人（1994) Proc. Nat. Acad. Sci.(科学院院刊）91:6259-6263 和 Bahram(巴赫拉姆）等人（1996) Immunogenetics (免疫遗传学）44:80-81中，将其公开内容通过引用结合在此。MICA基因是 多态的，在其细胞外a 1、a 2以及a 3结构域中展示出多种变体氨基酸的不寻常分布。为 了进一步定义MICA的多态性，Petersdorf (彼得斯多夫）等人（1999)在275个具有常见 和稀有HLA基因型的个体之间检查了其等位基因。人类MICA的细胞外a 1、a 2以及a 3 结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。完整的MICA序列进一步包括具有23个氨 基酸的前导序列连同跨膜结构域和胞质结构域。所选的人类MICA等位基因的细胞外a 1、 a 2以及a 3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。MICA*001的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1中，对应于Genbank登录号AAB41060。人类MICA等位基因MICA*004的氨基酸序 列示于SEQ ID N02中，对应于Genbank登录号AAB41063。人类MICA等位基因MICA*007的 氨基酸序列示于SEQ ID NO 3中，对应于Genbank登录号AAB41066。人类MICA等位基因 MICA*008的氨基酸序列示于SEQ ID NO 4中，对应于Genbank登录号AAB41067。人类MICA 等位基因MICA*019的氨基酸序列示于SEQ ID NO 5中，对应于Genbank登录号AAD27008。 人类MICB的氨基酸序列示于SEQ ID NO 6中，对应于Genbank登录号CAI18747。
[0168] 该MICA基因编码属于MhcSF并且属于IgSF的蛋白质。该蛋白质是跨膜 MHC-I-a -样（I-a -样）链，该链包括三个细胞外结构域-两个远端G-样结构域，G-a -样 (也被称为"D1"或" a 1"）和G-a 2-样（也被称为"D2"或" a 2"），以及临近细胞膜的 C-样-结构域（也被称为"D3"或" a 3"），以及三个区--连接区、跨膜区及胞质区（标 记是根据頂GT(国际免疫遗传学信息系统? )的頂GT科学图表，http://imgt. org以及 LeFranc (勒弗朗）等人In Silico Biology (电子生物学），2005;5:45-60)。包括前导区、 E⑶、TM以及CY结构域的MICA成熟蛋白由360至366个氨基酸组成，差异是由跨膜区中的 微卫星多态性引起的。可以根据任何适合的编号系统（例如，頂GT编号系统）定义a 1、 a 2以及a 3。在一个实施方式中，a 1结构域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的残基位置 1至88 ; a 2结构域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的残基位置89至181 ;并且a 3结构域 包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的残基位置182至274。a 1和a 2结构域各自包括A、B、C 和D链、AB、BC和⑶转角以及螺旋。a 3结构域包括A、B、C、D、E、F和G链、BC环、⑶链、 DE转角以及FG环。MICA蛋白的八个潜在糖基化位点被高度糖基化，两个在a 1中，一个 在a2中并且五个在a3结构域中，包括0-聚糖（连接至丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰乳糖 胺）和/或N-聚糖。虽然MICA在某些细胞中组成性地表达，但是低水平的MICA表达通 常不引起宿主免疫细胞贴附。然而，MICA在迅速增殖的细胞（例如肿瘤细胞）中被上调。 MICA是所有NKG2D配体中被最高度表达的，并且已经跨宽范围的肿瘤类型被发现（例如 一般癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌、恶性胶质瘤、前列腺癌、一般血液恶性肿瘤、急 性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病以及慢性淋巴细胞白血病）。最近， Tsuboi (坪井）等人（2011) (EMBO J: 1-13)报道0-聚糖分支酶核心2 P -1，6-N-乙酰葡糖 胺转移酶（C2GnT)在MICA表达肿瘤细胞中是有活性的并且报道来自肿瘤细胞的MICA包含 核心20-聚糖（包括连接至N-乙酰半乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的0-聚糖）。
[0169] Bauer(鲍尔）等人 Science(科学）285:727-729, 1999 提供了 MICA 作为 NKG2D 的应激-可诱导的配体的作用。如在此使用，"MICA"是指任何MICA多肽，包括适用于其的 MICA基因或编码的一种或多种蛋白质任何变体、衍生物或同种型。MICA基因是多态的，在 其细胞外a 1、a 2以及a 3结构域中展示出多种变体氨基酸的不寻常分布。已经针对MICA 多肽（例如MICA)报道了不同等位基因变体，这些中的每一个都被对应的术语涵盖，包括例 如人类 MICA 多肽 MICA*001、MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*006、MICA*007、MICA*008、 MICA*009,MICA*010,MICA*01UMICA*012,MICA*013,MICA*014,MICA*015,MICA*016,MICA*017, MICA*018,MICA*019,MICA*020,MICA*022,MICA*023,MICA*024,MICA*025,MICA*026,MICA*027, MICA*028、MICA*029、MICA*030、MICA*031、MICA*032、MICA*033、MICA*034、MICA*035、MICA*036、 MICA*037,MICA*038,MICA*039,MICA*040,MICA*04UMICA*042,MICA*043,MICA*044,MICA*045, MICA*046,MICA*047,MICA*048,MICA*049,MICA*050,MICA*05UMICA*052,MICA*053,MICA*054, MICA #055以及MICA#056。还涵盖与野生型全长MICA分别享有一种或多种生物学特性或功 能，并且享有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸 同一性的任何核酸或蛋白质序列。
[0170] 如在此使用，除非另外说明或与上下文矛盾，否则"hNKG2D"以及术语"NKG2D"、 "疆62-0"、"〇)314"、"01252489￡"、"此服1"、"杀伤细胞类凝集素受体亚家族1(，成员1"或 "KLRK1"是指一种人类杀伤细胞活化受体基因、其cDNA (例如，Genbank登录号NM_007360) 及其基因产物（Genbank登录号NP_031386)，或其天然存在的变体。在NK和T细胞中， hNKG2D可以与蛋白质（例如DAPlO (Genbank登录号AAG29425, AAD50293))形成异源二聚 体或高阶复合物。在此归于hNKG2D的任何活性（例如，细胞激活、抗体识别等）也可以归 于处于异源二聚体（例如hNKG2D-DAP10)或具有这两种（和/或其他）组分的高阶复合物 形式的hNKG2D。
[0171] 已经确定了与NKG2D复合的MICA的3D结构（参见例如，Li(李）等人，Nat. Immunol.(自然免疫学）2001 ;2:443-451 ;code lhyr，以及在 MGT/3D 结构-DB (Kaas (卡 斯）等人灿(：1.六(^(18 1^8.(核酸研究）2004;32:0208-0210)中）。当]\〇〇六与疆620同源 二聚体复合时，MICAa 2的残基63至73 (IGMT编号）被顺序化，从而添加几乎两圈螺旋。 NKG2D的两个单体同等地有助于与MICA的相互作用，并且每个NKG2D单体中的七个位置与 MICAa 1或a 2螺旋结构域之一相互作用。
[0172] 本发明提供了使用本发明的抗原结合化合物的方法；例如，本发明提供了用于抑 制细胞增殖或活性，用于向细胞递送分子（例如毒性分子、可检测的标记物等），用于靶向、 鉴定或纯化细胞，用于消耗、杀死或消除细胞，用于减少细胞增殖的方法，该方法包括将细 胞（例如表达MICA多肽的肿瘤细胞）暴露于本发明的结合MICA多肽的抗原结合化合物。 将领会的是，出于本发明的目的，"细胞增殖"是指细胞的生长或增殖的任何方面，例如细胞 生长、细胞分裂、或细胞周期的任何方面。细胞可以在细胞培养物中（体外）或在哺乳动 物中（体内），例如罹患MICA表达病理学的哺乳动物。本发明还提供了一种用于诱导表达 MICA多肽的细胞死亡或抑制表达MICA多肽的细胞的增殖或活性的方法，该方法包括将该 细胞暴露于处于有效诱导该细胞死亡和/或抑制其增殖的量的抗原结合化合物，该抗原结 合化合物结合连接至毒剂的MICA多肽。因此，本发明提供了一种用于治疗罹患增生性疾病 以及由表达MICA多肽的细胞的致病性扩增表征的任何病症的哺乳动物的方法，该方法包 括向该哺乳动物给予药学有效量的在此披露的抗原结合化合物，例如用于癌症的治疗。
[0173] 定义
[0174] 如在本说明书中所使用，"一个（种）（a或an)"可以意指一个（种）或多个（种）。 如在权利要求（书）中所使用，当与单词"包括"结合使用时，单词"一个（种）（a或an)" 可以意指一个（种）或多个（种）而非一个（种）。如在此使用，"另一个（种）"可以意 指至少第二个（种）或更多。
[0175] 在使用"包括"的情况下，这可以优选地被"主要由...组成"，更优选地被 "由...组成"替换。
[0176] 无论何时在该整个说明书内，"增生性疾病的治疗"或"肿瘤的治疗"或"癌症的治 疗"等参照抗MICA结合剂（例如抗体）而提及，意指：(a)增生性疾病的治疗方法，所述方 法包括向需要这样的治疗的温血动物（尤其是人）给予（用于至少一个治疗）抗MICA结 合剂（优选在药学上可接受的载体材料中），处于允许所述疾病的治疗的剂量（治疗有效 量），优选处于如在上文和在下文指定为优选的剂量（量）；(b)抗MICA结合剂用于治疗增 生性疾病的用途，或抗MICA结合剂用于在所述治疗（尤其在人中）使用；(c)抗MICA结合 剂用于生产治疗增生性疾病的药物制剂的用途，使用抗MICA结合剂用于生产治疗增生性 疾病的药物制剂的方法，该方法包括将抗MICA结合剂与药学上可接受的载体或包括有效 剂量的适合治疗增生性疾病的抗MICA结合剂的药物制剂混合；或（d)根据可允许在该申请 提交的国家取得专利权的主题，a)、b)、和c)的任何组合。
[0177] 如在此使用，术语"癌症"和"肿瘤"被定义为细胞或组织的新生长，包括不受控制 的并且进行性的增殖。在一个【具体实施方式】中，在自然病程中，癌症是致命的。在具体定实 施方式中，癌症是侵入性的、转移性的、和/或退行发育的（损失了分化和定向至彼此以及 至它们的轴向框架）。
[0178] 如在此使用，术语"活检"被定义为为了检查的目的，例如为了建立诊断，从器官移 除组织。活检类型的实例包括通过应用抽吸，例如通过附接至注射器的针；通过组织片段的 器械移除；通过用适当器械借助内窥镜移除；通过手术切除，例如全病变的手术切除；等。
[0179] 如在此使用，术语"抗体"是指多克隆的和单克隆的抗体。取决于重链中恒定域的 类型，将抗体分为五个主要类别之一 ：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。这些中的若干个被进一 步分为多个小类或同种型，例如1861、1§62、1 §63、1§64、等。示例性免疫球蛋白（抗体）结 构单元包括四聚体。每个四聚体由两个相同对的多肽链组成，每个对具有一个"轻"链（约 25kDa)和一个"重"链（约50-70kDa)。每个链的N端限定了主要负责抗原识别的约100 至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链（\)和可变重链（V h)分别是指这些轻 链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别被称为" a "、" S "、" e "、" Y " 和" U "。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG和/或IgM是本发 明中采用的优选类别的抗体，其中IgG是特别优选的，因为它们是生理学情况下最常见抗 体并且因为它们在实验室环境下最容易制造。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。特别 优选的抗体是人源化抗体、嵌合抗体、人类抗体、或另外适合人类的抗体。"抗体"还包括任 何在此描述的抗体的片段或衍生物。
[0180] 术语"特异性结合"是指在竞争性结合测定中，如使用重组形式的蛋白、其中的表 位、抑或在分离的靶细胞表面上存在的天然蛋白进行评价，抗体可以优选地结合至结合配 偶体，例如MICA。竞争性结合测定和用于确定特异性结合的其他方法将在以下进一步描述 并且是本领域熟知的。
[0181] 当抗体被称为与具体单克隆抗体（例如6E4、20C6或16A8)"竞争"，这是指在使用 重组MICA分子或表面表达的MICA分子的结合测定中，抗体与单克隆抗体竞争。例如，如果 在结合测定中，测试抗体减少了 6E4、20C6或16A8与MICA多肽或MICA表达细胞的结合，那 么该抗体被称为分别与6E4、20C6或16A8 "竞争"。
[0182] 如在此使用，术语"亲和力"是指抗体与表位的结合的强度。由离解常量K d给出抗 体的亲和力，定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度。 [Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，并且[Ag]未结合抗原的摩尔浓度。由1/Kd定义亲和力常 数1^。在 Harlow(哈洛）等人，Antibodies:A Laboratory Manual (抗体：实验室手册）， Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社），Cold Spring Harbor(冷 泉港），N. Y?(纽约州），（1988) ,Coligan(科利根）等人编辑，Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南），Greene Publishing Assoc?(格林出版协会）和Wiley Interscience (威利国际科学），N. Y.(纽约州），（1992,1993)，和 Muller (穆勒），Meth. Enzymol?(酶学方法）92:589-601 (1983)中可以发现用于确定mAbs亲和力的优选方法，将 这些参考文献通过引用完整结合在此。本领域熟知的用于确定mAbs亲和力的一个优选并 且标准的方法是使用表面等离子共振（SPR)筛选（例如通过用BIAcore? SPR分析装置进 行分析）。
[0183] 在本发明的上下文内，"决定子"是指在多肽上相互作用或结合的位点。
[0184]术语"表位"是指抗原决定子，并且是抗原上结合抗体的区或区域。蛋白表位可以 包括在结合中直接涉及的氨基酸残基连同由特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸 残基，即抗体的"足迹"内的氨基酸残基。它是可以与例如抗体或受体结合的复合抗原分子 上的最简单形式的或最小结构的区。表位可以是线性的或构象的/结构的。术语"线性表 位"被定义为氨基酸的线性序列（一级结构）上连续的氨基酸残基组成的表位。术语"构 象的或结构的表位"被定义为由不是都连续的氨基酸残基组成的表位，并且因此代表通过 分子折叠（二级、三级和/或四级结构）而变得彼此接近的氨基酸线性序列的分开的部分。 构象表位取决于3维结构。因此，术语'构象的'通常与'结构的'可互换地使用。
[0185] 关于MICA表达细胞，术语"消耗"是指可以杀死、消除、溶解或诱导磁力诶杀死、消 除或溶解，以便负面影响样品或对象中存在的多个MICA表达细胞的过程、方法、或化合物。
[0186] 根据本发明的"剂"或"化合物"包括小分子、多肽、蛋白、抗体或抗体片段。在本 发明的上下文中，小分子在一个实施方式中是指具有小于1000道尔顿、特别是小于800道 尔顿、更特别是小于500道尔顿的分子量的化学制剂。术语"治疗剂"是指具有生物活性的 齐U。术语"抗癌剂"是指具有针对癌细胞的生物活性的剂。
[0187]关于抗体，术语"适合人类的"是指用于例如在此所描述的治疗方法，可以在人体 内安全使用的任何抗体、衍生化抗体、或抗体片段。适合人类的抗体包括所有类型的人源化 抗体、嵌合抗体、或完全人类抗体、或其中抗体的至少一部分衍生自人类或另外被修饰的任 何抗体，以便避免当使用天然非人类抗体时通常激起的免疫应答。
[0188] 出于本发明的目的，"人源化抗体"或"人类抗体"是指其中一个或多个人类免疫球 蛋白的恒定或可变结构区与结合区（例如动物免疫球蛋白的CDR)融合的抗体。设计此类 抗体来维持从其衍生结合区的非人类抗体的结合特异性，而且用来避免针对非人类抗体的 免疫反应。可以从已经"工程化"用来响应抗原激发产生特定人类抗体的转基因小鼠或其他 动物获得此类抗体（参见例如Green (格林）等人（1994)Nature Genet (自然遗传）7:13; Lonberg(伦贝格）等人（1"4)Nature(自然）368:856;Taylor(泰勒）等人（1"4) Int Imrnun(国际免疫学）6:579,将它们的完整教授内容通过引用结合在此）。可以通过遗传的 或染色体的转染方法连同噬菌体展示技术构建完全人类抗体，所有这些都是本领域已知的 (参见例如McCafTerty (麦考夫迪）等人（1990)Nature (自然）348:552-553)。还可以通 过体外激活B细胞产生人类抗体（参见例如美国专利号5, 567, 610和5, 229, 275,将它们通 过引用以其全文结合在此）。
[0189] "嵌合抗体"是一种抗体分子，其中（a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，这 样使得抗原结合位点（可变区）连接至不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒 定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物、等；或 (b)用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换可变区或其一部分。
[0190]术语"Fc结构域"、"Fc部分"、和"Fc区"是指抗体重链的C末端片段，例如从人 类Y (gamma)重链的约氨基酸（aa) 230至约aa450,或其他类型的抗体重链（例如对于 人类抗体是a、6、e和中的它的配对序列或其天然存在的同种异型。除非另外说 明，贯穿本公开内容使用针对免疫球蛋白的普遍接受的Kabat(卡巴）氨基酸编号（参见 Kabat(卡巴）等人（1991)Sequences of Protein of Immunological Interest(具有免疫 性兴趣的蛋白序列），第5版，United States Public Health Service (美国公共卫生署）， National Institute of Health(国立卫生研究院），Bethesda(贝塞斯达），马里兰州，也 称为 "Kabat (卡巴）EU"）。
[0191] 术语"抗体依赖的细胞介导的细胞毒性"或"ADCC"是本领域普遍理解的术语，并 且指细胞介导的反应，其中表达Fc受体（FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结 合抗体，并且随后导致靶细胞溶解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤（NK) 细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性细胞、和嗜酸性细胞。
[0192] 术语"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"是本领域普遍理解的术语，并且指在补体存 在下，分子溶解靶的能力。通过补体系统的第一组分结合至与同源抗原复合的分子（例如 抗体）引发了补体激活通路。
[0193] 当提及MICA时，术语"脱落"是指MICA的可溶性细胞外结构域（ECD)片段从表 达MICA的细胞的细胞表面释放。细胞表面MICA的蛋白酶剪切（例如通过基质金属蛋白酶 (MMP)(例如ADAMlO和/或ADAM17)的作用），致使ECD片段从细胞表面释放，可以导致此 类脱落，或者可溶性ECD或其片段可以由替代转录物编码。
[0194] 术语"分离的"、"纯化的"或"生物学纯的"是指实质上或基本上不含有在其天然 状态发现时正常伴随它的组分。典型地使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高 效液相色谱法确定纯度和同质性。为制剂中存在的超优势种的蛋白是实质上纯化的。
[0195] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白"在此可互换地使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语 应用至其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基 酸聚合物，连同应用至天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0196] 当引用例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时，术语"重组"表明该细胞、核酸、蛋 白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白进行修饰，或该细胞衍生自 如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然（非重组）形式的细胞内未发现的基因 或表达另外异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
