使用环糊精的方法

使用环糊精的方法
【专利摘要】描述了使用环糊精来治疗、抑制、预防、改善或治愈糖尿病或与糖尿病有关的病况的方法。更具体而言，本发明的方法包括抑制一种与胆固醇积聚有关的细胞内流机制或增强一种与胆固醇积聚有关的细胞外流机制，包括调节一种鞘脂酶以减少细胞胆固醇积聚。该方法还可以包括干扰一种细胞胆固醇合成路径。
【专利说明】使用环糊精的方法

【背景技术】
[0001 ]本发明总体上涉及一种用于降低质膜和细胞胆固醇以便预防、治疗、治愈或逆转 肥胖、代谢综合征、糖尿病或与其相关的一种并发症的方法，该方法通过向对其有需要的患 者给予一种化合物（如一种环糊精或其衍生物）以降低质膜和细胞胆固醇和/或脂质来进 行。
[0002]肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病以及糖尿病代表了伴以主要医疗保健成本的世界 性流行病，因为所有这些流行的医学病况是心血管发病和死亡的主要风险因素。
[0003]已充分确定了，血浆胆固醇水平并且具体来说低密度脂蛋白（LDL)胆固醇水平升 高在冠心病、中风、外周血管疾病、肾病、动脉粥样硬化以及髙血压的发展中起到重要作用。 临床试验已证实，降低血浆中的胆固醇浓度对心血管发病和死亡具有重大影响。因此，全身 性高胆固醇血症的治疗控制在肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病以及糖尿病的临床管理和治 疗中是极其重要的。
[0004]虽然已深入研究了血管相关病症中对全身性高胆固醇血症的矫正，但尚未研究在 肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病以及糖尿病的目标器官中在质膜和细胞层面减少局部胆固 醇积聚的策略。
[0005] 胆固醇在患有肥胖、代谢综合征或糖尿病的患者中的积聚已在数种器官（如胰 脏、肌肉、肝脏、血管、肾脏）中得以描述，不过局部胆固醇在这些器官中积聚的功能性结果 仍然有待确定。
[0006] 举例来说，在临床和实验肾病两者中，胆固醇的肾积聚与肾小球硬化的发展相关， 并且来自糖尿病大鼠的肾脏的特征在于胆固醇积聚。胆固醇过度积聚可能通过数种机制 对细胞功能有害，包括调节细胞肌动蛋白细胞骨架，调节足细胞对数种循环因子（胰岛素、 IGF、VEGF、任何生长因子、载脂蛋白、脂肪因子、内分泌激素）的反应，调节局部产生的炎 性细胞因子、趋化因子以及其受体、整合素，调节免疫反应（如通过TLR和共刺激分子如 B7-1-CD80介导的免疫反应），或调节促和抗凋亡细胞死亡路径。
[0007] 此外，我们近来已证实了鞘脂相关酶（酸性神经磷脂酶样磷酸二酯酶3b， SMPDL3b)作为足细胞功能调节剂的重要作用，足细胞是糖尿病中严重受影响的肾脏细胞。 类似地，鞘糖脂积聚在糖尿病大鼠的肾脏中。然而，尚无展示在蛋白尿或其他肾相关疾病 (如糖尿病性肾病）中质膜或细胞胆固醇移除的有利作用的数据可供使用。
[0008] 因此，所需要的是一种可以调节在疾病中观察到的质膜和细胞胆固醇积聚的干预 方法。这类方法可能接着在用于治疗、抑制或改善如糖尿病、前驱糖尿病、代谢综合征、肥胖 或其症状的病况的预防性和治疗性策略中是有用的。
[0009] 环糊精（CD)是含有由a、e或Y-(l，4)糖苷键连接的6个或更多个D-(+)吡喃 型葡萄糖单元的环状寡糖。已展示环糊精由于其独特的结构而能够与多种疏水性分子形成 复合物。环糊精衍生物在研究实验室中广泛用于例如从培养的细胞中去除胆固醇，并且这 些环糊精衍生物因它们溶解药物的能力而在医药工业中是众所周知的。
[0010] 未衍生化的环糊精在整个食品工业中用于制造无胆固醇产品，如无脂肪黄油、鸡 蛋以及乳制品。羟丙基-P -环糊精（HPfiCD)在亚洲和欧洲国家中被公认为用于食物产 品的GRAS(普遍认为安全）材料，并且在美国正考虑类似的认证。全世界数百万人每天在 食品、化妆品以及家用产品中暴露于少量环糊精化合物。CD衍生物从（CTD控股公司（CTD Holdings Inc.) ; http://cyclodex.com/)可商购。药理学研究已表明，CD衍生物的胆固醇 耗乏能力比他汀类药的胆固醇耗乏能力优越约20倍。
[0011]除了这种对环糊精的常见暴露之外，疗法中CD使用的潜在安全性和功效也已得 到认可。举例来说，在2〇〇9年4月中，美国食品和药物管理局（FDA)批准了一项研究性新 药（IND)方案，该方案允许患有一种称为尼曼匹克病（Niemann Pick disorder)的罕见脑 破坏性胆固醇疾病的双胞胎经历每周HP P CD静脉内输注到他们的血流中。然而，后续研究 发现羟丙基-￠-环糊精并未从血流跨越到脑中。而在2〇10年9月23日，FDA授予一项将 TrappS〇l?Cyclo?(HPPCD)弓丨入到因尼曼匹克C型（NPC)而濒死的六岁同卵双生女孩的 大脑中的IND申请以许可。
