用于心血管疾病和其它病况的旁分泌基因的全身性递送和受调节的表达的制作方法
【专利摘要】在替代性实施方案中，本发明提供了用于治疗、改善或防止（预防）个体或患者的对体内升高的旁分泌多肽水平有反应的疾病、感染或病况的方法，所述方法包括：提供可操作地连接到转录调节序列的编码旁分泌多肽的核酸或基因；或其中已含有编码旁分泌的核酸或基因的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物能够在细胞中或体内表达所述编码旁分泌的核酸或基因；以及向有需要的个体或患者施用或递送可操作地连接到转录调节序列的所述编码旁分泌多肽的核酸或基因，或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，从而治疗、改善或防止（预防）所述个体或患者的对升高的旁分泌多肽水平有反应的所述疾病、感染或病况。
【专利说明】用于心血管疾病和其它病况的旁分泌基因的全身性递送和 受调节的表达
[0001] 关于对根据联邦政府资助的研究作出的本发明的权利的声明
[0002] 本发明是在政府支持下根据国家卫生研究院（National Institutes of Health, NIH)的DHHS授予的拨款号HL088426作出的。政府拥有本发明的某些权利。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及细胞和分子生物学以及医学。本发明提供了组合物以及体外和离体方 法。在替代性实施方案中，本发明提供了用于治疗、改善或防止（预防）个体或患者的对 体内升高或持续的旁分泌多肽水平有反应的疾病、感染或病况的方法，所述方法包括：提供 可操作地连接到转录调节序列的编码旁分泌多肽的核酸或基因；或其中已含有编码旁分泌 的核酸、基因、转录物或信使的表达运载体（vehicle)、载体、重组病毒或等同物，并且所述 表达运载体、载体、重组病毒或等同物能够在细胞中或体内表达所述编码旁分泌的核酸、基 因、转录物或信使；以及向有需要的个体或患者施用或递送可操作地连接到转录调节序列 的所述编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使，或所述表达运载体、载体、重组病毒或 等同物，从而治疗、改善或防止（预防）所述个体或患者的对升高的旁分泌多肽水平有反应 的所述疾病、感染或病况。
【背景技术】
[0004] 最近，已显示，静脉内注射编码血友病B中缺乏的人类因子IX的病毒载体使得患 有血友病B的受试者的血清中因子IX的浓度升高到降低了所述受试者对外源性因子IX输 注的需求的程度。然而：1)这种蛋白质并不处在受调节的表达之下，并且因此，不能够对血 清中所述转基因的水平进行最佳的调控；2)这种系统未提供在不希望或出乎意料的作用 的情况下关闭转基因表达的手段；以及3)所述基因，即因子IX不是旁分泌基因，并且不具 有有益的心血管作用，并且因此，不能用于治疗心脏病。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了用于治疗、改善或防止（预防）个体或患者的对体内升高的旁分泌 多肽水平有反应的任何疾病、感染或病况的方法。在替代性实施方案中，本发明提供了用于 治疗、改善或防止（预防）对体内升高或持续的肽或旁分泌多肽水平有反应的疾病、感染或 病况的方法，所述方法包括：
[0006] (a) (i)提供可操作地连接到转录调节序列的编码旁分泌多肽的核酸或基因；或 其中已含有编码旁分泌的核酸或基因或者表达旁分泌多肽的核酸、转录物或信使的表达运 载体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物能够在细胞 中或体内表达所述编码旁分泌的核酸、基因、转录物或信使；以及
[0007] (ii)向所述细胞或者有需要的个体或患者施用或递送可操作地连接到转录调节 序列的所述编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使、或者所述表达运载体、载体、重组 病毒或等同物，
[0008] 从而治疗、改善或防止（预防）所述个体或患者的对升高或持续的旁分泌多肽水 平有反应的所述疾病、感染或病况；
[0009] (b) (a)的方法，其中所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物是或包括：
[0010] 腺相关病毒（AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，
[0011] AAV 血清型 AAV5、AAV6、AAV8 或 AAV9，
[0012] 源自恒河猴的AAV、或源自恒河猴的AAV AAVrh. 10hCLN2，
[0013] AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，
[0014] 嗜器官性AAV、或嗜心性AAV、或嗜心性AAVM41突变体，
[0015] 其中任选地，将所述AAV工程化以提高靶向对野生型（wt)AAV不许可的特定细胞 类型的效率和/或提高仅感染所关注的细胞类型的功效，