[0197] 如在此使用，术语"NK细胞"是指在非常规免疫中涉及的淋巴细胞亚群。可以借助 某些特征和生物学特性，例如表达特异性表面抗原（包括针对人类NK细胞的⑶56和/或 ⑶16)、在细胞表面上不存在a / 0或Y / S TCR复合物、通过激活特定细胞溶解机构而结合 并且杀死不能表达"自我"MHC/HLA抗原的细胞的能力、杀死肿瘤细胞或表达针对NK活化受 体的配体的患病细胞的能力、以及释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白分子的 能力来鉴定NK细胞。使用本领域熟知的方法，任何这些特征和活性可以用于鉴定NK细胞。 术语NK细胞还将涵盖NK细胞的任何亚群。在本发明的上下文内，"活性"NK细胞是指生物 活性的NK细胞，包括具有溶解靶细胞或增强其他细胞的免疫功能的能力的NK细胞。例如， "活性"NK细胞可以能够杀死表达针对活化NK受体的配体和/或不能表达NK细胞上的KIR 识别的MHC/HLA抗原的细胞。可以通过本领域已知的不同技术，例如从血样、细胞单采术、 组织或细胞收集进行分离而获得NK细胞。对于涉及NK细胞的测定有用的实验方案可以发 现于Natural Killer Cells Protocols (天然杀伤细胞实验方案）（Campbell (坎贝尔）KS 和 Colonna (科隆纳）M 编辑），Human Press (人类出版社），219-238 页（2000)。
[0198] 如在此使用，"T细胞"是指在胸腺中成熟的，并且在其细胞表面上展示T细胞受体 等分子的淋巴细胞亚群。可以借助某些特征和生物学特性，例如表达特异性表面抗原（包 括TCR、CD4或CD8)、某些T细胞杀死肿瘤细胞或感染细胞的能力、某些T细胞激活免疫系 统的其他细胞的能力、以及释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白分子的能力来 鉴定T细胞。使用本领域熟知的方法，任何这些特征和活性可以用于鉴定T细胞。在本发 明的上下文内，"活性"或"激活的" T细胞或NK细胞是指生物活性的T细胞或NK细胞，更 具体地，是指具有通过例如分泌细胞因子来溶解细胞或刺激免疫应答的能力的T细胞或NK 细胞。可以按多种熟知方法，包括功能测定和基于表达的测定（例如表达细胞因子）中的 任一种检测活性细胞。
[0199] 在本发明的上下文内，术语"结合"多肽或表位的抗体是指具有特异性和/或亲和 力来结合所述决定子的抗体。
[0200] 抗体
[0201] 本发明的抗体是结合跨越不同等位基因的人类MICA的抗体。在一个实施方式中， 抗体结合MICA多肽（抗MICA抗体），而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用（例如在肿 瘤细胞上表面MICA与效应细胞上表面NKG2D的相互作用）。在另一个实施方式中，抗体结 合MICA多肽（抗MICA抗体）并且抑制MICA与NKG2D的相互作用；优选地，抗体抑制免疫 细胞表面上由sMICA导致的NKG2D下调。在一个实施方式中，抗体结合细胞表面上的MICA 多肽而不实质阻断MICA从细胞表面（例如肿瘤细胞的细胞表面）脱落。在一个实施方式 中，抗体结合MICA的a 1和/或a 2结构域。在一个实施方式中，抗体结合MICA的a 3结 构域。在一个实施方式中，抗体具有针对人类MICA等位基因*001、*004和*008、任选地另 外*007和/或*019的亲和力，任选地其特征在于小于1(T 9M、优选小于KTiqM的KcL
[0202] 在一个实施方式中，对于结合MICA多肽，该抗体与抗体6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9和14B4中的任意一个或多个竞争。优选地，对于MICA 多肽上实质上或基本上相同的、或相同的表位或"表位位点"，抗体识别它、结合它、或对其 具有免疫特异性。
[0203] 抗体表位
[0204] 在另一个实施方式中，这些抗体结合与抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、 10A7、18E8、10F3、15F9和14B4实质上相同的表位。在另一个实施方式中，这些抗体与以下 项至少部分重叠、或包括其中至少一个残基：对应于包括SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的 MICA多肽的残基1-88、残基89-181、或残基182-274的区段。在一个实施方式中，该表位的 所有关键残基是在对应于包括SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的MICA多肽的残基1-88、 残基89-181、或残基182-274的区段中。在一个实施方式中，抗体结合横跨（a) a 1和/或 a 2结构域以及（b) a 3结构域的连接的表位，其中该表位的所有关键残基在对应于包括 SEQ ID NO: 1至5的氨基酸序列的MICA多肽的残基1-181 (例如残基1-88 (任选地1-85) 或89-181(任选地86-181))的区段中。在一个实施方式中，抗体结合包括区段中的1、2、 3、4、5、6、7个或更多个残基的表位，该区段对应于包括SEQ ID N0:1至5的氨基酸序列的 MICA多肽的残基1-88 (任选地1-85)或残基89-181 (任选地86-181)。优选地，抗体结合 的残基存在于MICA多肽的表面上，例如细胞表面上表达的MICA多肽中。
[0205] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、6、7个或 更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、 R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Ylll、D113、 E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、 N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 和 D23 (参照 SEQ ID NO 1-5中任一个的MICA)。
[0206] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括：
[0207] (a)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：R6和N8;
[0208] (b)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58;
[0209] (c)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：R61和R64 ;
[0210] (d)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82 ;
[0211] (e)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：Q83、K84 ;
[0212] (f)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：E97、H99 ;
[0213] (g)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102;
[0214] (h)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：S103、T104、R105;
[0215] (i)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：Dl 13、El 15 ;
[0216] (j)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：N12UE123;
[0217] (k)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：T124和E126;
[0218] (1)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：H109、YllULl 16;
[0219] (m)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：H109、YllULl 16;
[0220] (n)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137 ;或
[0221] (〇)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和 N144 ；
[0222] (p)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225和D226 ;
[0223] (q)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229;和/ 或
[0224] (r)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：W230和D232。
[0225] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括（a)至（r)中2、3或4个的任何组 合。
[0226] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或 更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54。
[0227] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或 更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和R64。
[0228] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5或6个或更 多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Ylll、D113、L116、S133、R134、 T137、M140、N141、R143 和 N144。
[0229] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5或6个或更 多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Ylll、D113、L116、Q131、S132、 Q136、M140、N141、R143 和 N144。
[0230] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或 更多个残基，该组由以下各项组成：￡100、0101川102、5103、1'104、1?105川1213123、1'124和 E126。
[0231] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或 更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、 E115、L178、R179 和 R180。
[0232] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或 更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232。在 一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基， 该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229。
[0233] 在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括：
[0234] (a)选自下组的1个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82,和选自下组的 1个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q83、K84;
[0235] (b)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116;
[0236] (c)残基D113,和选自下组的1、2、3或4个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、 Q83、K84;
[0237] (d)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：Q131、S132、Q136;
[0238] (e)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137;
[0239] (f)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144;
[0240] (g)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116 ;任选地D113 ;和 选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：Q131、S132、Q136;
[0241] (h)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116 ;任选地D113 ;和 选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137;
[0242] (i)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116;任选地D113;和 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144;
[0243] (j)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84,选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116;任选地D113;选 自下组的1、2或3个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137;和选自下组的1、2、3或 4个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144;
[0244] (k)选自下组的1个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8,和选自下组的1、 2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105;
[0245] (1)选自下组的1、2、3或4个残基，该组由以下各项组成：N121、E123、T124和 E126,和选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105;或
[0246] (m)选自下组的1、2或3个残基，该组由以下各项组成：S224、H225和D226;选自 下组的1、2或3个残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229,和选自下组的一个或两 个残基，该组由以下各项组成：W230和D232。
[0247] 任选地，本发明的抗体的表位可以完全地在MICA的a 1和/或a 2结构域内。任 选地，另外，这些抗体可以特征为实质上结合MICA脱落所需的a 3结构域区。
[0248] 在一个实施方式中，本发明的抗体结合MICA多肽等位基因*001、*004和*008(以 及任选的另外的*007和*019)的表面上存在的一个或多个氨基酸。
[0249] 可以测量抗MICA抗体结合至MICA突变体转染的细胞，并且将其与抗MICA抗体结 合野生型MICA多肽（例如SEQ ID NO: 1至5中的任何一个或多个）的能力进行比较。抗 MICA抗体和突变体MICA多肽之间结合的减少意味着存在结合亲和力的减少（例如，如通过 已知方法，例如表达具体突变体的细胞的FACS测试，或通过结合突变体多肽的Biacore测 试进行测量），和/或抗MICA抗体的总结合能力减少（例如，如通过抗MICA抗体浓度对比 多肽浓度的图中的Bmax降低证实）。结合的显著减少表明当抗MICA抗体结合MICA时，突 变残基直接涉及结合抗MICA抗体或非常接近结合蛋白。
[0250] 在一些实施方式中，结合的显著减少意味着相对于抗体和野生型MICA多肽之间 的结合，抗MICA抗体和突变体MICA多肽之间的结合亲和力和/或能力减少了大于40%、大 于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于 90%或大于95%。在某些实施方式中，结合减少到低于可检测极限。在一些实施方式中，当 抗MICA抗体结合突变体MICA多肽小于抗MICA抗体和野生型MICA多肽之间观察到的结合 的50% (例如小于45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)时，证实结合显著减 少。
[0251] 在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低 的结合，在该突变体MICA多肽中，对应于野生型MICA多肽（例如包括SEQ ID N0:1至5中 的序列）中的残基1-88 (任选地1-85)、残基89-181 (任选地86-181)、或残基182-274 (或 其子序列）的区段中的残基被取代为不同的氨基酸。在一些实施方式中，提供了抗MICA抗 体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低的结合，在该突变体MICA多肽中，对应于野生 型MICA多肽（例如包括SEQ ID NO: 1至5中的序列）中的残基1-88 (任选地1-85)、残基 89-181 (任选地86-181)、或残基182-274(或其子序列）的区段中的残基被取代为不同的 氨基酸。
[0252] 在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低 的结合，在该突变体MICA多肽中，与野生型MICA多肽相比，选自下组的残基被取代为不同 的氨基酸，该组由以下各项组成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、 R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Ylll、D113、 E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、 N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 和 D232。
[0253] 在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低 的结合，在该突变体MICA多肽中：
[0254] (a)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、 D52、V53 和 L54 ;
[0255] (b)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、 R61 和 R64 ;
[0256] (c)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ;
[0257] (d)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、 K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ;
[0258] (e)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、 附02、5103、！104、1?105、附21、￡123、1'124和￡126;
[0259] (f)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或
[0260] (g)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、 D226、T227、Q228、Q229、W230 和D232 ;
[0261] 与野生型MICA多肽相比，被取代为不同的氨基酸。
[0262] 在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低 的结合，在该突变体MICA多肽中 ：
[0263] (a)选自下组的残基，该组由以下各项组成：R6和N8 ;
[0264] (b)选自下组的残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58 ;
[0265] (c)选自下组的残基，该组由以下各项组成：R61和R64 ;
[0266] ⑷选自下组的残基，该组由以下各项组成：K81、D82 ;
[0267] (e)选自下组的残基，该组由以下各项组成：Q83、K84 ;
[0268] (f)选自下组的残基，该组由以下各项组成：E97、H99 ;
[0269] (g)选自下组的残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102 ;
[0270] (h)选自下组的残基，该组由以下各项组成：S103、T104、R105 ;