[0012]对于这种适应症和给予途径的IND提交的概述在地址（http://addiandcassi. com/wordpress/wp-content/uploads/2009/09/Hydroxy-Propyl-Beta-Cyclodextrin-HPB CD-Summary, pdf)处是公开可获得的。
[0013]先前尚未有描述的是CD和CD衍生物用于减少肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病以及 糖尿病或任何相关并发症的细胞胆固醇或脂质的用途。
[0014] 有利的是，现已发现环糊精化合物并不通过影响胆固醇合成路径（如他汀类药所 为）来起作用，而是主要通过增强引起胆固醇积聚的外流机制来起作用。
[0015] 这一发现允许环糊精化合物更广泛地用于预防和治愈肥胖、代谢综合征、前驱糖 尿病以及糖尿病或任何相关并发症。此外，属于不为他汀类药的化合物类别的环糊精衍生 物或任何细胞胆固醇降低剂（如吡啶甲酸铬、肝X受体激动剂）也可以用于如在此所述的 方法。
[0016] 一种调节细胞胆固醇的新颖策略包括调节鞘脂相关酶如SMPDL3B(鞘磷脂磷酸二 酯酶，酸样 3B)，我们已证实了这些鞘脂相关酶会调节细胞胆固醇含量和细胞功能。


【发明内容】

[0017] 本发明涉及向对其有需要的患者持续一段时间并以一定剂量给予一种化合物如 一种环糊精或一种环糊精衍生物以降低质膜或细胞胆固醇/脂质，该时间和该剂量足以预 防、治疗、治愈或逆转肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病、糖尿病、糖尿病性肾病或与其相关的 病况或症状。
[0018] 总体而言，本发明关于一种用于减少患者的细胞或细胞质膜中的脂质含量的方 法，该患者罹患一种选自以下各项的病况：糖尿病（1型）、糖尿病（2型）、前驱糖尿病、月巴 胖、代谢综合征、糖尿病性肾病变、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病 变、糖尿病相关的微血管并发症、糖尿病相关的大血管并发症、动脉粥样硬化、外周血管疾 病、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、心脏肥大、心肌梗塞、内皮功能障碍以及高血压、中风、 脑血管意外、心肌梗塞、心脏病发作、心血管意外、脂肪肝、脂肪性肝炎、NASH以及胰岛素抵 抗、糖尿病性肾病、肥胖以及代谢综合征，所述方法包括向该患者给予有效量的减少细胞脂 质含量的化合物。
[0019]更确切地说，本发明的方法包括抑制与胆固醇积聚有关的细胞内流机制或增强与 胆固醇积聚有关的细胞外流机制，包括调节鞘脂酶以减少细胞胆固醇积聚。该方法还可以 包括干扰细胞胆固醇合成路径。
[0020] 优选地，主题方法的适用化合物是一种环糊精或一种环糊精的一种衍生物。更优 选地，该环糊精或其衍生物是羟丙基0环糊精（HPPCD)。
[0021] 本发明进一步涵盖适用于治疗、预防或改善如所描述的病况或症状的医药组合 物。根据本发明的组合物包括至少一种如在此所述的环糊精作为活性医药成分（API)和一 种医药学上可接受用于可注射给予的媒介物。优选地，本发明的组合物包括羟丙基0环糊 精（HPPCD)或其类似物、衍生物、异构体或盐。
[0022] 本发明的组合物可以包括两种或更多种活性成分，其中这些活性成分可以是两种 或更多种类视黄醇化合物,或者可以包括一种或多种类视黄醇化合物与一种非类视黄醇化 合物的组合。这些活性成分可以依序或同时给予。
[0023] 主题方法的优选应用包括治疗、抑制或预防一名罹患或易患如肥胖、代谢综合征、 前驱糖尿病、糖尿病、糖尿病性肾病或与其相关的病况或症状的病况的患者的该病况。
[0024] 该方法包括通过常见投药途径（如肌内、腹膜内、静脉内（全身）、皮下、经皮、经 口、经直肠、吸入、局部以及鼻内）给予有效量的化合物（如环糊精或环糊精的衍生物）。优 选投药途径是皮下。
[0025] 用于根据本发明方法给予化合物的剂量范围包括从约2-20mg/kg/天到每周约 4000mg/kg三到五次（总计高达约20, OOOmg. kg/周），并且可以给予每周至少两次到每天 约三次。
[0026] 优选地，该方法采用给予该化合物作为单一活性成分，其中同一类化合物中的一 种以上化合物被视为单一成分。举例来说，给予HP P CD加HP P CD衍生物（两者都属于环 糊精类）为了本发明目的被视为单一活性成分或单一环糊精。典型地，化合物以包括活性 成分和至少一种医药学上可接受的赋形剂或媒介物的组合物形式给予。
[0027]可替代地，该方法可以采用一种以上活性医药成分，其中该组合物包括两种活性 成分，各自来自不同类别的化合物，其中这些化合物中的至少一者是环糊精。举例来说，该 方法可以包括给予一种包括一种或多种环糊精或其衍生物的第一活性成分和一种并非环 糊精或其衍生物的第二活性成分以及优选地一种医药学上可接受的赋形剂或媒介物。为了 本发明的目的，医药学上可接受的赋形剂可以包括防腐剂。