[0016] 并且任选地，通过一种或多种修饰将杂合体AAV重新定向或工程化成杂交体血清 型，所述一种或多种修饰包括：1)衣壳转移；2)使双特异性抗体吸附至衣壳表面；3)将镶 嵌型衣壳工程化；和/或4)将嵌合型衣壳工程化；
[0017] (c) (a)的方法，其中所述编码旁分泌的核酸、基因、转录物或信使被可操作地连接 到受调节的或可诱导的转录调节序列；
[0018] (d) (c)的方法，其中所述受调节的或可诱导的转录调节序列是受调节的启动子或 可诱导的启动子，
[0019] 其中任选地，转录和/或翻译的正调控因子（激活子）和/或负调控因子（阻遏 子）可操作地连接到所述编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使；
[0020] (e) (a)至⑷中任一项的方法，其中向有需要的个体或患者施用可操作地连接到 转录调节序列的所述编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使、或所述表达运载体、载 体、重组病毒或等同物使得旁分泌蛋白被释放到血流或周身循环中，或使得所述旁分泌蛋 白在细胞中的表达增加或持续，
[0021] 其中任选地，所述旁分泌蛋白的释放或者所述旁分泌蛋白的表达增加或持续是依 赖于可诱导的启动子的激活或阻遏子的去阻遏，所述可诱导的启动子和阻遏子可操作地连 接到所述编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使；或
[0022] (f) (a)至（e)中任一项的方法，其中对体内升高的旁分泌多肽水平有反应的所 述疾病、感染或病况是心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭（CHF);心脏纤维化（cardiac fibrosis);心肌细胞疾病、功能障碍或细胞凋亡；肺动脉高压；心脏、皮肤、肝脏、肺、肌肉、 神经、脑或肾脏疾病、癌症或功能障碍；癌症或瘤形成；或者血友病或血友病B。
[0023] 在本发明的方法的替代性实施方案中：
[0024] (a)通过口服、肌内（IM)注射、通过静脉内（IV)注射、通过皮下（SC)注射或真皮 内注射、通过鞘内注射、通过动脉内（IA)注射、通过冠状动脉内注射、通过吸入或通过生物 射弹粒子递送系统、或使用"基因枪"、气手枪或HELIOS?基因枪（加利福尼亚州赫拉克勒斯 的伯乐实验室公司（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA))向有需要的个体或患者施用或 递送可操作地连接到所述转录调节序列的所述编码旁分泌的核酸或基因；或者所述表达运 载体、载体、重组病毒或等同物；或者
[0025] (b)通过引入到体内靠近血流或由血流引流的任何组织或体液间隙中向有需要的 所述个体或患者施用或递送可操作地连接到所述转录调节序列的所述编码旁分泌的核酸 或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，从而使得该所编码的蛋白质可以由 所述组织中的细胞分泌并且被释放到所述血流中。
[0026] 在本发明的方法的替代性实施方案中：所述旁分泌多肽或肽是或包括：哺乳动物 强心肽、生长因子、重组人松弛素-2(Serelaxin)、松弛素-2、尿皮质素-2(Urocortin_2， UCn-2)、尿皮质素-1 (UCn-1)、尿皮质素-3 (UCn-3)、脑利钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰 岛素样生长因子-1或其任何组合；或人强心肽、人生长因子、重组人松弛素-2、松弛素-2、 尿皮质素-2、尿皮质素-1、尿皮质素_3、脑利钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰岛素样生长 因子-11或其任何组合。
[0027] 在本发明的方法的替代性实施方案中：所述旁分泌多肽是尿皮质素、尿皮质 素-2、尿皮质素-1、尿皮质素-3、松弛素-2或脑利钠肽，并且所述疾病或病况是充血性心力 衰竭（CHF);或所述旁分泌多肽是前列环素合酶并且所述疾病或病况是肺动脉高压，以及 所述疾病或病况是充血性心力衰竭（CHF);或所述旁分泌多肽是前列环素合酶并且所述疾 病或病况是肺动脉高压。
[0028] 在本发明的方法的替代性实施方案中：
[0029] (a)向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达旁 分泌的核酸或基因表达，或者诱导或激活诱导所述表达旁分泌的核酸或基因表达的启动子 (例如可操作地连接到所述旁分泌表达核酸或基因）；
[0030] (b)向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号诱导启动子，任 选地表达旁分泌的核酸或基因特异性启动子（例如可操作地连接到所述表达旁分泌的核 酸或基因），的激活子的合成；