[0271] ⑴选自下组的残基，该组由以下各项组成：D113、E115 ;
[0272] (j)选自下组的残基，该组由以下各项组成：N121、E123 ;
[0273] (k)选自下组的残基，该组由以下各项组成：T124和E126 ;
[0274] (1)选自下组的残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116 ;
[0275] (m)选自下组的残基，该组由以下各项组成：Q131、S132、Q136 ;
[0276] (n)选自下组的残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137 ;
[0277] (〇)选自下组的残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144 ;
[0278] (p)选自下组的残基，该组由以下各项组成：S224、H225和D226 ;
[0279] (q)选自下组的残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229 ;和/或
[0280] (r)选自下组的残基，该组由以下各项组成：W230和D232，
[0281] 与野生型MICA多肽相比，被取代为不同的氨基酸。
[0282] 在任一实施方式中，R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、 K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、 L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、 L178、R179、R180、S194、E195、N197、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 或 D232 取 代可以被规定为分别是 R6A、N8A、W14A、Q48A、W49S、E51S、D52A、V53S、L54A、N56A、K57S、 T58A、R61A、R64A、K81A、D82A、Q83A、K84A、E85A、E97A、H99A、E100A、D101S、N102A、S103A、 T104S、R105A、H109A、Y111A、D113A、E115A、L116A、N121A、E123S、T124A、E126A、Q131A、 S132A、S133A、R134S、Q136S、T137A、M140S、N141A、R143S、N144A、L178A、R179S、R180A、 S224A、H225S、D226A、T227A、Q228S、Q229A、W230A 或 D232A 取代。
[0283] 在一些实施方式中，抗MICA抗体特征在于与野生型MICA多肽（除了如实施例4 中所示的具体抗MICA抗体对其具有显著更低的结合的一个或多个突变体或残基）相比，对 突变体MICA多肽（例如表D的突变体1-61中的任何一个的突变体）或对具有表D的突变 体1-61中任一个的突变残基的多肽不展示显著更低的结合。
[0284] 产生抗MICA抗体
[0285] 可以通过本领域已知的大量技术产生本发明的抗体。典型地，通过用包含MICA多 肽（优选是人类MICA多肽）的免疫原免疫非人类动物（优选是小鼠）来产生它们。MICA 多肽可以包括人类MICA多肽的全长序列，或其片段或衍生物，典型地免疫原片段，即包括 表达MICA多肽的细胞的表面上暴露的表位的多肽的一部分，优选地，由6E4、20C6、16A8、 9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4抗体识别该表位。此类片段典型地包含 成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选地，包含它的至少约10个连续氨基酸。 片段典型地基本上衍生自受体的细胞外结构域。在一个优选实施方式中，免疫原包含脂膜 中的、典型地在细胞表面上的野生型人MICA多肽。在一个【具体实施方式】中，免疫原包含完 整细胞，特别是完整人类细胞，这些细胞任选地被处理或溶解。在另一个优选实施方式中， 该多肽是重组MICA多肽。在一个【具体实施方式】中，免疫原包含完整肿瘤细胞。
[0286] 可以按本领域熟知的用于刺激小鼠中抗体产生的任何方式进行用抗原免疫非 人类哺乳动物的步骤（参见例如E. Harlow(哈洛）和D. Lane (莱恩），Antibodies:A Laboratory Manual (抗体：实验室手册），Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉 港实验室出版社），Cold Spring Harbor (冷泉港），N. Y.(纽约州），（1988)，将其完整公开 内容通过引用结合在此）。将免疫原悬浮或溶解在缓冲剂中，任选地用佐剂，例如完全或不 完全弗氏佐剂。用于确定免疫原的量、缓冲剂类型和佐剂的量的方法是本领域普通技术人 员熟知的并且不以任何方式限制本发明。对于不同免疫原这些参数可能是不同的，但是都 是容易解释的。
[0287] 类似地，足以刺激产生抗体的免疫位置和频率也是本领域熟知的。在典型的免疫 实验方案中，在第一天用抗原腹膜内注射非人类动物，并且约一周后再注射一次。随后大约 在第20天进行抗原回忆注射，任选地用佐剂，例如不完全弗氏佐剂。静脉内进行这些回忆 注射，并且可以重复进行，持续若干个连续天。随后在第40天进行加强注射，静脉内注射抑 或腹膜内注射，典型地不用佐剂。该实验方案导致在约40天后，抗原特异性抗体产生B细 胞的产生。还可以使用其他实验方案，只要它们导致表达针对免疫中使用的抗原的抗体的 B细胞的产生。
[0288] 对于多克隆抗体制剂，血清获得自免疫的非人类动物，并且通过熟知的技术分离 其中存在的抗体。可以使用连接至固相支撑体的上述任何免疫原对血清进行亲和力纯化， 以便获得与MICA多肽反应的抗体。
[0289] 在一个替代实施方式中，分离来自非免疫的非人类哺乳动物的淋巴细胞，在体外 生长，并且然后暴露于细胞培养物中的免疫原。然后收获淋巴细胞，并且进行以下描述的融 合步骤。
[0290] 对于优选的单克隆抗体，下一步是从免疫的非人类哺乳动物分离脾细胞，并且随 后那些脾细胞与无限增殖化细胞融合，以形成产生抗体的杂交瘤。从非人类哺乳动物分离 脾细胞是本领域熟知的，并且典型地涉及从麻醉的非人类哺乳动物移除脾脏，将它切成小 块并且通过细胞筛的尼龙网将来自脾被膜的脾细胞挤入适当缓冲剂中，以便产生单细胞悬 浮液。洗涤这些细胞，离心并且重新悬浮在溶解任何红细胞的缓冲剂中。将该溶液再次离 心，并且最终将团块中的剩余淋巴细胞重新悬浮在新鲜缓冲剂中。
[0291] 一旦分离并且存在于单细胞悬浮液中，可以将淋巴细胞融合进无限增殖细胞系。 这典型地是小鼠骨髓瘤细胞系，虽然对于产生杂交瘤而言有用的许多其他无限增殖细胞系 也是本领域已知的。优选的鼠类骨髓瘤系包括但不局限于衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠 肿瘤的那些（可得自Salk Institute Cell Distribution Center (索尔克研究所细胞分 配中心），San Diego (圣迭戈），美国）和X63Ag8653和SP-2细胞（可得自American Type Culture Collection (美国典型微生物保藏中心），Rockville (罗克维尔），Maryland (马 里兰州），美国）。使用聚乙二醇等造成该融合。然后在包含抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的 生长或存活的一种或多种物质的选择性培养基中生长生成的杂交瘤。例如，如果亲本骨髓 瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型 地将包含次黄嘌呤、氨喋呤、和胸苷（HAT培养基），这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
[0292] 典型地在巨噬细胞的饲养层上生长杂交瘤。在平铺杂交瘤之前，巨噬细胞优 选地来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝出生仔畜并且典型地用不完全弗 氏佐剂等致敏这些巨噬细胞若干天。融合方法描述于Goding(戈丁）"Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (单克隆抗体：原理和实践）"，59_103 页（Academic Press (学术出版社），1986)，将其公开内容通过引用结合在此。
[0293] 允许这些细胞在选择培养基中生长足够的时间，以便集落形成和抗体产生。这通 常在约7天和约14天之间。
[0294] 然后针对特异性结合MICA多肽基因产物的抗体的产生测定杂交瘤集落，任选地 由抗体 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 或 14B4 特异性识别该表 位。该测定典型地是比色ELISA型测定，虽然可以采用能适合生长杂交瘤的孔的任何测定。 其他测定包括放射免疫测定或荧光激活细胞分选术。检查对于希望的抗体产生呈阳性的 孔，以确定是否存在一个或多个明显的集落。如果存在多于一个集落，则这些细胞可以重新 克隆并且生长，以确保只有单个细胞已经引起产生希望的抗体的集落。
[0295] 可以在适当培养基，例如DMEM或RPMI-1640中，按更大量逐渐形成确认为产生本 发明的单克隆抗体的杂交瘤。可选地，杂交瘤细胞可以在体内生长为动物中的腹水瘤。
[0296] 在用来产生希望的单克隆抗体的充分生长后，从这些细胞分离走包含单克隆抗 体（或腹水）的生长培养基，并且纯化其中存在的单克隆抗体。典型地通过使用蛋白A或 蛋白G琼脂糖（Sepharose)或连接至固相载体（例如琼脂糖（agarose或Sepharose)珠 粒）的抗小鼠Ig的凝胶电泳、透析、色谱法实现纯化（所有这些都描述于例如Antibody Purification Handbook^ 抗体纯化手册），Biosciences (生物科学），出版号 18-1037-46, AC版中，将其公开内容通过引用结合在此）。典型地通过使用具有含抗体部分的直接中和 作用的低PH缓冲剂（pH 3.0或更小的甘氨酸或乙酸缓冲剂），从蛋白A/G柱洗脱结合的抗 体。按需要，收集、透析并且浓缩这些部分。
[0297] 典型地重新克隆具有单个明显集落的阳性孔，并且重新测定以确保检测到并且产 生唯--种单克隆抗体。
[0298] 还可以通过选择免疫球蛋白组合文库来产生抗体，如例如披露于（Ward (瓦尔德） 等人，Nature (自然），341 (1989) 544页，将其完整公开内容通过引用结合在此）。
[0299]结合 MICA，特别是结合与单克隆抗体 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、 18E8、10F3、15F9或14B4实质上或基本上相同的表位的一种或多种抗体的鉴定会是使用其 中可以评价抗体竞争的大量免疫筛选测定中的任意一种容易地确定的。许多此类测定是常 规实践的并且是本领域熟知的（参见例如美国专利号5, 660, 827,1997年8月26日发布， 将其通过引用确切地结合在此）。将理解，鉴定结合与在此所述的单克隆抗体相同或实质上 相同的表位的抗体不以任何方式需要实际确定在此所述的抗体结合的表位。
[0300] 例如，当待检查的抗体获得自不同来源动物，或甚至具有不同Ig同种型时，可以 采用简单的竞争测定，其中对照抗体（例如6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、 10F3、15F9或14B4)和测试抗体经过混合（或预吸收）并且应用至含MICA多肽样品。基于 蛋白质印迹法和BIAC0RE分析的使用的实验方案是适合用于此类竞争研究的。
[0301] 在某些实施方式中，在应用至MICA抗原样品之前，将对照抗体（例如6E4、20C6或 16A8)与不同量的测试抗体预混合（例如约1:10或约1:100) -个时段。在其他实施方 式中，可以在暴露于MICA抗原样品期间，将对照抗体与不同量的测试抗体简单混合。只要 可以区别来自游离抗体的结合（例如通过使用分离或洗涤技术以消除未结合抗体）和来 自测试抗体的6E4、20C6或16A8 (例如通过使用物种特异性或同种型特异性二抗或通过用 可检测标记特异性标记6E4、20C6或16A8)，就可以确定测试抗体是否减少了 6E4、20C6或 16A8与抗原的结合，指示测试抗体识别与6E4、20C6或16A8实质上相同的表位。在不存在 完全无关的抗体的情况下，（标记的）对照抗体的结合可以用作对照高值。可以通过将标 记的（6E4、20C6或16A8)抗体与严格相同类型的未标记抗体（6E4、20C6或16A8) -起温 育而获得对照低值，其中将发生竞争并且减少标记抗体的结合。在测试测定中，在测试抗 体存在下，标记抗体反应性的显著减少是识别实质上相同的表位的测试抗体（即与标记的 (6E4、20C6或16A8)抗体"交叉反应"或竞争的测试抗体）的指征。减少6E4、20C6或16A8 与MICA抗原的结合至少约50% (例如至少约60%、或更优选至少约80%或90% (例如约 65% -100% ))的、处于约1:10和约1:100之间的6E4、20C6或16A8 :测试抗体的任何比 率的任何测试抗体被认为是结合与6E4、20C6或16A8实质上相同的表位或决定子的抗体。 优选地，此类测试抗体将减少6E4、20C6或16A8与MICA抗原的结合至少约90% (例如约 95% ) 〇
[0302] 还可以通过例如流式细胞术测试评价竞争。在这样的测试中，例如可以首先将携 带给定MICA多肽的细胞与6E4、20C6或16A8 -起温育，并且然后与用荧光染料或生物素标 记的测试抗体一起温育。如果当与饱和量的6E4、20C6或16A8预温育时获得的结合是用不 与6E4、20C6或16A8 -起预温育的抗体所获得的结合（如借助荧光测量）的约80%、优选 约50%、约40%或更少（例如约30%、20%或10% )，则该抗体被称为与6E4、20C6或16A8 竞争。可选地，如果用与饱和量的测试抗体一起预温育的细胞上的标记的6E4、20C6或16A8 抗体所获得的结合是不与测试抗体预温育所获得的结合的约80%、优选约50%、约40%、 或更少（例如约30%、20%、或10%)，则抗体被称为与6￡4、2006或1648竞争。
[0303] 还可以采用其中测试抗体被预吸收并且以饱和浓度被应用至其上固定MICA抗原 的表面上的简单的竞争测定。简单的竞争测定中的表面优选是BIACORE芯片（或适合表面 等离子共振分析的其他介质）。然后以MICA饱和浓度使对照抗体（例如6E4、20C6或16A8) 与该表面接触，并且测量对照抗体的MICA和表面的结合。将对照抗体的结合与不存在测 试抗体时对照抗体与含MICA表面的结合进行比较。在测试测定中，在存在测试抗体时，用 对照抗体的含MICA表面的结合的显著减少指示测试抗体识别与对照抗体实质上相同的表 位，这样使得测试抗体与对照抗体"交叉反应"。减少对照抗体（例如6E4、20C6或16A8)与 MICA抗原的结合至少约30%或更多、优选约40%的任何测试抗体可以被认为是结合与对 照抗体（例如6E4、20C6或16A8)实质上相同的表位或决定子的抗体。优选地，这样的测试 抗体将减少对照抗体（例如6E4、20C6或16A8)与MICA抗原的结合至少约50% (例如至少 约60%、至少约70%、或更多）。将理解，在竞争测定中，对照抗体和测试抗体的顺序可以颠 倒：即对照抗体可以首先结合该表面并且此后使测试抗体与该表面接触。优选地，对MICA 抗原具有更高亲和力的抗体首先结合该表面，因为将预期对第二抗体所见的结合下降（假 定这些抗体是交叉反应的）将具有更大幅值。在例如Saunal (萨纳尔）（1995) J. Immunol. Meth〇ds(免疫方法期刊）183:33-41中提供了此类测定的另外实例，将其公开内容通过引 用结合在此。
[0304] 优选地，识别MICA表位的单克隆抗体将与按相当大的百分比的或甚至所有的相 关MICA等位基因上存在的表位反应。在一个方面，本发明的抗MICA抗体结合MICA*004和 *008,任选地另外的 MICA*001、*007 和 / 或 *0019。
[0305] 在优选实施方式中，抗体将结合来自患有特征在于MICA阳性细胞的表达的疾病 的一个或多个的个体（即是使用本发明的抗MICA抗体用在此所述的方法之一治疗的候选 人的个体）的MICA表达细胞。因此，一旦获得特异性识别细胞上的MICA的抗体，可以测试 它结合MICA阳性细胞（例如癌细胞）的能力。具体地，在用本发明的抗体之一治疗患者之 前，测试该抗体结合取自患者的恶性细胞（例如在血样或肿瘤活检中）的能力将是有益的， 以最大化在患者中将是有益的治疗的可能性。
[0306] 在一个实施方式中，本发明的抗体是在用来测试它们结合MICA表达细胞（例如恶 性细胞）的能力的免疫测定中验证的。例如，进行肿瘤活检并且收集肿瘤细胞。然后使用 本领域普通技术人员熟知的标准方法评价给定抗体结合细胞的能力。发现结合来自显著百 分比的个体或患者（例如5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多）的相当大的部分（例 如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多）的已知表达[04的细胞（例如肿瘤细 胞）的抗体适合用于本发明，都出于诊断目的，以确定患者中恶性细胞的存在或水平，或适 合用于在此所述的治疗方法，例如适合用于增加或减少恶性细胞个数或活性。为了评价抗 体与细胞的结合，直接抑或间接标记这些抗体。当间接标记时，典型地添加第二标记抗体。
[0307] 可以按本领域普通技术人员已知的方式进行抗体结合是否在表位区内的测定。作 为此类作图/表征方法的一个实例，可以通过使用MICA蛋白中暴露的氨基/羧基的化学 修饰的表位"足迹法"确定抗MICA抗体的表位区。这种足迹法技术的一个具体实例是使 用HXMS (通过质谱法检测氢-氘交换），其中发生受体和配体蛋白酰胺部分的氢/氘交换、 结合、和回交换，其中参与蛋白结合的主链酰胺基团被保护免受回交换并且因此将保留氘 化。可以通过消化性蛋白水解、快速微内径高效液相色谱分离、和/或电喷雾离子化质谱 法在这一点上鉴定相关区。参见例如Ehring(埃林）H，分析生物化学，卷267 (2) 252-259 页（1999)￡叩611(恩金），]\1?和3111；[1:11(史密斯），0丄.（2001)六仙1.016111.(分析化学）73, 256A-265A。适合的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振表位作图（NMR)，其中 典型地，对在游离抗原和与抗原结合肽（例如抗体）复合的抗原的二维NMR图谱中的信号 的位置进行比较。典型地用15N选择性地同位素标记抗原，这样使得在NMR图谱中只看见 对应于抗原的信号并且没有来自抗原结合肽的信号。与游离抗原的图谱相比，源自与抗 原结合肽相互作用所涉及氨基酸的抗原信号典型地在复合物的图谱中移位，并且可以按 此方式鉴定结合所涉及的氨基酸。参见例如Ernst Schering Res Found Workshop(厄 恩斯特先灵德雅研究基金会研讨会）2004 ; (44) :149-67 ;Huang(黄）等人，Journal of Molecular Biology (分子生物学杂志），卷 281 (1)61-67 页（1988);以及 Saito (齐藤）和 Patterson (帕特森），Methods (方法），1996 年 6 月；9 (3) : 516-24。
[0308]还可以使用质谱法方法进行表位作图/表征。参见例如Downard(道尔德），J Mass Spectrom(质谱法杂志）2000 年 4 月；35 (4) : 493-503 以及Kiselar (奎莱尔）和 Downard (道 尔德），Anal Chem.(分析化学1999年5月1 ;1 ;71 (9) : 1792-1801。在表位作图和鉴定的 背景下，蛋白酶消化技术也会是有用的。可以通过蛋白酶消化，例如通过在PH 7-8使用按 与MICA约1:50的比率使用胰蛋白酶或o/n消化，随后是用于肽鉴定的质谱法（MS)分析， 确定抗原决定子相关区/序列。可以随后通过比较经受胰蛋白酶消化的样品和与抗体一起 温育并且然后经受例如胰蛋白酶消化的样品，鉴定受抗MICA结合剂保护免受胰蛋白酶切 割的肽（由此揭示该结合剂的足迹）。而且或可选地，其他酶，像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等 可以用于类似表位表征方法。此外，酶消化可以提供用于分析潜在抗原决定子序列是否在 未表面暴露的并且因此在免疫原性/抗原性方面最可能不相关的MICA多肽的一个区内的 快速方法。
[0309] 定点诱变是对解释结合表位有用的另一技术。例如，在"丙氨酸扫描"中，蛋白 区段内的每个残基都被替换为丙氨酸残基，并且测量结合亲和力的结果。如果突变导致 结合亲和力显著减少，则它最可能涉及结合。特异性针对结构表位的单克隆抗体（即并 不结合未折叠蛋白的抗体）可以用于验证丙氨酸替换并不影响蛋白的整体折叠。参见例 如 Clackson(克拉克森）和 Wells(韦尔斯），Science(科学）1995 ;267:383-386 ;以及 Wells (韦尔斯），Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院院刊）1996;93:1-6。
[0310] 电子显微镜还可以用于表位"足迹法"。例如，Wang(王）等人，Nature (自然）1992 ; 355:275-278使用冷冻电子显微镜术、三维图象重构、和X射线结晶学的配合应用来确定在 天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的Fab片段的物理足迹。
[0311] 用于表位评估的其他形式的"无标记"测定包括表面细胞质基因组反响（SPR， BIAC0RE)和反射干涉频谱法（RifS)。参见例如Fagcrstam(法格尔斯塔姆）等人， Journal Of Molecular Recognition(分子识别杂志）1990 ;3:208_14;Nice(耐斯）等 人，J.Chroma-togr.(色谱法杂志）1993;646:159-168 ;Leipert (莱佩特）等人，Angew. Chem. Int. Ed. (Angewandte Chemie International Edition (应用化学国际版）1998 ; 37:33〇8_3311 ;K丨'6ger (克罗格尔）等人，Biosensors and Bioelectronics(生物传感器 和生物电子学）2002;17:937-944。