[0028] 该第二活性成分可以选自一种抗糖尿病剂、一种胆固醇生物合成抑制剂、一种胆 固醇吸收抑制剂、一种胆酸螯合剂、烟酸或烟酸衍生物、一种贝特类药、一种胆固醇酯转移 酶蛋白以及一种乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶抑制剂或一种生物制剂。可替代地，该第二 活性成分可以选自一种免疫抑制剂、胰岛素、磺脲、列汀类药、二甲双胍、噻唑烷二酮、胰岛 素敏化剂、肠促胰岛素类似物、DPP4抑制剂、VEG干扰剂、生长因子、消炎药、维生素D衍生 物、RAS系统阻断剂以及醛固酮阻断剂。
[0029] 本发明的方法进一步包括治疗、抑制、预防或改善由细胞或细胞质膜中胆固醇积 聚引起的病况、或症状或继发性病况。这些病况是上文所列的并且通过引用结合在此。本 发明的这一实施例可以包括向罹患该病况、或症状或继发性病况的患者给予有效量的一种 化合物，该化合物通过影响与胆固醇积聚有关的细胞内流机制或与胆固醇积聚有关的细胞 外流机制来减少细胞胆固醇积聚。该方法可以包括调节鞘脂酶以减少细胞胆固醇积聚，并 且可以进一步包括实现对细胞胆固醇合成路径的干扰。
[0030]另外，本发明包括一种用于治疗、抑制、预防或改善由细胞胆固醇积聚引起的症状 或相关病况的组合物，其中该组合物包括有效量的至少一种环糊精或环糊精衍生物和医药 学上可接受的赋形剂或媒介物。
[0031]该组合物可以进一步包括并非环糊精或环糊精的衍生物的第二活性医药成分。该 第二活性成分可以是一种抗糖尿病剂、一种胆固醇生物合成抑制剂、一种胆固醇吸收抑制 剂、一种胆酸螯合剂、烟酸或烟酸衍生物、一种贝特类药、一种胆固醇酯转移酶蛋白以及一 种乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶抑制剂或一种生物制剂。
[0032]可替代地，该第二活性成分可以是一种免疫抑制剂、胰岛素、磺脲、列汀类药、二甲 双胍、噻唑烷二酮、胰岛素敏化剂、肠促胰岛素类似物、DPP4抑制剂、VEG干扰剂、生长因子、 消炎药、维生素D衍生物、RAS系统阻断剂以及醛固酮阻断剂。
[0033]在商业使用中，该化合物、组合物以及使用该组合物的方法结合一种产品或制品 适用，该产品或制品包括该组合物，如包含在容器中，其中该容器与书面指示一起包装，该 书面指示关于根据如在此所述的一种用于治疗由细胞脂质积聚引起的病况或由细胞脂质 积聚引起的症状的方法使用该化合物或组合物。
[0034] 一种优选的制品包括本发明的化合物或组合物和指示其在治疗细胞胆固醇积聚 或与细胞胆固醇积聚有关的病况或症状中的用法的书面指示。

【专利附图】

【附图说明】
[0035]图1示出了实验结果，这些实验结果示出了 CD在体内改善糖尿病，确切地说，1-胆 固醇通过皮下注射羟丙基-P-环糊精（CD)而耗乏，逆转实验动物的糖尿病和肥胖并且离 体改善人类胰岛细胞功能。
[0036] 图2示出了实验结果，这些实验结果示出了 CD在体内保护免患糖尿病性肾病，确 切地说，2-胆固醇通过皮下注射羟丙基环糊精（CD)而耗乏，并且改善白蛋白尿、肾脏 重量以及糖尿病性肾病的组织学特征。
[0037] 图3是概述CD在用皮下给予每周三次注射的羟丙基-0 -环糊精持续五个月（从 4周龄到24周龄）治疗的BTBR小鼠中的安全性的表，确切地说示出了 3-胆固醇通过皮下 注射羟丙基-0 _环糊精（⑶）而耗乏，并且CD甚至在以每千克体重4, OOOmg的极高剂量给 予时也是安全的。
[0038] 图4示出了在与正常健康对照和患有糖尿病而无肾病的患者（DKD-)相比时，暴露 于患有糖尿病和糖尿病性肾病的患者（DKD+)的血清的足细胞中发生4-胆固醇积聚。
[0039] 图5示出了在暴露于DKD+血清之后观察到的CD保护足细胞免于改变，确切地说 示出了胆固醇耗乏且CD防止在暴露于患有糖尿病性肾病的患者血清的正常肾脏细胞（人 类足细胞）中观察到的数种表型变化，如细胞空泡化、胆固醇积聚以及细胞凋亡。
[0040] 图6示出了鞘脂相关酶（例如SMPDL3b)的表达在目标器官（如肾脏）的糖尿病 中增加并且引起脂质依赖性损伤。

【具体实施方式】
[0041] 已知血浆中胆固醇水平升高（并且具体地说低密度脂蛋白（LDL)胆固醇）在糖 尿病的微血管和大血管并发症的发展中起到重要作用。然而，目前可供使用的降低患者胆 固醇水平的疗法旨在通过阻断肝中胆固醇合成（他汀类药）、通过预防胆固醇再吸收到循 环系统中（胆酸树脂、胆固醇吸收抑制剂）或者通过增加HDL胆固醇（贝特类药、烟酸衍生 物、胆固醇酯转移蛋白[CETP]抑制剂）来降低血浆LDL。目前使用药品中没有一者旨在降 低质膜或细胞胆固醇，除了肝X受体激动剂（LXR)，尚未发现它在人类中安全。