[0031] (c)向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达旁 分泌的核酸或基因或者所述表达旁分泌的核酸或基因特异性启动子的天然激活子或合成 激活子的合成，
[0032] 其中任选地，所述天然激活子是内源性转录因子；
[0033] (d) (c)的方法，其中所述合成激活子是被设计成特异性并且选择性地启动内源性 或外源性靶标基因的锌指DNA结合蛋白，其中任选地，所述内源性靶标是表达基因旁分泌 的核酸或基因、或者表达旁分泌的核酸或基因的激活子、或者可操作地连接到表达旁分泌 的核酸或基因的启动子的激活子；
[0034] (e) (a)至（c)中任一项的方法，其中所述刺激或信号包括生物刺激或信号、光刺 激或信号、化学品刺激或信号或药物刺激或信号；
[0035] (f)向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号刺激或诱导表达 旁分泌的核酸或基因的转录后激活子的表达或可操作地连接到表达旁分泌的核酸或基因 的启动子的激活子的表达，或
[0036] (g)向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号抑制表达旁分泌 的核酸或基因的转录阻遏子或转录后阻遏子或诱导对表达旁分泌的核酸或基因的转录阻 遏子或转录后阻遏子的抑制。
[0037] 在本发明的方法的替代性实施方案中：诱导所述表达旁分泌的核酸或基因表 达，或者诱导可操作地连接到所述表达旁分泌的核酸或基因的所述受调节启动子或可诱 导的启动子表达的化学品或药物是口服抗生素、多西环素（doxycycline)或雷帕霉素 (rapamycin);或使用利用多西环素的tet调节系统来诱导所述表达旁分泌的核酸或基因 或者其等同物的表达。
[0038] 在本发明方法的替代性实施方案中：将所述表达旁分泌的核酸或基因或者所述表 达运载体、载体、重组病毒或等同物配制成液体、凝胶、水凝胶、粉剂或水性制剂。
[0039] 在本发明方法的替代性实施方案中：将所述表达旁分泌的核酸或基因或者所述表 达运载体、载体、重组病毒或等同物或者所述尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多肽配制于囊泡、月旨 质体、纳米粒子或纳米脂质粒子（NLP)或等同物中，或者将其配制用于使用囊泡、脂质体、 纳米粒子或纳米脂质粒子（NLP)或等同物递送。
[0040] 在本发明方法的替代性实施方案中：将所述表达旁分泌的核酸或基因或者所述表 达运载体、载体、重组病毒或等同物配制于、或插入或转染到分离的或培养的细胞中，并且 任选地，所述细胞是哺乳动物细胞、心脏细胞、或人细胞、非人灵长类动物细胞、猴细胞、小 鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞、山羊细胞、牛细胞、马细胞、绵羊细胞、犬科 动物（canine)细胞或猫科动物（feline)细胞。
[0041] 在本发明方法的替代性实施方案中：将所述表达旁分泌的核酸或基因或者所述表 达运载体、载体、重组病毒或等同物或者所述尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽配制成药物或 无菌制剂。
[0042] 在本发明方法的替代性实施方案中：将所述表达旁分泌的核酸或基因或者所述表 达运载体、载体、重组病毒或等同物或者所述尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽与制品、人工器 官或植入物一起、在所述制品、人工器官或植入物上或者联同所述制品、人工器官或植入物 来配制或递送。
[0043] 在本发明方法的替代性实施方案中：所述表达旁分泌的核酸或基因或者所述表达 运载体、载体、重组病毒或等同物在体外或离体表达旁分泌多肽。
[0044] 在替代性实施方案中，本发明提供了用于治疗、改善或防止（预防）个体或患者的 旁分泌反应性病变、感染、疾病、病症或病况的方法，所述方法包括实施本发明的方法。
[0045] 在替代性实施方案中，本发明提供了用于治疗、改善或防止（预防）以下疾病的方 法：心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭（CHF);心脏纤维化；心肌细胞疾病、功能障碍或细 胞凋亡；肺动脉高压；心脏、皮肤、肝脏、肺、肌肉、神经、脑或肾脏的疾病、癌症或功能障碍； 癌症或瘤形成；或者血友病或血友病B，所述方法包括实施本发明的方法。
[0046] 在替代性实施方案中，本发明提供了治疗、改善或防止（预防）患者或个体的糖尿 病或糖尿病前期的方法，所述方法包括：
[0047] (a)实施本发明的方法，其中所述旁分泌多肽或肽包含尿皮质素-2(UCn_2)或由 尿皮质素 _2 (UCn-2)组成；以及
[0048] (b)向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多肽，或者编码尿皮质 素-2 (UCn-2)的核酸、基因、信使或转录物，