[0312] 还应注意到，可以在本文所述的一种或多种示例性竞争测定鉴定结合与本发明的 抗体相同的或实质上相同的表位的抗体。
[0313] 在脊椎动物或细胞中免疫接种并且产生抗体时，可以进行具体的选择步骤来分离 要求保护的抗体。在此方面，在一个【具体实施方式】中，本发明还涉及产生此类抗体的方法， 该方法包括：(a)用包含MICA多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；以及（b)制备来自所述 免疫动物的抗体；以及（c)选择能够结合MICA的来自步骤（b)的抗体。
[0314] 典型地，由本发明提供的抗MICA抗体具有在约IO4至约IO 11ITi (例如约IO8至约 IOkT1)的范围中的对MICA多肽的亲和力。例如，在一个具体方面中，如通过例如表面细胞 质基因组反响（SPR)筛选（例如通过用BIAcore? SPR分析装置进行分析）所确定，本发明 提供了具有关于MICA的小于lx KT9M的平均解离常数（Kd)的抗MICA抗体。在一个更具 体的示例性方面中，本发明提供了具有对MICA的约lx KT8M至约lxKTkiI^或约lx KT9M 至约lx KT11M的KD的抗MICA抗体。
[0315] 例如可以用不大于约（即亲和力好于）100、60、10、5、或1纳摩尔，优选亚纳摩尔或 任选地不大于约500、200、100或10皮摩尔的平均KD表征抗体。例如可以通过在芯片表面 上固定重组产生的人类MICA蛋白，随后应用溶液中的待测试抗体，确定KD。在一个实施方 式中，该方法进一步包括步骤（d)，选择对于结合MICA，能够与抗体6E4、20C6、16A8、9C10、 19￡9、12八10、1(^7、18￡8、1(^3、15?9或1484竞争的来自〇3)的抗体。
[0316] 在任何实施方式的一个方面中，根据本发明的方法制备的抗体是单克隆抗体。 在另一个方面中，用于产生根据本发明的方法的抗体的非人类动物是哺乳动物，例如啮 齿动物、牛、猪、禽类、马、兔、山羊、或绵羊。本发明的抗体涵盖6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4。额外地，本发明的抗体可以任选地被指定 为除了在Salih(萨利赫）等人（2003) (Blood(血液）102(4) :1389-1396)中描述的抗体 BAMOl 或 BAM03,在 Groh(格罗）等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci USA(美国国家科学院 院刊）93:12445-12450、Groh (格罗）等人（1998) Science (科学）279:1737-1740 或 WO 2008/131406中描述的抗体2C10、3H5、6D4或6G6(这些参考文献中的每一个的公开内容通 过引用结合在此），或以上内容的衍生物，例如完整或部分地包括这些CDR或抗原结合区的 衍生物中的任一种的抗体。
[0317] 根据本发明的替代实施方式，从本发明的杂交瘤中分离编码结合存在于MICA多 肽上的表位的抗体的DNA，并且将其放入用于转染进适当宿主的适当表达载体中。然后将宿 主用于重组产生抗体、或其变体，例如单克隆抗体的人源化版本、抗体的活性片段、包含抗 体的抗原识别部分的嵌合抗体、或包含可检测部分的版本。
[0318] 可任意容易地分离编码本发明的单克隆抗体，例如抗体6E4、20C6、16A8、9C10、 19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4的DNA，并且使用常规程序（例如通过使用能够 特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的寡核苷酸探针）对其进行测序。一旦分离，可以将 DNA放入表达载体，然后将这些表达载体转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如大 肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中 单克隆抗体的合成。如在本说明书的其他地方所述，此类DNA序列可以被修饰用于大量目 的中的任一个，例如用于人源化抗体，产生片段或衍生物，或用于修饰抗体序列（例如在抗 原结合位点中），以优化抗体的结合特异性。在一个实施方式中，本发明包括编码抗体（例 如 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9 或 14B4)的轻链和 / 或重链的 分离的核酸序列，连同包含此类核酸（例如在其基因组中）的重组宿主细胞。
[0319] 编码抗体的DNA的细菌中重组表达是本领域熟知的（参见例如Skerra(斯凯拉） 等人，Curr. Opinion in Immunol.(免疫学当前观点），5, 256 页（1993);以及Pluckthun (普 吕克通），Immunol.(免疫学）13〇, I5I 页（I"2)。
[0320] 评价活性
[0321] 一旦获得抗原结合化合物，将通常评价它阻断NKG2D和MICA (例如sMICA或膜结 合MICA)之间的相互作用、阻断MICA从细胞脱落、抑制sMICA诱导的NKG2D下调、导致MICA 表达细胞的死亡、诱导ADCC或CDC指向、和/或抑制MICA表达靶细胞的增殖和/或导致它 们的消除的能力。
[0322] 可以在本方法的任何适合的阶段进行抗原结合化合物的减少MICA和NKG2D之间 的结合或阻断它们之间的相互作用的能力的评价，例如，如在此提供的实例中。例如，可以 使在它们的表面上表达MICA的肿瘤细胞与在它们的表面上表达NKG2D的细胞（例如效应 细胞）接触，其中添加或不添加候选抗MICA抗体。可以评价MICA表达细胞和NKG2D表达 细胞之间的结合，并且选择并不减少结合的抗体。另一种可能性涉及使分离的MICA多肽 与分离的NKG2D多肽接触，或与在其表面上表达NKG2D多肽的细胞接触，并且评价MICA和 NKG2D多肽或表达NKG2D的细胞之间的结合。另一种可能性涉及使分离的NKG2D多肽与在 其表面上表达MICA多肽的细胞接触，并且评价MICA多肽或表达MICA的细胞之间的结合。
[0323] 例如，为了确定一种剂是否阻断MICA与NKG2D的相互作用，进行以下测试：在增 加浓度的测试抗MICA mAb存在或不存在下，将用MICA转染的细胞系ClR或RMA与可溶性 NKG2D-FC融合蛋白一起温育。洗涤这些细胞，然后与识别NKG2D-FC融合蛋白的Fc部分的 二抗一起温育，再次洗漆，并且在流式细胞仪（FACScalibur，Beckton Dickinson公司）上 用标准方法进行分析。当不存在抗MICA mAb时，NKG2D-FC蛋白很好地结合ClR或RMA细 胞。在阻断MICA与NKG2D结合的抗MICA mAb存在时，存在NKG2D-FC与细胞的结合的减少。
[0324] 优选地，还可以通过评价抗MICA抗体对NKG2D表达细胞（例如NK或T细胞）的 功能的影响，进行抗原结合化合物的减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互 作用的能力的评价。优选地，使用表达NKG2D而不表达CD16的NK细胞或T细胞，以便避 免⑶16介导的ADCC作用的任何贡献。如果抗MICA抗体减少或阻断了 MICA-NKG2D相互作 用，则它将被预期用于抑制NKG2D介导的NK细胞或T细胞的激活。因此，并不减少MICA和 NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的抗体将不实质上减少或阻断NKG2D介导的 NK细胞或T细胞的激活。可以通过典型的细胞毒性测定对此进行评估，本文描述了它的实 例。可以使用多种基于细胞的测定中的任一种来评价NKG2D活性，这些测定包括基于基因 表达的测定，基于细胞毒性的测定，以及增殖测定。在一个方面中，体外测定将使用来自人 类患者的NK细胞或T细胞，例如用NKG2D编码转基因转染的T细胞系，只要受体的表达以 可检测方式改变细胞活性，例如使它们被NKG2D配体可激活。反映NKG2D活性的任何适合 的生理学变化可以用于评价测试化合物或抗体的功用。例如，可以测量大量作用，例如基 因表达、细胞因子产生、细胞生长、细胞增殖、pH、细胞内第二信使（例如Ca2+、IP3、cGMP、 或cAMP)、活性（例如细胞毒性活性）或激活其他T细胞的能力中的变化。在一个实施方 式中，可以通过检测疆620响应基因（例如^25、正^￥、或1即-〇)的表达来评价受体 的活性（参见例如Groh(格罗）等人（2003)PNAS(美国国家科学院院刊）100:9452-9457 ; Andr6 (安德烈）等人（2004) Eur. J. Immunol (欧洲免疫学杂志）34:1-11)。在一个实施方 式中，通过在MICA表达细胞和抗MICA抗体存在下温育NKG2D+T细胞或NK细胞评价NKG2D 活性，并且评价化合物或测试抗体抑制由T细胞或NK细胞释放TNF- a或IFN- Y的能力。
[0325] 在本文的实施例中也描述了示例性细胞毒测定，其中评价了 NKG2D介导的靶细胞 的杀灭。在此，通过测量51Cr的靶细胞释放，抗MICA抗体减少或抑制NKG2D+CD16-NK92 细胞的能力被用于评价NK细胞介导的MICA*019转染的BaF/3的杀灭。通过本领域熟 知的标准方法进行体外细胞毒性测定，例如，如在Coligan(科利根）等人编辑，Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南），Greene Publishing Assoc.(格林出版协 会）和Wiley Interscience (威利国际科学），N. Y.(纽约州），（1992,1993)中所述。在添 加NK细胞之前用51Cr标记MICA表达靶细胞，然后杀灭被估计为与由于杀灭的结果的从细 胞至培养基的 51Cr的释放成比例。减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互 作用的剂的添加导致防止了经由NKG2D的活化信号传递的引发和蔓延。因此，此类剂的添 加导致靶细胞的NK介导的杀灭减少。
[0326] 不减少或阻断通过NKG2D的细胞激活（例如细胞因子产生、细胞生长、细胞增殖、 pH、细胞内第二信使、NK介导的MICA表达细胞的杀灭）的抗原结合化合物（例如不减少或 减少小于5%、10%、20%或30%)被称为"非阻断"11^13。减少或阻断通过^?20的细胞激 活的抗原结合化合物被称为"阻断" mAb。
[0327] 可以在本方法的任何适合的阶段进行抗原结合化合物的阻断MICA从MICA表达 细胞的脱落的能力的评价，例如，如在此提供的实例中。在一个实例中，提供了细胞样品并 且使用ELISA方法检测可溶性细胞外MICA。在一个实例中，将本发明的抗原结合化合物 给予哺乳动物，并且测量循环sMICA的存在或不存在或其水平。体外检测的实例描述于 Nolting(诺尔廷）等人（2010)Virology(病毒学）406(1) : 12-20中。简要地，可以使用可 商购的MICAELISA药盒（Bamomab，慕尼黑，德国）。用PBS中的按2iig/ml的捕获抗MICA mAb BAM0-1将平板涂覆过夜，然后通过添加100 ill的15% BSA在37°C封闭2h并且洗涤。 添加标准物和样品并且将平板在37°C温育2h。洗涤平板并且添加在7. 5% BSA-PBS中的按 5 y g/ml的检测mAb BAM0-3,在37°C持续2h。然后洗涤平板并且添加抗小鼠IgG2a-HRP (在 7. 5% BSA-PBS中1:8000)，在37°C持续lh。然后洗涤平板并且使用过氧化物酶底物系统 (KPL公司，Gaithersburg (盖瑟斯堡），马里兰州）进行显影。在450nm测量吸光度。
[0328] 可以在本方法的任何适合的阶段进行抗原结合化合物诱导ADCC、CDC或另外（例 如通过递送毒剂）导致MICC表达靶细胞的活性的消除或抑制的能力的评价，例如，如本文 提供的实施例中。这一评价在为了治疗用途涉及的抗体（或其他化合物）的鉴定、产生和 /或开发中涉及的不同步骤中的一个或多个上会是有用的。例如，可以在用来鉴定候选抗 原结合化合物的筛选方法的背景下，或者在其中将抗原结合化合物选择并制造为适合人类 (例如在抗体的情况下制成嵌合抗体或人源化抗体）的方法中评价活性，其中已经获得表 达抗原结合化合物的细胞（例如表达重组抗原结合化合物的宿主细胞），并且评价它产生 功能抗体（或其他化合物）的能力，和/或其中已经产生一些抗原结合化合物，并且要评价 其活性（例如至测试批次或大量产品）。通常将已知抗原结合化合物特异性结合MICA多 肽。该步骤可以涉及测试多个（例如使用高通量筛选方法的非常大量的或更小量的）抗原 结合化合物。
[0329] 可以通过包括本文的实验实施例中所述的那些的不同测定来确定可以进行CDC 和ADCC的测试。典型地，测试ADCC涉及评价细胞介导的细胞毒性，其中由效应细胞（例如 携带Fc受体的白细胞）识别具有结合的抗MICA抗体的MICA表达靶细胞（例如癌细胞或 其他MICA表达细胞），而不涉及补体。任选地可以使用不表达MICA抗原的细胞作为对照。 通过测量细胞因子产生（例如IFN-Y产生）或细胞毒性标记物（例如CD107转移）中的 增加来评价NK细胞的细胞毒性的激活。优选地，与对照抗体（例如不结合MICA的抗体、具 有鼠恒定区的MICA抗体）相比，在靶细胞（例如MICA表达细胞）存在下，本发明的抗体 将诱导至少20 %、50 %、80 %、100 %、200 %或500 %的细胞因子产生、细胞毒性标记物的表 达、或靶细胞溶解中的增加。在另一个实例中，例如在铬释放测定中，检测到靶细胞溶解，优 选地，本发明的抗体将诱导至少10 %、20 %、30 %、40 %或50 %的靶细胞的溶解。
[0330] 抗体CDR序列
[0331]抗体 6E4
[0332] 抗体6E4的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO: 7,轻链可变区的氨基酸 序列被列出为SEQ ID N0:8。融合进人类链恒定区（分别是重链和轻链）的抗体6E4的重 链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别被列出为SEQ ID N0:9和10。在一个具体实施 方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体6E4基本上相同的表位或决定子的抗体，任选地 该抗体包括抗体6E4的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体6E4可以特征在于它 的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括6E4 的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包括6E4的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方 式，该单克隆抗体包括6E4的重链可变区的三个⑶R。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆 抗体进一步包括6E4的可变轻链可变区，或6E4的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三 个。任选地，所述轻链或重链⑶R中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五 个或更多个氨基酸修饰（例如取代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和 /或重链可变区中的任一个包括抗体6E4的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人 类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0333] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 11-13中列出的氨基酸序列SYYAMS、GFTFSY或 GFTFSYYAMS，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO: 14-15 中列出的氨基酸序列TISRGGNYIYYIDSVKG或TISRGGNYIY，或它们的至少4、5、6、7、8、9或 10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸； HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO: 16中列出的氨基酸序列ISDYDGAWLAY，或它的 至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取 代为不同的氨基酸；IXDRl区，该IXDRl区包括如在SEQ ID NO: 17中列出的氨基酸序列 RSSQSIIHTNGNTYLE，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸 中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR2区，该IXDR2区包括如在SEQ ID NO: 18 列出的氨基酸序列KISNRFS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这 些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO: 19中列出的氨基酸序列FQGSHVPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的 序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0334] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0335] (a) SEQ ID NO: 7的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代 为不同的氨基酸；和/或
[0336] (b)SEQ ID N0:8的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代 为不同的氨基酸；和/或
[0337] (c)SEQ ID N0:7的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不 同的氨基酸；以及SEQ ID N0:8的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被 取代为不同的氨基酸；和/或
[0338] (d)如 SEQ ID NO: 11 至 16 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2)氨基酸序 列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0339] (6)如5已0 10勵：17、18和19中所示的轻链〇)1?1、2和3(1〇)1?1、1〇)1?2、1〇)1?3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/ 或
[0340] (f)如 SEQ ID NO: 11 至 16 中所示的重链 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及 如SEQ ID N0:17、18和19中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其 中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0341] (g)与具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、90% 或95%相同的重链可变区，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不 同的氨基酸；和/或
[0342] (h)与具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、90% 或95%相同的轻链可变区，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不 同的氨基酸。
[0343] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0344] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（h)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0345] 抗体 20C6
[0346] 抗体20C6的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO: 20,轻链可变区的氨基 酸序列被列出为SEQ ID N0:21。融合进重链恒定区（分别是重链和轻链）的抗体20C6的 重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别被列出为SEQ ID N0:22和23。在一个具体实 施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体20C6基本上相同的表位或决定子的抗体，任选 地该抗体包括抗体20C6的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体20C6可以特征在 于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括 20C6的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包括20C6的重链可变区的单克隆抗体。根据一个 实施方式，该单克隆抗体包括20C6的重链可变区的三个⑶R。还提供了一种单克隆抗体，该 单克隆抗体进一步包括20C6的可变轻链可变区，或20C6的轻链可变区的CDR中的一个、两 个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四 个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可 变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体16A8的抗原结合区的一部分或全部的抗体被 融合进IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是IgGl或IgG3同种型。