[0042] 本发明的一个实施例涉及代谢障碍，这些代谢障碍可以选自包括以下各项的清 单：糖尿病（1型或2型）、前驱糖尿病、肥胖、代谢综合征、糖尿病性肾病变、糖尿病性肾病、 糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病相关的微血管并发症、糖尿病相关的大血 管并发症、动脉粥样硬化、外周血管疾病、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、心脏肥大、心肌 梗塞、内皮功能障碍以及高血压、中风、脑血管意外、心肌梗塞、心脏病发作、心血管意外、月旨 肪肝、脂肪性肝炎、NASH、胰岛素抵抗。
[0043] 在本发明的另一个实施例中，用于预防、治疗、治愈或逆转肾相关病症的药物是会 降低细胞的质膜和细胞胆固醇含量的任何药物。
[0044] 该药物可以特此以多种方式给予个体。给予途径包括肌内、腹膜内、静脉内（全 身）、皮下（单独或与有助于相对较大体积的皮下药物给予的药物组合）、经皮、经口、经直 肠、吸入、局部以及鼻内途径。该药物可以连同其他生物活性剂或作为医药学上可接受的载 齐U、稀释剂、赋形剂以及媒介物的组分一起给予。
[0045] 在此所述的环糊精可以被配制到医药组合物中。在一个方面中，化合物可以与至 少一种医药学上可接受的载剂组合以制造使用本领域中已知的技术制备的医药组合物。在 一个方面中，组合物通过将化合物与医药学上可接受的载剂混合来制备。取决于待混合的 组分，这些组分可能会或可能不化学地或物理地彼此相互作用。
[0046] 在此提供的组合物可被配制成包括至少一种环糊精以及一种或多种医药学上可 接受的载剂（包括赋形剂，如稀释剂、粘合剂等），并且可以按需要进一步包括添加剂（如稳 定剂、防腐剂、增溶剂以及缓冲剂）。
[0047]医药组合物除了包括活性成分之外还可以包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防 腐剂、表面活性剂等。医药组合物还可以包括一种以上活性成分，如根据本发明的类视黄醇 化合物、和一种或多种抗微生物剂、消炎剂、麻醉剂等。医药学上可接受的载剂是本领域的 普通技术人员已知的。这些载剂最典型地将是用于给予人类的标准载剂，包括溶液，如无菌 水、盐水以及在生理pH下的缓冲溶液。
[0048]医药组合物可以被配制成取决于是否需要局部或全身性治疗或取决于待治疗的 区域而以多种方式给予。给予可以是局部的，包括经眼、经阴道、经直肠、经鼻内施用于皮肤 表面等，如本领域的普通技术人员将易于了解般。
[0049]在实际使用中，所提供的本发明化合物可以作为活性成分与医药载剂或媒介物根 据常规医药混配技术组合于混合物中。所用载剂可以形成，取决于针对给予（例如经口、肠 胃外（包括静脉内）、尿道、阴道、鼻、真皮、局部、经皮、肺、深肺、吸入、颊内、舌下给予等）所 希望的剂型。
[0050]如果在水溶液中，那么作为优选的，所提供的环糊精组合物可以借助于盐水、乙酸 盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或其他缓冲剂恰当缓冲，该组合物可以处于任何生理上可接 受的pH下，总体上从约pH4到约pH7。还可以使用缓冲剂组合，如磷酸盐缓冲盐水、盐水和 乙酸盐缓冲液等。在盐水的情况下，可以使用0.9%盐水溶液。在乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸 盐、乙酸盐等的情况下，可以使用50福溶液。除了缓冲剂之外，还可以使用适合的防腐剂以 防止或限制细菌和其他微生物生长。一种可以使用的这类防腐剂是〇? 05°乂苯扎氯铵。
[0051] 用于给予的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液以及乳液。水性或非水性 载剂的实例包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物 包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖（Ringer's dextrose)、右旋糖以及氯化钠、乳酸林格氏液 或不挥发性油。
[0052] 静脉内媒介物可以是流体和营养补充剂、电解质补充剂（如基于林格氏右旋糖的 那些）等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气 体等。
[0053] 用于局部给予的配制品可以包括软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体 以及散剂。常规的医药载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或所希望的。应 了解，在指定情况下活性化合物的实际优选量将根据所使用的具体化合物、所配制的特定 组合物、施用模式以及所治疗的特定位置和哺乳动物而改变。