[0049] 其中任选地，所述尿皮质素-2(UCn_2)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或 拟肽（peptidomimetic)的肽或多肽或者其变体，
[0050] 从而治疗、改善或防止（预防）所述患者或个体的糖尿病或糖尿病前期。
[0051] 在替代性实施方案中，本发明提供了治疗、改善或防止（预防）患者或个体的肥胖 症的方法，所述方法包括：
[0052] (a)实施本发明的方法，其中所述旁分泌多肽或肽包含尿皮质素-2(UCn_2)或由 尿皮质素 _2 (UCn_2)组成；以及
[0053] (b)向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多肽，或者编码尿皮质 素-2(UCn-2)的核酸、基因、信使或转录物，
[0054] 其中任选地，所述尿皮质素-2(UCn_2)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或 拟肽的肽或多肽或者其变体，
[0055] 从而治疗、改善或防止（预防）所述患者或个体的肥胖症。
[0056] 在替代性实施方案中，本发明提供了在患者或个体中抑制体重增加、或抑制食欲、 或刺激或引发体重减轻的方法，所述方法包括：
[0057] (a)实施本发明的方法，其中所述旁分泌多肽或肽包含尿皮质素-2(UCn_2)或由 尿皮质素_2 (UCn-2)组成；以及
[0058] (b)向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多肽，或者编码尿皮质 素-2 (UCn-2)的核酸、基因、信使或转录物，
[0059] 其中任选地，所述尿皮质素-2(UCn_2)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或 拟肽的肽或多肽或者其变体，
[0060] 从而在所述患者或个体中抑制体重增加、或抑制食欲、或刺激或引发体重减轻。
[0061] 在替代性实施方案中，将所述尿皮质素_2(UCn-2)肽或多肽配制于囊泡、脂质 体、纳米粒子或纳米脂质粒子（NLP)中或配制成囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子 (NLP)，或者将其配制用于：口服施用、肌内（IM)注射、静脉内（IV)注射、皮下（SC)注射或 真皮内注射、鞘内注射、动脉内（IA)注射、冠状动脉内注射、吸入或通过气溶胶施用。
[0062] 本发明的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下的说明中。根据所述说明 和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的以及优势将是显而易见的。
[0063] 本文引用的所有公布、专利、专利申请在此以引用的方式明确并入本文用于所有 目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0064] 图1图示了如以下实施例2中所述的包含编码IGF1的AAV5的本发明的示例性构 建体。
[0065] 图2A和图2B图示了来自如以下实施例2中所述的如下研究的数据，在所述研 究中，使用本发明的示例性AAV5. IGFI. tet构建体感染培养的新生大鼠心肌细胞，并且对 IGFI进行诱导、表达，然后进行测量。
[0066] 图3以图表方式图示了如以下实施例2中所述在培养的新生大鼠心肌细胞中，在 使用示例性AAV5. IGFI-tet进行基因转移后，在添加多西环素（doxicillin)以及将多西环 素去除的情况下IGFI mRNA表达的受调节的表达。
[0067] 图4A图示了显示出在AAV5. EGFP基因在大鼠中转移后的3周时，在单侧胫骨前肌 中的EGFP表达的显微照片；并且图4B是表4,其汇总了来自对骨骼肌IGFI表达在CHF中 的作用进行测量的超声心动描记术的数据，如以下实施例2中所述。
[0068] 图5图示了如以下实施例2中所述用于本发明的示例性AAV5. IGFI. tet在CHF中 在骨骼肌中进行基因转移的实验方案。
[0069] 图6图示了 AAV5. IGFI-tet基因转移对心脏凋亡和纤维化的作用：图6A以图表方 式图示了来自TUNEL染色的数据，所述数据指示IGFI表达的激活（IGF启动型）与减少的 心肌细胞凋亡有关；图6B图示了来自IGF关闭型和IGF启动型大鼠的未梗塞的室间隔的经 过苦味酸天狼猩红染色的切片，其示出了心脏纤维化减少，并且胶原面积分数减小；并且图 6C以图表方式图示了来自所述IGF关闭型和IGF启动型大鼠的这一数据，如以下实施例2 中所述。
[0070] 图7以图表方式图示了如以下实施例2中所述在如下施用本发明的示例性AAV5 构建体时：向小鼠静脉内递送，向大鼠肌内递送，静脉内施用在使IGFI的血清水平升高方 面给出的结果优于肌内施用
[0071] 图8以图表方式并且通过图像图示了如下数据，如以下实施例2中所述，所述数据 显示出在使用肝脏和心脏中的拷贝数和转基因表达作为终点的情况下，静脉内递送本发明 的示例性AAV5和AAV9构建体的相对功效。