[0347] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID N0:24-26中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或 GFSLSTSGMGVG，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO: 27-28中列出的氨基酸序列HIffffDDDKYYNPSLK或HIWWDDDK，或它们的至少4、5、6、7、8、9 或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸； HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO: 29中列出的氨基酸序列RTQGYFDY，或它的至少4、 5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同 的氨基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID N0:30中列出的氨基酸序列RASQSISDYLH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID N0:31列出的氨基酸序列 YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或 多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID NO:32中列出的 氨基酸序列QNGHSFPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸，或其中该序列可以包括一个或多个 氨基酸的插入。
[0348] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0349] (a) SEQ ID NO: 20的重链可变区，其中⑶R中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可 以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0350] (b)SEQIDNO: 21的轻链可变区，其中⑶R中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可 以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0351] (c)SEQIDN0:20的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个可以被取代为不 同的氨基酸；以及SEQIDN0:21的轻链可变区，其中一个或多个氨基酸可以被取代为不同 的氨基酸；和/或
[0352] (d)如 SEQ ID N0:24-29 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0353] (e)如 SEQ ID N0:30、31 和 32 中所示的轻链 CDR1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/ 或
[0354] (f)如 SEQ ID N0:24 至 29 中所示的重链 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及 如SEQ ID N0:30、31和32中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其 中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0355] (g)与具有SEQIDN0:20的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0356] (h)与具有SEQIDN0:21的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0357] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0358] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（h)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0359]抗体16A8
[0360] 抗体16A8的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO: 33,轻链可变区的氨基 酸序列被列出为SEQ ID NO:34。融合进重链恒定区（分别是重链和轻链）的抗体16A8的 重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别被列出为SEQ ID NO:35和36。在一个具体实 施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体16A8基本上相同的表位或决定子的抗体；任选 地该抗体包括抗体16A8的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体16A8可以特征在 于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括 16A8的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包括16A8的重链可变区的单克隆抗体。根据一个 实施方式，该单克隆抗体包括16A8的重链可变区的三个⑶R。还提供了一种单克隆抗体，该 单克隆抗体进一步包括16A8的可变轻链可变区，或16A8的轻链可变区的CDR中的一个、两 个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四 个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可 变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体16A8的抗原结合区的一部分或全部的抗体被 融合进IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是IgGl或IgG3同种型。
[0361] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 37-39中列出的氨基酸序列RYAMS、GFTFSR或 GFTFSRYAMS，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:40-41 中列出的氨基酸序列TIFSGGSYTYYPDSV或TIFSGGSY，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连 续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区， 该HCDR3区包括如在SEQ ID N0:42中列出的氨基酸序列PNWERTFDY，或它的至少4、5、6、7、 8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基 酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID N0:43中列出的氨基酸序列KSSQSLLNSSNQKNYL， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:44列出的氨基酸序列 FASTRES，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或 多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID N0:45中列出的 氨基酸序列QQHYSTPPT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸，或其中该序列可以包括一个或多个 氨基酸的插入。
[0362] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0363] (a) SEQ ID NO: 33的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0364] (b) SEQ ID NO: 34的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0365] (c)SEQIDN0:33的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个可以被取代为不 同的氨基酸；以及SEQIDN0:34的轻链可变区，其中一个或多个氨基酸可以被取代为不同 的氨基酸；和/或
[0366] (d)如 SEQ ID N0:37-42 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0367] (6)如5￡〇10勵:43、44和45中所示的轻链0?1、2和3(10)1?1、10)1?2、10)1?3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/ 或
[0368] (f)如 SEQ ID N0:37-42 中所示的重链 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如 5已〇10勵:43、44和45中所示的轻链0?1、2和3仏0)1?1、^：01?2、^：01?3)氨基酸序列，其 中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0369] (g)与具有SEQIDN0:33的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0370] (h)与具有SEQIDN0:34的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0371] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0372] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（h)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0373]抗体19E9
[0374] 抗体19E9的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQIDNO: 46,轻链可变区的氨基 酸序列被列出为SEQIDNO:47。
[0375] 在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆抗体19E9基本上相同的表 位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体19E9的抗原结合区。在本文的任何实施方式 中，抗体19E9可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方 式中，该单克隆抗体包括19E9的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包括19E9的重链可变区 的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括19E9的重链可变区的三个⑶R。还 提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括19E9的可变轻链可变区，或19E9的轻链 可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R中的任何一个或多个可 以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取代、插入或缺失）。任选 地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体19E9的抗原结合区 的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区， 任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0376] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 48-50中列出的氨基酸序列SDYAWN、GYSITSD或 GYSITSDYAWN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID N0:51-52 中列出的氨基酸序列FVSYSGTTKYNPSLKS或FVSYSGTTK，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10 个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3 区，该HCDR3区包括如在SEQ ID N0:53中列出的氨基酸序列GYGFDY，或它的至少4、5、6、7、 8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基 酸；IXDRl区，该IXDRl区包括如在SEQ ID NO: 54中列出的氨基酸序列SATSSISSIYH1，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:55列出的氨基酸序列 RTSNLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或 多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID N0:56中列出的 氨基酸序列QQGTTIPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0377] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0378] (a)SEQIDN0:46的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0379] (b)SEQIDN0:47的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0380] (c)如 SEQ ID N0:48-53 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0381] (d)如 SEQ ID N0S:54、55 和 56 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸； 和/或
[0382] (e)如 SEQ ID N0:48-53 中所示的重链CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:54、 55和56中所示的轻链⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一个、 两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0383] (f)与具有SEQ ID N0:46的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0384] (g)与具有SEQ ID N0:47的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0385] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0386] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0387]抗体 9C10
[0388] 抗体9C10的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID N0:57,轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQ ID N0:58。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆抗 体9C10基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体9C10的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体9C10可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序 列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括9C10的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包 括9C10的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括9C10的重链 可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括9C10的可变轻链 可变区，或9C10的轻链可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R 中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取 代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括 抗体9C10的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区， 任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0389] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 59-61中列出的氨基酸序列RYWMN、GYSFTR或 GYSFTRYWMN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID N0:62-63 中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10 个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3 区，该HCDR3区包括如在SEQ ID N0:64中列出的氨基酸序列GNFFYVMDY，或它的至少4、5、 6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的 氨基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID N0:65中列出的氨基酸序列RASQSIGTSIH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:66列出的氨基酸序列 ASESISG，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或 多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID N0:67中列出的 氨基酸序列QQSNFWPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0390] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0391] (a)SEQIDN0:67的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0392] (b)SEQIDN0:68的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0393] (c)如 SEQ ID N0:59-64 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0394] (d)如 SEQ ID N0S:65、66 和 67 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸； 和/或