[0054] 在制备用于口服剂型的组合物中，可以使用典型医药介质，在口服液体制剂（如 悬浮液、酏剂以及溶液）的情况下，如水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或在口服 固体制剂（如散剂、硬和软胶囊以及片剂）的情况下，如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化 齐!J、润滑剂、粘合剂、崩解剂等的载剂。
[0055] 对于固体给予配制品，可以使用多种增稠剂、填充剂、增积剂以及载剂添加剂中的 任一者，如淀粉、糖、脂肪酸等。配制品赋形剂可以包括聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、 阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠以及柠檬酸钠。对于注射或其他液体给予配制品，包 含至少一种或更多种缓冲组分的水是优选的，并且还可以使用稳定剂、防腐剂以及增溶剂。
[0056] 还预期所提供的本发明化合物可以呈干燥和微粒形式。在某些实施例中，粒子是 在约0. 5与6. Oym之间，从而这些粒子具有足以下沉在肺表面上的质量并且不被呼出，但 是小到足以使它们不会在到达肺之前沉积在气道表面上。多种不同技术中的任一者都可以 被用于制造干粉微米粒子，包括（但不限于）微研磨、喷雾干燥以及快速冻结的气溶胶之后 加冻干。
[0057] 对于医药调配物，还预期可以使用多种测量释放、缓慢释放或时间释放配制品和 添加剂中的任一者，使得剂量可以配制成以便实现所提供的化合物在一段时间内的递送， 通常被称为控制、延迟、延长、缓慢、或持续释放配制品。举例来说，明胶、羧甲基纤维素钠和 /或其他纤维素赋形剂可以被包括在内以提供时间释放或较慢释放配制品，尤其用于通过 皮下和肌内注射进行的给予。
[0058] 所提供的本发明环糊精可以借助于注射（典型地皮下或肌内注射，如在臀肌或三 角肌中）时间释放可注射配制品来治疗地给予。在一个实施例中，所提供的本发明化合物 与PEG (如聚（乙二醇）3350)和任选地一种或多种额外的赋形剂和防腐剂（包括（但不限 于）赋形剂如盐、聚山梨醇酯80、调节pH的氢氧化钠或盐酸等）一起配制。
[0059] 配制品可以使得每天、每周、每月或其他定期需要施用、给予或注射，取决于所提 供的化合物的浓度和量、用于配制品的聚合物的生物降解速率以及本领域的普通技术人员 已知的其他因素。
[0060] 在另一个实施例中，用于预防、治疗、治愈或逆转肾相关病症的药物是环糊精或其 衍生物或类似物中的任一者。
[0061] 在另一个实施例中，环糊精用于预防、治疗或减轻患者的高血糖症（空腹或餐 后）。
[0062] 本发明还涉及减少任何器官的任何细胞中的质膜或细胞胆固醇含量的方法作为 预防、治疗、治愈或逆转肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病以及糖尿病相关病症的手段。
[0063] 在一个实施例中，质膜或细胞胆固醇含量在体内任何细胞中被减少作为预防、治 疗、治愈或逆转肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病以及糖尿病相关肾脏病症的手段。本发明的 化合物或组合物可以采用环糊精来治疗、抑制、预防、减少或逆转受糖尿病影响或造成糖尿 病发展的中心或外周器官的细胞或细胞质膜中的胆固醇积聚。
[0064] 在另一个实施例中，质膜或细胞胆固醇含量在胰脏P细胞中被减少，从而预防、 治疗、治愈或逆转受损的葡萄糖刺激的胰岛素释放、局部或全身性炎症和或对胰岛的自身 免疫攻击。
[0065] 在另一个实施例中，环糊精或其衍生物单独或与目前使用或正被研究用于预防和 治疗糖尿病的其他药物组合用于使细胞至少部分地耗乏质膜胆固醇，这些其他药物如免疫 抑制剂、胰岛素、磺脲、列汀类药、二甲双胍、TZD或任何胰岛素敏化剂、肠促胰岛素类似物以 及DPP4抑制剂、干扰VEGF的药剂以及其他生长因子、消炎药、维生素D衍生物、RAS系统阻 断剂以及醛固酮阻断剂。
[0066] 在另一个实施例中，羟丙基P环糊精（HP P CD)在以在从约2到约20mg/kg/天范 围内的剂量给予小鼠时是安全的，并且可以按最多约4, 000mg/kg每周从三次到五次（总计 约20, 000mg/kg/周）的量给予。
[0067] 在另一个实施例中，羟丙基P环糊精（HPP CD)在以高达4000mg/kg -周三次的 剂量皮下给予时是安全的。
[0068] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 胆固醇生物合成抑制剂（如HMG-CoA还原酶抑制剂）组合使用。HMG-CoA还原酶抑制剂药 物包括如辛伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、罗素他汀、美伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、匹伐 他汀、罗素他汀、西立伐他汀、利伐他汀、伊伐他汀或ZD-4522的药物。