[0072] 图9图示了如以下实施例2中所论述，在实施本发明的方法时，用于确定和测试用 于所需的或具体的适应症的最适当载体的示例性方案。
[0073] 图10A、10B、10C、10D、10E以及10F图示了如以下实施例2中所述的本发明的示例 性载体构建体。
[0074] 图11以图表方式图示了如下的数据，如以下实施例3中所述，所述数据显示静 脉内AAV8对于旁分泌方法来说是最佳的载体和递送途径以达到持续升高的血清尿皮质 素-2(UCn-2)水平。
[0075] 图12A以图表方式图示了在静脉内施用示例性AAV8.CBA.UCn2构建体之后， UCn2mRNA在肝脏中表达的时间过程；并且图12B以图表方式图解了如下的数据，所述数据 显示了在静脉内施用AAV8. CBA. UCn2后的6周时，LV中UCn2mRNA的表达，如以下实施例3 中所述。
[0076] 图13以图表方式图示了来自如下研究的数据，所述研究通过以静脉内（IV)递送 向正常小鼠递送本发明的示例性AAV8. UCn2构建体来确定UCn2基因转移是否增强LV功 能：图13A以图表方式图示了如下的数据，所述数据显示UCn2基因转移增强了 LV的收缩功 能；图13B以图表方式图示了如下的数据，所述数据显示-dP/dt也降低，这指示增强的LV 舒张，如以下实施例3中所述。
[0077] 图14图示了显示出UCn2转移对衰竭心脏的作用的数据：图14A图示了研究方案； 并且图14B和14C图示了显示出UCn2转移对衰竭心脏的作用的数据，如以下实施例3中所 述。
[0078] 图15图示了数据，图15A通过图表图示了所述数据，图15B通过免疫印迹图示了 所述数据，其中正常小鼠接受示例性AAV8.CBA.UCn2的静脉内递送；并且在四周后，来自 UCn2基因转移组的LV样本显示SERCA2a蛋白质表达增加到2倍，如以下实施例3中所述。
[0079] 图16示出了在UCn2基因转移后Ca2+瞬变的数据：图16A以图表方式图示了 UCn2 基因转移使得Ca2+下降的速率增大；图16B以图表方式图示了在来自4周前已接受UCN2基 因转移的小鼠的心肌细胞中Ca 2+瞬变衰减的时间缩短，如以下实施例3中所述。
[0080] 图17示出了如下的数据，UCn2保护培养的新生大鼠心肌细胞免遭缺氧性损伤：图 17A图示了在NaN3&理后的24小时之时，UCn2维持了形态正常性；图17B以图表方式图示 了 UCn2减少了在NaN3处理后LDH的释放，如以下实施例3中所述。
[0081] 图18以图表方式图示了如以下实施例3中所述，在静脉内递送本发明的示例性 UCn2. CBA. UCn2构建体后的4周，在LV样本中检测到CREB (图18A)和β -联蛋白（图18B) 这两者的磷酸化。
[0082] 图19图示了如下的数据，所述数据显示UCn2影响葡萄糖调节：小鼠接受示例性 AAV8. CBA. UCn2的静脉内递送：图19A图示了在UCn2组中观测到空腹血糖小幅降低；图19B 图示了如下的结果，所述结果指示UCn2基因转移促进了葡萄糖的利用并且防止了饮食诱 发的高血糖症，如以下实施例3中所述。
[0083] 图20A、20B、20C、20D、20E以及20F图示了如以下实施例3中所述的本发明的示例 性构建体。
[0084] 在各个附图中同样的附图标记指示同样的元件。
【具体实施方式】
[0085] 本发明提供了组合物以及体内和离体方法，所述方法包括施用编码旁分泌的核 酸、基因、转录物或信使以治疗、改善或防止（作为预防）个体的对体内升高的旁分泌水平 有反应的疾病、感染或病况。在替代性实施方案中，本发明提供了用于体内或原位递送和/ 或体内表达以及受控表达任何旁分泌多肽或肽的组合物和方法，所述旁分泌多肽或肽例如 哺乳动物强心肤、重组人松弛素 _2、松弛素-2、尿皮质素-2、尿皮质素-1、尿皮质素-3、脑利 钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰岛素样生长因子-1或其任何组合；或者人强心肽、重组 人松弛素-2、松弛素_2、尿皮质素-2、尿皮质素-1、尿皮质素-3、脑利钠肽、前列环素合酶、 生长激素、胰岛素样生长因子-1或其任何组合。
[0086] 在替代性实施方案中，本发明提供了用于递送和受控表达编码旁分泌的核酸或基 因或者包含（其中已含有）编码旁分泌的核酸或基因的表达运载体（例如载体、重组病毒 等）以使得旁分泌蛋白被释放到血流或周身循环中的组合物和方法，在所述血流或周身循 环中所述旁分泌蛋白对身体（例如像在治疗心血管疾病的情况下的心脏，或者肺或肾脏， 或者其它靶标）可以具有有益的作用。
[0087] 在替代性实施方案中，本发明提供了用于体内表达编码旁分泌的核酸或基因以实 施本发明的方法的表达运载体、载体、重组病毒等。在替代性实施方案中，例如作为门诊病 人，例如在诊室看病期间，表达所述编码旁分泌的核酸或基因的所述表达运载体、载体、重 组病毒等可以通过肌内（頂）注射、静脉内（IV)注射、皮下注射、吸入、生物射弹式粒子递送 系统（例如所谓的"基因枪"）等来递送。