[0395] (e)如 SEQ ID N0:59-64 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:65、 66和67中所示的轻链⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一个、 两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0396] (f)与具有SEQIDN0:57的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0397] (g)与具有SEQIDN0:58的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0398] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0399] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0400]抗体 12A10
[0401] 抗体12A10的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID N0:68,轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQ ID N0:69。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆抗 体12A10基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体12A10的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体12A10可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸 序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括12A10的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了 包括12A10的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括12A10的 重链可变区的三个⑶R。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括12A10的可 变轻链可变区，或12A10的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或 重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰 (例如取代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一 个包括抗体12A10的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白 恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0402] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 70-72中列出的氨基酸序列NYWMN、GYSFTN或 GYSFTNYWMN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:73-74 中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10 个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3 区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列DDFFTMDY，或它的至少4、5、6、 7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨 基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID NO:76中列出的氨基酸序列RASQNIVTSIH，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:77列出的氨基酸序列 YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或 多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID N0:78中列出的 氨基酸序列QQSNIWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0403] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0404] (a)SEQ ID N0:68的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0405] (b)SEQIDN0:69的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0406] (c)如 SEQ ID N0:70-75 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0407] (d)如 SEQ ID N0S:76、77 和 78 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸； 和/或
[0408] (e)如 SEQ ID N0:70-75 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:76、 77和78中所示的轻链⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一个、 两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0409] (f)与具有SEQIDN0:68的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0410] (g)与具有SEQ ID N0:69的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0411] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0412] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0413]抗体 10A7
[0414] 抗体10A7的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID N0:79,轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQ ID N0:80。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆抗 体10A7基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体10A7的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体10A7可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序 列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括10A7的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包 括10A7的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括10A7的重链 可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括10A7的可变轻链 可变区，或10A7的轻链可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R 中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取 代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括 抗体10A7的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区， 任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0415] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID N0:81-83中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或 GFSLSTSGMGVG，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO: 84-85中列出的氨基酸序列HIffffDDDRYYNPSLKS或HIWWDDDRY，或它们的至少4、5、6、7、 8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨 基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO: 86中列出的氨基酸序列RLNGYFDY，或它 的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被 取代为不同的氨基酸山CDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID NO:87中列出的氨基酸序列 RASQSISDYLH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一 个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR2区，该IXDR2区包括如在SEQ ID N0:88列出的 氨基酸序列YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸 中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID NO: 89 中列出的氨基酸序列QNGHSFPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中 这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0416] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0417] (a) SEQ ID NO: 79的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0418] (b)SEQ ID N0:80的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0419] (c)如 SEQ ID N0:81-86 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0420] (d)如 SEQ ID N0S:87、88 和 89 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸； 和/或
[0421] (e)如 SEQ ID N0:81 至86 中所示的重链CDR1、2和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:87、 88和89中所示的轻链⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一个、 两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0422] (f)与具有SEQIDN0:79的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0423] (g)与具有SEQIDN0:80的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0424] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0425] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0426] 抗体1部8
[0427] 抗体18E8的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQIDN0:90,轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQIDN0:91。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆抗 体18E8基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体18E8的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体18E8可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序 列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括18E8的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包 括18E8的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括18E8的重链 可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括18E8的可变轻链 可变区，或18E8的轻链可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R 中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取 代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括 抗体18E8的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区， 任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0428] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 92-94中列出的氨基酸序列SDYSWH、GYSITSD或 GYSITSDYSWH，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:95-96 中列出的氨基酸序列NIHYSGRINYNPSLRS或NIHYSGRIN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10 个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3 区，该HCDR3区包括如在SEQ ID N0:97中列出的氨基酸序列RRTFGNFEDY，或它的至少4、5、 6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的 氨基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID NO:98中列出的氨基酸序列RSSSSVNYMH， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸山CDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:99列出的氨基酸序列 ATSTLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或 多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID NO: 100中列出的 氨基酸序列QQWSSNPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0429] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0430] (a)SEQ ID N0:90的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0431] (b)SEQIDN0:91的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0432] (c)如 SEQ ID N0:92-97 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基 酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0433] (d)如 SEQ ID N0S:98、99 和 100 中所示的轻链 CDR1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3) 氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸； 和/或
[0434] (e)如 SEQ ID N0:92-97 中所示的重链CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸 序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:98、 99和100中所示的轻链⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中⑶R中的一 个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0435] (f)与具有SEQIDN0:90的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0436] (g)与具有SEQIDN0:91的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0437] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶Rl、2和3中的任一个可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0438] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0439]抗体 10F3
[0440] 抗体10F3的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO: 101，轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQ ID NO: 102。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆 抗体10F3基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体10F3的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体10F3可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序 列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括10F3的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包 括10F3的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括10F3的重链 可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括10F3的可变轻链 可变区，或10F3的轻链可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R 中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取 代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括 抗体10F3的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区， 任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0441] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID N0:103-105中列出的氨基酸序列SYTMH、GYTFTS或 GYTFTSYTMH，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸 中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO: 106-107中列出的氨基酸序列HNPSSGYTEYNQKFKD或HNPSSGYTE，或它们的至少4、5、 6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的 氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO: 108中列出的氨基酸序列GGDWDVDWFVY， 或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以 被取代为不同的氨基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID NO: 109中列出的氨基酸序 列SASSSISYMH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的 一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR2区，该IXDR2区包括如在SEQ ID NO: 110列 出的氨基酸序列STSKLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些 氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID NO: 111中列出的氨基酸序列QHRSTYPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序 列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0442] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0443] (a) SEQ ID NO: 101的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0444] (b) SEQ ID NO: 102的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0445] (c)如 SEQ ID NO: 103-108 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/ 或