[0069] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 胆固醇吸收抑制剂（如依泽替米贝、SCH-48461)组合使用。
[0070] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 胆酸螯合剂和树脂（考来替泊、考来替兰、考来糖酐、消胆胺、考来维仑）组合使用。
[0071] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 烟酸和烟酸衍生物（如烟酸戊四醇酯、烟呋糖酯、烟酸、烟基醇、阿昔莫司）组合使用。
[0072] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 贝特类药（如非诺贝特、双贝特、氯烟贝特、环丙贝特、克利贝特、氯贝胺、依托贝特、氯贝 特、苯扎贝特、氯贝酸错、吉非罗齐）组合使用。
[0073] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 胆固醇酯转移蛋白（CETP)抑制剂（如达塞曲匹、托塞曲匹、安塞曲匹）组合使用。
[0074] 在另一个实施例中，环糊精、其衍生物或任何其他质膜或细胞胆固醇降低药物与 乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶（ACAT)抑制剂（如阿伐麦布）或微粒体甘油三酯转运抑制 剂组合使用。
[0075] 这些组合疗法还可以有效用于治疗或控制一种或多种选自下组的肥胖、代谢综合 征、前驱糖尿病以及糖尿病相关病症，该组由以下各项组成：动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、高 脂质血症、高甘油三酯血症、血脂异常、高LDL以及低HDL。
[0076] 实例
[0077]实验结果展示了，在与具有正常白蛋白尿和类似糖尿病持续时间和脂质特征曲线 的糖尿病患者（DKD-)相比时，与ATP结合盒转运蛋白ABCAl下调相关联的胆固醇增加发生 在暴露于患有1型糖尿病和白蛋白尿的患者（DKD+)的血清的正常人类足细胞中。在与正 常活供体（n = 32)相比时，ABCAl的肾小球下调在来自患有早期DKD的患者的活检（n = 70)中得到证实。
[0078]用环糊精（CD)诱导胆固醇外流但不用辛伐他汀抑制胆固醇合成会预防在暴露于 患者血清之后在体外观察到的足细胞损伤。CD皮下给予糖尿病BTBR-ob/ob小鼠是安全的 并且减少白蛋白尿、肾小球膜扩张、肾脏重量以及皮质胆固醇含量。这之后是体内空腹胰岛 素、血糖、体重、葡萄糖耐量改善以及体外人类胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素释放改善。
[0079] 我们的数据表明受损的逆向胆固醇转运表征临床和实验DKD并且不利地影响足 细胞功能。用CD治疗在体外和体内保留足细胞功能方面、在离体改善人类胰脏p细胞方 面以及在体内改进糖尿病的代谢控制方面是安全并有效的
[0080]我们使用了一种先前建立的基于细胞的分析，在该分析中，将分化的人类足细胞 暴露于4%患者血清持续24小时以鉴别DKD中的新路径和目标。暴露于患有DKD的患者血 清的足细胞展示出与循环胆固醇无关的与ABCAl表达下调相关联的胆固醇积聚增加。过度 胆固醇沉积实际上已在TlD和T2D啮齿动物模型的肾小球中得到描述并且可能促进DKD发 展和进展。
[0081] 研究设计和方法
[0082] 患者血清和肾脏活检。从来自芬兰糖尿病性肾病变研究（FinnDiane)的十名健 康对照和二十名患有TlD的患者获得血清样品。TlD被定义为在40岁年龄之前糖尿病 发作并且在诊断1年内开始永久性胰岛素治疗。泌尿白蛋白排泄率（AER)被界定为正常 AER(<30mg/24h)、微量白蛋白尿（彡30<300mg/24h)以及大量白蛋白尿（彡300mg/24h)。空 腹葡萄糖值使用Hemocue装置（海默秋公司（Hemocue)，芬兰）测量。血清脂质用Konelab 分析仪（赛默科技公司（Thermo Scientific)，芬兰）测定。其他生物化学分析在认可的医 院实验室（HUSLAB，赫尔辛基）中执行。对于肾小球 mRNA表达特征曲线，在获得知情同意书 之后从70名美国西南部印第安人取得肾脏活检样本。来自移植前健康活供体（ n = 32)、 膜性肾病变（n = 21)以及局灶节段性肾小球硬化（n二18)患者的人类肾活检是从欧洲肾 cDNA库获得的。
[0083] 微阵列分析和PCR。对于体外实验，将亿明达（Illumina)技术用于研究暴露于四 个独立的各来自2-3名患者（对照、DKD-以及DKD+)的血清的池的人类足细胞中的mRNA 表达。肾小球mRNA表达特征曲线如所描述用昂飞基因芯片阵列（Affymetrix GeneChip array)执行。