[0088] 在替代性实施方案中，这种"外周式"递送方式，例如肌内注射或静脉内注射的表 达运载体、载体、重组病毒等可以规避在使基因或核酸直接在器官（例如心脏、肺或肾脏） 本身当中表达时所遇到的问题。所需的一种或多种旁分泌蛋白在血流或周身循环中的持续 分泌也规避了通过输注施用蛋白质的困难和费用，所述通过输注施用蛋白质对于表现出非 常短的体内半衰期的许多蛋白质来说可能特别成问题，如下表1中所汇总：
[0089]
【权利要求】
1. 一种用于治疗、改善或防止（预防）个体或患者的对体内升高或持续的肽或旁分泌 多肽水平有反应的疾病、感染或病况的方法，所述方法包括： (a) (i)提供可操作地连接到转录调节序列的编码旁分泌多肽的核酸或基因；或其中 已含有编码旁分泌的核酸或基因或者表达旁分泌多肽的核酸、转录物或信使的表达运载 体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物能够在细胞中 或体内表达所述编码旁分泌的核酸、基因、转录物或信使；以及 (ii)向所述细胞或者有需要的个体或患者施用或递送所述可操作地连接到转录调节 序列的编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使、或者所述表达运载体、载体、重组病毒 或等同物， 从而治疗、改善或防止（预防）所述个体或患者的对升高或持续的旁分泌多肽水平有 反应的所述疾病、感染或病况； (b) (a)的所述方法，其中所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物是或包括： 腺相关病毒（AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体， AAV 血清型 AAV5、AAV6、AAV8 或 AAV9， 源自恒河猴的AAV，或源自恒河猴的AAV AAVrh. 10hCLN2， AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型， 嗜器官性AAV、或嗜心性AAV、或嗜心性AAVM41突变体， 其中任选地，将所述AAV工程化以提高靶向对野生型（wt)AAV不许可的特定细胞类型 的效率和/或提高仅感染所关注的细胞类型的功效， 并且任选地，所述杂合型AAV通过一种或多种修饰被重新定向或工程化为杂合体血清 型，所述一种或多种修饰包括：1)衣壳转移；2)使双特异性抗体吸附至衣壳表面；3)将镶 嵌型衣壳工程化；和/或4)将嵌合型衣壳工程化； (c) (a)的所述方法，其中所述编码旁分泌的核酸、基因、转录物或信使可操作地连接到 受调节的转录调节序列或可诱导的转录调节序列； (d) (c)的所述方法，其中所述受调节的或可诱导的转录调节序列是受调节的启动子或 可诱导的启动子， 其中任选地，转录和/或翻译的正调控因子（激活子）和/或负调控因子（阻遏子） 可操作地连接到所述编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使； (e) (a)至（d)中任一项的所述方法，其中向有需要的个体或患者施用所述可操作地连 接到转录调节序列的编码旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使、或所述表达运载体、载 体、重组病毒或等同物使得旁分泌蛋白被释放到血流或周身循环中，或使得所述旁分泌蛋 白在所述细胞中的表达增加或持续， 其中任选地，所述旁分泌蛋白的释放或者所述旁分泌蛋白的表达增加或持续是依赖于 可诱导的启动子的激活或阻遏子的去阻遏，所述启动子或阻遏子可操作地连接到所述编码 旁分泌多肽的核酸、基因、转录物或信使；或 (f) (a)至（e)中任一项的所述方法，其中对体内升高的旁分泌多肽水平有反应的所述 疾病、感染或病况是心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭（CHF);心脏纤维化；心肌细胞疾 病、功能障碍或细胞凋亡；肺动脉高压；心脏、皮肤、肝脏、肺、肌肉、神经、脑或肾脏的疾病； 癌症或功能障碍；癌症或瘤形成；或者血友病或血友病B。
2. 如权利要求1所述的方法，其中： (a) 通过口服、肌内（IM)注射、通过静脉内（IV)注射、通过皮下（SC)注射或真皮内注 射、通过鞘内注射、通过动脉内（IA)注射、通过冠状动脉内注射、通过吸入、通过气溶胶或 通过生物射弹粒子递送系统、或使用"基因枪"、气手枪或HELIOS?基因枪（加利福尼亚州赫 拉克勒斯的伯乐实验室公司（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA))向所述有需要的个体 或患者施用或递送所述可操作地连接到所述转录调节序列的编码旁分泌的核酸或基因；或 者所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物；或者 (b) 通过引入到体内靠近所述血流或由所述血流引流的任何组织或体液间隙中向所述 有需要的个体或患者施用或递送可操作地连接到所述转录调节序列的所述编码旁分泌的 核酸或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，从而使得该所编码的蛋白质可 以由所述组织中的细胞分泌并且被释放到所述血流中。