[0446] (d)如 SEQ ID N0S:109、110 和 111 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨 基酸；和/或
[0447] (e)如 SEQ ID NO: 103-108 中所示的重链 CDR1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID 勵：109、110和111中所示的轻链0?1、2和3(10)1?1、10)1?2、10)1?3)氨基酸序列，其中0)1? 中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0448] (f)与具有SEQIDN0:101的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0449] (g)与具有SEQIDN0:102的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0450] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶Rl、2和3中的任一个可以 特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列 同一性的氨基酸序列。
[0451] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0452]抗体 I5F9
[0453] 抗体15F9的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO: 112,轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQ ID NO: 113。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆 抗体15F9基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体15F9的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体15F9可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序 列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括15F9的Fab或F (ab'）2部分。还提供了包 括15F9的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括15F9的重链 可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括15F9的可变轻链 可变区，或15F9的轻链可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R 中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取 代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括 抗体15F9的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区， 任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0454] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID NO: 114-116中列出的氨基酸序列SGYSWH、GYSITSG或 GYSITSGYSWH，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸 中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO: 117-118中列出的氨基酸序列FIHYSGSTDYNPSLKS或FIHYSGSTD，或它们的至少4、5、6、 7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨 基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO: 119中列出的氨基酸序列DYGHWYFDV，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被 取代为不同的氨基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID NO: 120中列出的氨基酸序列 KASQSVSYDVA，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一 个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR2区，该IXDR2区包括如在SEQ ID NO: 121列出 的氨基酸序列YASNRYT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨 基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID N0:122中列出的氨基酸序列QQDYSSLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序 列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0455] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0456] (a) SEQ ID NO: 112的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0457] (b) SEQ ID NO: 113的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0458] (c)如 SEQ ID NO: 114-119 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/ 或
[0459] (d)如 SEQ ID N0S:120、121 和 122 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨 基酸；和/或
[0460] (e)如 SEQ ID NO: 114-119 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:120、121和122中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR 中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0461] (f)与具有SEQ ID N0:112的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0462] (g)与具有SEQIDN0:113的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0463] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0464] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0465]抗体 14B4
[0466] 抗体14B4的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO: 123,轻链可变区的氨 基酸序列被列出为SEQ ID NO: 124。在一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合与单克隆 抗体14B4基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体14B4的抗原结合区。 在本文的任何实施方式中，抗体14B4可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序 列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括14B4的Fab或F(ab'） 2部分。还提供了包 括14B4的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括14B4的重链 可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括14B4的可变轻链 可变区，或14B4的轻链可变区的⑶R中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链⑶R 中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰（例如取 代、插入或缺失）。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括 抗体14B4的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区， 任选地是人类恒定区，任选地是人类IgGl或IgG3同种型。
[0467] 在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDRl 区，该HCDRl区包括如在SEQ ID N0:125-127中列出的氨基酸序列SYWMN、GYSFTS或 GYSFTSYWMN、或G，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基 酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO: 128-129中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它们的至少4、5、 6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的 氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO: 130中列出的氨基酸序列EMGPYTLDY，或 它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被 取代为不同的氨基酸；LCDRl区，该LCDRl区包括如在SEQ ID NO: 131中列出的氨基酸序列 RASQNIDTSIH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一 个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR2区，该IXDR2区包括如在SEQ ID NO: 132列出 的氨基酸序列YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨 基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；IXDR3区，该IXDR3区包括如在SEQ ID NO: 133中列出的氨基酸序列QQSNYWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序 列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
[0468] 在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
[0469] (a) SEQ ID NO: 123的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0470] (b) SEQ ID NO: 124的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取 代为不同的氨基酸；和/或
[0471] (c)如 SEQ ID NO: 125-130 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/ 或
[0472] (d)如 SEQ ID N0S:131、132 和 133 中所示的轻链 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、 LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨 基酸；和/或
[0473] (e)如 SEQ ID NO: 125-130 中所示的重链 CDR 1、2 和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨 基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID N0:131、132和133中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR 中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
[0474] (f)与具有SEQ ID N0:123的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的重链可变区,其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸；和/或
[0475] (g)与具有SEQIDN0:124的氨基酸序列的可变区至少60%、70%、80%、85%、 90%或95%相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的 氨基酸。
[0476] 在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的⑶R 1、2和3中的任一个可 以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应 SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95% 序列同一性的氨基酸序列。
[0477] 在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上（a)至（g)的单克隆抗体竞 争的抗体。
[0478]在本发明的任何抗体，例如 6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、 15F9或14B4中，指定的可变区和⑶R序列可以包括保守性序列修饰（1、2、3、4、5、6、7、8个 或更多个序列修饰）。保守性序列修饰是指并不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体 的结合特征的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域 已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体中。典型地， 保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被替换为具有侧链的氨基酸残基，该侧链具有类似的 理化特性。指定的可变区和CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、 缺失或取代。当做出取代时，优选的取代将是保守性修饰。在本领域已经限定了具有类似侧 链的氨基酸残基的多个家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）， 酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸），不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸），3分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）以及芳 香侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，本发明的抗体的CDR区 内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以 使用在此所述的测定来测试改变的抗体的保留功能（即在此列出的特性）。
[0479] 当在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时，术语"同一性"或"同一 的"是指多个多肽之间序列相关性的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间 的匹配数进行确定。"同一性"测量了具有通过具体的数学模型或计算机程序（即"算 法"）解决的间隙配准（如果有的话）的两个或更多个序列中的更小的序列之间的同一 性匹配的百分数。可以通过已知方法容易地计算相关多肽的同一性。相关方法包括但不 局限于，在以下文献中描述的那些！Computational Molecular Biology(计算分子生物 学），Lesk (莱斯克），A. M.，编辑，Oxford University Press (牛津大学出版社），纽约， 1988 ;Biocomputing: Informatics and Genome Projects (生物计算：信息学和基因组工 程），Smith (史密斯），D. W.，编辑，Academic Press (学术出版社），纽约，1993 !Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析），部分1，Griffin(格里芬），A. M., 和Griffin (格里芬），H. G.，编辑，Humana Press (人类出版社），新泽西州，1994 !Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物学中的序列分析），von Heinje (冯海因切）， G.，Academic Press (学术出版社），1987 !Sequence Analysis Primer(序列分析引物）， Gribskov (哥博斯科夫），M?和 Devereux (德弗罗?），J.，编辑，M. Stockton Press (M?斯托 克顿出版社），纽约，1991 ;以及Carillo (卡里罗）等人，SIAM J. Applied Math?(工业与应 用数学学会应用数学杂志）48, 1073(1988)。
[0480] 优选的用于确定同一性的方法被设计为给出所测试序列之间的最大匹配。确定 同一性的方法描述于公开可获得的计算机程序中。优选的用于确定两个序列之间同一性 的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP (Devereux (德弗罗）等人，Nucl. Acid. Res. (核酸研究）12, 387 (1984) ;Genetics Computer Group (遗传学计算机组），University of Wisconsin(威斯康星州大学），Madison(麦迪逊），威斯康星州），BLASTP，BLASTN，以及 FASTA (Altschul (阿特休尔）等人，J. Mol. Biol?(分子生物学杂志）215, 403-410 (1990))。 BLASTX程序是从生物技术信息国家中心（NCBI)和其他来源（BLAST手册，Altschul (阿特 休尔）等人，NCB/NLM/NIH Bethesda (贝塞斯达），马里兰州20894 ;阿特休尔等人，同上） 公开可获得的。还可以使用熟知的史密斯-沃特曼算法确定同一性。