[0084] 人类足细胞培养。人类足细胞如先前描述经培养并分化并且在实验之前在0.2% FBS中进行血清饥饿。当使用患者血清时，将饥饿的细胞暴露于4%患者血清持续24小时。 对于胰岛素治疗实验，在暴露于患者血清之后将IOOnmol胰岛素加入培养基中持续15分 钟。对于环糊精或他汀治疗实验，血清饥饿的人类足细胞用5mM甲基-P -环糊精（CD，西格 玛公司（Sigma))或辛伐他汀（lu m，西格玛公司）预处理1小时。
[0085] 免疫荧光染色。将在腔式载玻片中培养的细胞在37°C下用4% PFA固定30分钟 并且用〇? l%Triton X-100透性化，之后暴露于小鼠抗磷酸化小窝蛋白（PY14,碧迪生物科 学公司（BD Biosciences))、抗活性 RhoA(新东生物科学公司（New East Biosciences)) 或抗波形蛋白（西格玛公司）抗体。荧光检测使用Alexa Fluor二级抗体（英杰公司 (Invitrogen))执行。对于胆固醇测定，如所描述执行菲律宾菌素（西格玛公司）染色。 F-肌动蛋白通过罗丹明鬼笔环肽（英杰公司）观测。每病况研究两百个连续细胞。载玻片 用DAPI富集的安装介质（Vectashield)制备并且通过共聚焦显微术分析。
[0086] 细胞凋亡分析。细胞凋亡是使用半胱天冬酶-3/CPP32比色分析试剂盒（生物视 野公司（Biovision))根据制造商的说明书评估的。半胱天冬酶 3活性被归一化成细胞数 目并且表示为与对照的倍数变化。
[0087] 胆固醇含量的测定。酯化胆固醇使用酶促分析测定为总胆固醇与游离胆固醇之间 的差异并且被归一化成细胞蛋白含量。脂滴的细胞含量使用油红O(ORO)测定。如上文所 述将细胞固定并透性化，在PBS中和在60%异丙醇中洗涤，之后在0R0(0. 5% ORO于异丙醇 中，1:3稀释）中在室温下孵育15分钟并且用苏木精复染1分钟。ORO阳性细胞相较于两 百个连续细胞的分率通过亮场显微术计算。
[0088] 蛋白质印迹法和流式荧光检测术。如先前所述执行细胞溶解物收集和蛋白质印 迹法。使用以下初级抗体：兔多克隆抗MyD88(细胞信号传导公司（Cell Signaling))、兔 多克隆抗磷酸化（Y473)或抗总AKT(细胞信号传导公司）、小鼠单克隆抗rhoA(圣克鲁兹 公司（Santa Cruz))或小鼠单克隆抗Gapdh (6C5,卡尔生物化学公司（Calbiochem))抗体。 使用二级抗小鼠IgG-HRP或和抗兔IgG-HRP结合物（普洛麦格公司（Promega))。图像获 取使用化学发光成像器SRX_101A(柯尼卡美能达医学成像公司（Konica Minolta medical imaging)，美国）执行并且条带光密度测定使用ImageJ软件（NIH)分析。可替代地，如先 前所报导使用流式突光检测技术定量磷酸化/总AKT。
[0089] 定量实时PCR (QRT-PCR)。足细胞RNA使用RNAeasy微型试剂盒（凯杰公司 (Qiagen))提取。逆转录使用大容量cDNA逆转录酶试剂盒（应用生物系统公司（Applied Biosystems))根据制造商的方案执行。QRT-PCR 使用 PerfeCT^l? SYMA Green FastMix (量子生物科学公司（Quanta Biosciences))在StepOnePlus实时PCR系统（应用 生物系统公司）中执行。相对基因表达被测定为2~_ A Ct，其中A Ct为目标基因和Gapdh的 循环阈限（Ct)值之间的差异。对于半定量表达分析，PCR通过凝胶电泳执行并分析。扩增产 物强度使用ImageJ软件（NIH)测定，值被归一化并表示为相较于GAPDH的基因表达倍数变 化。使用以下引物：hABCAl-F,AACAGTTTGTGGCCCTTTTG ;hABCAI-R，AGTTCCAGGCTGGGGTACTT ; hLDL-R-F，TCACTCCATCTCAAGCATCG ;hLDL-R-R，GGTGGTCCTCTCACACCAGT ;hHMG-CoA-R-F， GGCATTTGACAGCACTAGCA；hHMG-CoA-R-R, GCTGGAATGACAGCTTCACA ；hGAPDH-F, GTCAGTGGTGGACCTGACCT ;hGAPDH-R，Hs-ABCA1-SG QuantiTect 引物分析（凯杰公司）； mAbcal-F, GGACATGCACAAGGTCCTGA ;mAbcal-R，CAGAAAATCCTGGAGCTTCAAA。