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述旁分泌多肽或肽是或包括：哺乳动物强心 肽、生长因子、重组人松弛素-2、松弛素-2、尿皮质素-2 (UCn_2)、尿皮质素-1 (UCn-Ι)、尿皮 质素-3 (UCn-3)、脑利钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰岛素样生长因子-1或其任何组合； 或人强心肽、人生长因子、重组人松弛素-2、松弛素-2、尿皮质素-2、尿皮质素-1、尿皮质 素-3、脑利钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰岛素样生长因子-11或其任何组合。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述旁分泌多肽是尿皮质素、尿皮质素-2、尿皮质 素_1、尿皮质素_3、松弛素-2或脑利钠肽，并且所述疾病或病况是充血性心力哀竭（CHF); 或所述旁分泌多肽是前列环素合酶并且所述疾病或病况是肺动脉高压。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中： (a) 向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达旁分泌 的核酸或基因表达，或者诱导或激活诱导所述表达旁分泌的核酸或基因表达的（例如可操 作地连接到所述表达旁分泌的核酸或基因的）启动子； (b) 向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号诱导启动子的激活子 合成，任选地所述启动子为表达旁分泌的核酸或基因特异的（例如可操作地连接到所述表 达旁分泌的核酸或基因）的启动子； (c) 向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达旁分泌 的核酸或基因或者所述表达旁分泌的核酸或基因特异性启动子的天然激活子或合成激活 子的合成， 其中任选地，所述天然激活子是内源性转录因子； (d) (C)的所述方法，其中所述合成激活子是被设计成特异性并且选择性地启动内源性 或外源性靶标基因的锌指DNA结合蛋白，其中任选地，所述内源性靶标是表达基因旁分泌 的核酸或基因、或者表达旁分泌的核酸或基因的激活子、或者可操作地连接到表达旁分泌 的核酸或基因的启动子的激活子； (e) (a)至（c)中任一项的所述方法，其中所述刺激或信号包括生物刺激或信号、光刺 激或信号、化学品刺激或信号或药物刺激或信号； (f) 向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号刺激或诱导表达旁分 泌的核酸或基因的转录后激活子的表达或可操作地连接到表达旁分泌的核酸或基因的启 动子的激活子的表达，或 (g)向所述个体、患者或受试者施予刺激或信号，所述刺激或信号抑制表达旁分泌的核 酸或基因的转录阻遏子或转录后阻遏子或诱导对表达旁分泌的核酸或基因的转录阻遏子 或转录后阻遏子的抑制。
6. 如权利要求5所述的方法，其中诱导所述表达旁分泌的核酸或基因表达、或者诱 导可操作地连接到所述表达旁分泌的核酸或基因的所述受调节的启动子或可诱导的启动 子表达的所述化学品或药物是口服抗生素、多西环素或雷帕霉素；或使用利用多西环素的 tet调节系统来诱导所述表达旁分泌的核酸或基因或者其等同物的表达。
7. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述表达旁分泌的核酸或基因或者 所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物配制成液体、凝胶、水凝胶、粉剂或者水性或盐水 制剂。
8. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述表达旁分泌的核酸或基因或者 所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物配制于囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子 (NLP)中。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述表达旁分泌的核酸或基因或者 所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物配制于分离的或培养的细胞中，并且任选地，所 述细胞是哺乳动物细胞、心脏细胞、或人细胞、非人灵长类动物细胞、猴细胞、小鼠细胞、大 鼠细胞、豚鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞、山羊细胞、牛细胞、马细胞、绵羊细胞、犬科动物细胞 或猫科动物细胞。
10. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述表达旁分泌的核酸或基因或者 所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物配制成药物或配制成无 菌的。
11. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述表达旁分泌的核酸或基因或者 所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物与制品、人工器官或植入物一起来配制或递送、 在所述制品、人工器官或植入物上来配制或递送或者联同所述制品、人工器官或植入物来 配制或递送。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述表达旁分泌的核酸或基因或者 所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物在体外或离体表达旁分泌多肽。
13. -种用于治疗、改善或防止（预防）个体或患者的旁分泌反应性病变、感染、疾病、 病症或病况的方法，所述方法包括实施如权利要求1至12中任一项所述的方法。
14. 一种用于治疗、改善或防止（预防）以下疾病的方法：心脏收缩功能障碍；充血性 心力衰竭（CHF);心脏纤维化；心肌细胞疾病、功能障碍或细胞凋亡；肺动脉高压；心脏、皮 肤、肝脏、肺、肌肉、神经、脑或肾脏的疾病、癌症或功能障碍；癌症或瘤形成；或者血友病或 血友病B，所述方法包括实施如权利要求1至12中任一项所述的方法。
15. -种治疗、改善或防止（预防）患者或个体的糖尿病或糖尿病前期的方法，所述方 法包括： (a) 实施如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述旁分泌多肽或肽包含尿皮 质素-2(UCn_2)或由尿皮质素_2(UCn_2)组成；以及 (b) 向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽，或者编码尿皮质 素-2(UCn-2)的核酸、基因、信使或转录物， 其中任选地，所述尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或拟肽 的肽或多肽或者其变体， 从而治疗、改善或防止（预防）所述患者或个体的所述糖尿病或糖尿病前期。
16. -种治疗、改善或防止（预防）患者或个体的肥胖症的方法，所述方法包括： (a) 实施如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述旁分泌多肽或肽包含尿皮 质素-2(UCn_2)或由尿皮质素_2(UCn_2)组成；以及 (b) 向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽，或者编码尿皮质 素-2(UCn-2)的核酸、基因、信使或转录物， 其中任选地，所述尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或拟肽 的肽或多肽或者其变体， 从而治疗、改善或防止（预防）所述患者或个体的所述肥胖症。
17. -种在患者或个体中抑制体重增加、或抑制食欲、或者刺激或引发体重减轻的方 法，所述方法包括： (a) 实施如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述旁分泌多肽或肽包含尿皮 质素-2(UCn_2)或由尿皮质素_2(UCn_2)组成；以及 (b) 向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽，或者编码尿皮质 素-2(UCn-2)的核酸、基因、信使或转录物， 其中任选地，所述尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或拟肽 的肽或多肽或者其变体， 从而在所述患者或个体中抑制体重增加、或抑制所述食欲、或刺激或引发体重减轻。
18. 如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中将所述尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多 肽配制于囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子（NLP)中或配制成囊泡、脂质体、纳米粒 子或纳米脂质粒子（NLP)，或者将所述尿皮质素-2 (UCn-2)肽或多肽配制用于：口服施用、 肌内（IM)注射、静脉内（IV)注射、皮下注射（SC)或真皮内注射、鞘内注射、动脉内（IA)注 射、冠状动脉内注射、吸入或通过气溶胶施用。
【文档编号】A61K48/00GK104220098SQ201380019909
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年2月13日 优先权日:2012年2月14日
【发明者】H·K·哈蒙德, 高美华 申请人:加利福尼亚大学董事会