[0481]根据 AbM (Oxford Molecular' s AbM ant ibody model I ing software definition(牛津分子 AbM 抗体建模软件定义）），Kabat and Chothia definitions systems (卡巴特和乔西亚定义体系），⑶R的序列已经概述于下表A中。虽然可以使用 任何适合的编号体系来指定CDR区，但在任何其他指示不存在的情况下，在此使用的编号 是Abm。已经使用以下指示建立了这样的编号：⑶R-Ll :起始：大约残基24,残基前：总 是 Cys,残基后：总是 Trp(典型地为 Trp-Tyr-Gln,而且为 Trp-Leu-Gln，Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu)，长度：10至17个残基；CDR-L2 :起始：在Ll的末端之后总是16个残基，残基 前：通常为116-171'(并且还有￥&1-1 71'、116-1^8、116-?1^)，长度：总是7个残基；0)1?-13， 起始：在L2的末端之后总是33个残基，残基如：总是Cys，残基后：总是Phe_Gly-Xaa_Gly， 长度：7至11个残基；⑶R-H1，起始：大约残基26(总是在Cys之后4个）（乔西亚/AbM定义， 卡巴特定义开始于5个残基之后），残基前：总是Cys-Xaa-Xaa-Xaa,残基后：总是Trp (典型 地为Trp-Val,并且还有Trp-Ile，Trp-Ala)，长度：10至12个残基（AbM定义，乔西亚定义排 除最后4个残基）；CDR-H2,起始：在CDR-Hl的卡巴特/AbM定义的末端之后总是15残基，残 基前：典型地为 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (但有多个变化，在 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/ Ala-Thr/Ser/Ile/Ala之后的残基），长度：卡巴特定义16至19个残基；AbM(和乔西亚）定 义在7个残基前终止；⑶R-H3,起始：在⑶R-H2末端之后总是33残基（在Cys之后总是2 个），残基前：总是Cys-Xaa-Xaa (典型地为Cys-Ala-Arg)，残基后：总是Trp-Gly-Xaa-Gly, 长度3至25个残基。
[0482] 根据本发明的抗体可变链的序列列于下表B中，前导子序列在每个序列的开始处 加有下划线（任何抗体链可以被指定为在紧随于前导子序列末端之后的氨基酸位置处起 始），并且每个CDR加有下划线。在此处的任何实施方式中，VL或VH序列可以被指定或编 号从而使得包含或缺乏信号肽或其任何部分。
[0483] 在一个实施方式中，本发明的抗体具有人类IgGl或IgG3同种型。在一个实施方 式中，本发明的抗体是保持其结合和/或功能特性的抗体片段。
[0484]表 A
[0485]
【权利要求】
1. 一种单克隆抗体，其结合至包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的MICA多肽。
2. 如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的特征在于通过流式细胞术确定的下述 EC50:对于与在其表面表达包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的MICA多肽的细胞、在其表 面表达包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽的细胞、以及在其表面表达包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的MICA多肽的细胞的结合而言，该EC50至多5μ g/ml，任选地至多 3 μ g/ml、至多 2 μ g/ml、至多 1 μ g/ml 或至多 0· 5 μ g/ml。
3. 如权利要求1-2所述的抗体，其中所述抗体进一步结合至包括SEQ ID NO:3的氨基 酸序列的MICA多肽；任选地，其中所述抗体的特征在于对于与在其表面表达所述MICA多肽 的细胞的结合而言至多5 μ g/ml，任选地至多3 μ g/ml、至多2 μ g/ml、至多1 μ g/ml或至多 0· 5μ g/ml 的 EC50。
4. 如权利要求1-3所述的抗体，其中所述抗体进一步结合至包括SEQ ID N0:6的氨基 酸序列的MICB多肽；任选地，其中所述抗体的特征在于对于与在其表面表达所述MICB多肽 的细胞的结合而言至多5 μ g/ml，任选地至多3 μ g/ml、至多2 μ g/ml、至多1 μ g/ml或至多 0· 5μ g/ml 的 EC50。
5. 如权利要求1-4所述的抗体，其中所述抗体结合至SEQ ID NO: 1的MICA多肽的α? 和/或α 2结构域。
6. 如权利要求1-5所述的抗体，其中所述抗体不抑制MICA在NKG2D表达细胞中诱导 NKG2D活性的能力。
7. 如权利要求1-5所述的抗体，其中所述抗体阻断MICA与NKG2D的相互作用。
8. 如权利要求1-5或7所述的抗体，其中所述抗体抑制sMICA诱导的NKG2D在细胞的 表面上的表达的下调。
9. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至表位，该表位包括选自 下组的任何一个或多个氨基酸残基，该组由以下组成：SEQ ID NO: 1的MICA多肽的R6、N8、 Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、 D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、 S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 以及 D232。
10. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有至突变型MICA多肽的减 少的结合，该突变型MICA多肽在以下各项处包括突变 ： (a) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、 V53 和 L54 ; (b) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和 R64 ； (c) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ; (d) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ; (e) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105、N121、E123、T124 和 E126 ; (f) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或 (g) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 和 D232， 在每种情况下相对于所述抗体与SEQ ID NO: 1的野生型MICA多肽之间的结合。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述抗体结合至SEQ ID NO: 1的MICA 多肽的α 3结构域。
12. 如权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至SEQ ID NO: 1的MICA 多肽的α 1和/或α 2结构域。
13. -种单克隆抗体，其结合SEQ ID NO: 1的人类MICA多肽，其中所述抗体不阻断MICA 与NKG2D的相互作用并且不阻断MICA自MICA-表达细胞脱落。
14. 一种单克隆抗体，其结合SEQ ID NO: 1的人类MICA多肽，其中所述抗体抑制sMICA 诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调而不阻断MICA自MICA表达细胞脱 落。
15. -种单克隆抗体，其结合至SEQ ID N0:1的MICA多肽的α 1和/或α 2结构域，其 中所述抗体不阻断MICA与NKG2D的相互作用和/或不抑制MICA在NKG2D表达细胞中诱导 NKG2D活性的能力。
16. -种单克隆抗体，其结合至SEQ ID NO: 1的MICA多肽的α 3结构域，其中所述抗体 阻断MICA与NKG2D的相互作用和/或抑制sMICA诱导的NKG2D在NKG2D表达细胞中的活 性。
17. 如权利要求16所述的抗体，其中所述抗体抑制sMICA诱导的NKG2D在细胞的表面 上的表达的下调。
18. 如权利要求13-17所述的抗体，其中所述抗体结合至包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序 列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID N0:4的氨基酸 序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MICA多肽。
19. 如权利要求18所述的抗体，其中所述抗体结合至包括SEQ ID N0:6的氨基酸序列 的MICB多肽和/或包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的MICA多肽。
20. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至包括0联和/或N联聚 糖的MICA多肽，任选地其中所述抗体结合至由肿瘤细胞表达的糖基化MICA多肽。
21. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体不阻断MICA自细胞脱落。
22. -种单克隆抗体，其结合SEQ ID NO: 1的MICA多肽，其中所述抗体具有至突变型 MICA多肽的减少的结合，该突变型MICA多肽在以下各项处包括突变： (a) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、 V53 和 L54 ; (b) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和 R64 ； (c) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143 和 N144 ; (d) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、 H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143 和 N144 ; (e) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、 S103、T104、R105、N121、E123、T124 和 E126 ; (f) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、 E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179 和 R180 ;或 (g) 选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、 T227、Q228、Q229、W230 和 D232， 在每种情况下相对于所述抗体与SEQ ID NO: 1的野生型MICA多肽之间的结合。
23. -种单克隆抗体，其结合至表位，该表位包括选自下组的任何一个或多个氨基酸残 基，该组由以下各项组成：SEQ ID N0:1 的 MICA 多肽的 R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、 N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、 H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、 M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230 以及 D232。
24. 如前面权利要求中任一项所述的抗体，其中对于与SEQ ID N01的MICA多肽的结 合，所述抗体与选自下组的抗体竞争，该组由以下各项组成： (a) 分别具有SEQ ID N0:7和8的VH和VL区的抗体（6E4); (b) 分别具有SEQ ID NO: 20和21的VH和VL区的抗体（20C6); (c) 分别具有SEQ ID N0:33和34的VH和VL区的抗体（16A8); ⑷分别具有SEQ ID N0:46和47的VH和VL区的抗体（19E9); (e)分别具有SEQ ID N0:57和58的VH和VL区的抗体（9C10); ⑴分别具有SEQ ID N0:68和69的VH和VL区的抗体（12A10); (g) 分别具有SEQ ID N0:79和80的VH和VL区的抗体（10A7); (h) 分别具有SEQ ID N0:90和91的VH和VL区的抗体（18E8); (i) 分别具有SEQ ID NO: 101和102的VH和VL区的抗体（10F3); (j) 分别具有SEQIDN0:112和113的VH和VL区的抗体（15F9);以及 (k) 分别具有SEQ ID NO: 123和124的VH和VL区的抗体（14B4)。
25. 根据以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括轻链和重链，所述轻链 包括： a包括具有式VI的氨基酸序列（SEQ ID N0:266)的轻链CDRl(LCDRl); b包括具有式VII的氨基酸序列（SEQ ID N0:267)的轻链CDR2(LCDR2);和 c包括具有式VIII的氨基酸序列（SEQ ID N0:268)的轻链CDR3(LCDR3); 所述重链包括： d包括选自式I、II以及III的氨基酸序列（分别为SEQ ID NO:261、262以及263)的 重链 CDR1 (HCDR1);和 / 或 e包括具有式IV的氨基酸序列（SEQ ID N0:264)的重链CDR2(HCDR2);和/或 f包括具有式V的氨基酸序列（SEQ ID N0:265)的重链CDR3(HCDR3)。
26. 选自下组的单克隆抗体，该组由以下各项组成： (a) 单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO:7的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:8的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (b) 单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO: 20的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:21的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (c) 单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO: 33的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:34的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； ⑷单克隆抗体，其包括⑴包括SEQ ID NO: 46的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:47的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (e)单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO: 57的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:58的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； ⑴单克隆抗体，其包括⑴包括SEQ ID NO:68的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:69的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (g) 单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO: 79的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:80的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (h) 单克隆抗体，其包括⑴包括SEQ ID NO: 90的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链以 及（ii)包括SEQ ID N0:91的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (i) 单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO: 101的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链 以及（ii)包括SEQ ID NO: 102的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链； (j) 单克隆抗体，其包括⑴包括SEQ ID NO: 112的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链 以及（ii)包括SEQ ID NO: 113的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链；以及 (k) 单克隆抗体，其包括（i)包括SEQ ID NO: 123的重链可变区的⑶Rl、2和3的重链 以及（ii)包括SEQ ID NO: 124的轻链可变区的⑶Rl、2和3的轻链。
27. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括结合人类Fc γ IIIA受体 的人类重链恒定区。
28. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体对于结合至MICA多肽具有小 于1(Γ9Μ的二价Kd。
29. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人类抗体或人源 化抗体。
30. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是四聚体抗体。
31. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中该抗体是选自以下的抗体片段：Fab、 Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包括多个不同抗体片段的多特异性 抗体。
32. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体共轭或共价地结合至毒剂。
33. 如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体共轭或共价地结合至可检测 部分。
34. -种抗体，其通过嵌合化或人源化如权利要求1至28所述的抗体而获得。
35. -种药物组合物，其包括根据以上权利要求中任一项所述的抗体以及药学上可接 受的载体。
36. 如权利要求35所述的组合物，其中所述抗体以约25mg与500mg之间的量存在。
37. -种试剂盒，其包括如以上权利要求中任一项所述的抗体，任选地进一步包括特异 性识别如以上权利要求中任一项所述的抗体的标记的第二抗体。
38. -种杂交瘤或重组宿主细胞，其产生如权利要求1至28所述的抗体。
39. -种用于治疗或预防对其有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者 给予有效量的如权利要求1-34所述的抗体或如权利要求35-36所述的组合物。
40. 如权利要求39所述的方法，其中所述疾病是癌症。
41. 一种用于在对象中鉴定MICA表达细胞的方法，所述方法包括从对象获得包括细胞 的生物样品，使所述细胞与如权利要求1-34所述的抗体接触并且评价所述抗体是否结合 至所述细胞。
42. -种用于在对象中鉴定MICA表达疾病相关细胞的方法，所述方法包括从对象获得 包括疾病相关细胞的生物样品，使所述疾病相关细胞与如权利要求1-34所述的抗体接触 并且评价所述抗体是否结合至疾病相关细胞，其中所述抗体结合至疾病相关细胞的发现指 示所述对象罹患疾病、所述对象具有疾病相关细胞和/或所述疾病相关细胞表达MICA。
43. -种用于选择罹患对用如权利要求1-34所述的抗体的治疗应答的对象的方法，所 述方法包括确定所述对象中的肿瘤细胞是否表达MICA多肽，任选地肿瘤细胞是否表达升 高水平的MICA多肽，MICA多肽或升高水平的MICA多肽的所述表达是应答对象的指征。
44. 如权利要求43所述的方法，进一步包括向应答对象给予如权利要求1-34所述的抗 体。
45. 如权利要求42-44所述的方法，其中所述疾病是癌症。
46. 如权利要求42-45所述的方法，其中所述疾病相关细胞或肿瘤细胞表达糖基化 MICA多肽，任选地是包括一个或多个核心20-聚糖的MICA多肽。
47. 如权利要求41-46所述的方法，其中所述方法在确定所述对象、所述疾病相关细胞 或所述肿瘤细胞是否包括选自下组的MICA等位基因之前没有另外的步骤，该组由以下各 项组成 ：MICA*001、MICA*004、MICA*007 以及 MICA*008。
【文档编号】A61K39/395GK104244977SQ201380017820
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月7日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】M·布莱瑞, L·高蒂尔, I·佩罗特, C·邦纳福斯 申请人:先天制药公司