[0090] BTBR ob/ob小鼠处理和分析。BTBR ob/ob小鼠购自杰克逊实验室（Jackson Laboratories)。小鼠如先前所报导用4, 000mg/kg CD或盐水皮下注射，每周三次持续5 个月。收集尿液，并且每周测定体重和血糖（OneTouch)。分析每组六只小鼠。所有动物程 序均由机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee， IA⑶C)批准。在等渗盐水灌注之后，移出右肾以便进行胆固醇含量测定和mRNA提取。将一 个左肾极包埋在OCT中，将一个第二极固定在4% PFA中并进行石蜡包埋以用于组织学分 析。在迈阿密大学的比较实验室核心设施（Comparative Laboratory Core Facility)中 针对CBC、脂质组、AST、ALT、碱性磷酸酶、GGT以及BUN分析血液样品。血清肌酐使用先前 所述的方法在伯明翰的阿拉巴马大学的UAB-UCSD奥布赖恩核心中心（UAB-UCSD 0' Brien Core Center)通过串联质谱测定。尿液白蛋白含量通过ELISA(拜西尔实验室（Bethyl Laboratories))测量。尿肌酐通过基于贾菲法（Jaffe method)的分析（斯坦柏尔公司 (Stanbio))进行评估。值表示为yg白蛋白/mg肌酐。空腹血浆胰岛素通过ELISA(默克 迪亚公司（Mercodia)，瑞典）测定。腹膜内葡萄糖耐量测试（IPGTT)在处理后4个月执行； 在5小时空腹之后，在基线和直到葡萄糖团注（I. 5g/kg)后180分钟记录血糖。对于胰岛 素敏感性，在基线和直到腹膜内注射4mU/g短效胰岛素后150分钟监测血糖。来自四个不 同分离体的人类胰岛用〇. 5mM CD预处理一小时并且如所述进行灌注，随后测定响应于葡萄 糖和KCl的胰岛素释放。
[0091] 组织学、肾小球膜扩张和肾小球表面积的评估。执行4pm厚组织切片的过碘 酸-雪夫（Periodic acid-Shiff's，PAS)染色。通过由两名盲法独立研究者执行的半定量 分析（0-4级）针对肾小球膜扩张分析每切片二十个肾小球。在每个遇到的肾小球中对肾 小球表面划定界限，并且如所述计算平均表面积。
[0092] 如我们先前所报导，执行SMPDL3b蛋白质印迹。SMPDL3b过度表达和敲低细胞株先 前也已报导过，并且现在用于如上文所述测定胆固醇含量和RhoA表达。
[0093] 统计分析。数据展示为平均值和标准偏差。针对体外研究执行四到8次独立实验。 每组六只小鼠用于体内实验。用单因素ANOVA执行统计分析。当单因素ANOVA展示统计显 著性时，结果在用于多重比较的杜凯校正（Tukey's correction)之后使用t检验比较。结 果在p<0. 05时被视为统计显著。
[0094] 结果
[0095] 临床实验室测量和患者群体?我们研究了 3〇名男性受试者,这些受试者基于在收 集血清样品时的临床特征被分成三组。这些研究受试者包括：
[0096] 1)具有T1D、正常白蛋白尿以及正常肌酐的1〇名患者，被定义为无糖尿病性肾病 的患者（DKD-)，
[0097] 2)具有T1D、白蛋白尿以及改变的肌酐的1〇名患者，被定义为患有糖尿病性肾病 的患者（DKD+)，
[0098] 3) 10名健康对照（C)。
[0099] 这三组的年龄、总胆固醇、HDL-、LDL-胆固醇以及甘油三酯无显著差异。所有 患者均服用药剂以阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统。糖尿病的持续时间、空腹血浆 葡萄糖以及HbAlC在DKD+和DKD-患者之间并无显著差异。平均估计的肾小球滤过率 (eGFR)在 DKD-中是 101ml/min/l. 73m2,在 C 中是 97ml/min/l. 73m2 并且在 DKD+ 组中是 43ml/min/l_73m2。将先前七年从五名患有DKD的患者中收集的血清（平均eGFR98ml/ min/1. 73m2)用于所选实验。
[0100]暴露于DKD+血清的足细胞具有特征性cDNA签名。如我们先前所报导从在患者血 清存在下培养的分化的足细胞中提取RNA。cDNA微阵列分析揭露了在与DKD-处理的足细胞 相比时在DKD+处理的足细胞中改变的主要路径包括参与肌动蛋白重构、胰岛素信号传导、 细胞因子信号传导（主要通过TLR4、TNF □以及ILlO)以及细胞凋亡的基因。我们在由 蛋白质印迹展现的蛋白质层面证实了这些发现,在DKD+处理的足细胞中，MyD88表达增加， 胰岛素使AKT磷酸化的能力受损，并且裂解的半胱天冬酶3的量增加。
[0101]暴露于患有DKD的患者的血清的正常人类足细胞呈现细胞空泡化。暴露于患有 DKD的患者的血清的足细胞经历显著的肌动蛋白细胞骨架重构以及细胞骨架与质膜的局部 去耦（空泡化），这在鬼笔环肽染色（F-肌动蛋白）和亮场图像两者中均显而易见，并且这 与我们在病灶性和节段性肾小球硬化中报导的内容截然不同。细胞空泡化的定量分析（所 分析的总共200个连续细胞中具有空泡的细胞的百分比）在暴露于DKD+血清的80%细胞 中但在暴露于DKD-血清的仅20%细胞和5%对照中揭露了这种表型。细胞空泡化伴随着 活性RhoA在细胞空泡化部位的再分布和总RhoA的增加。细胞空泡化并非DKD+组中GFR 减少的结果，因为从最终发展DKD的具有TlD和正常GFR的五名患者收集的历史血清在培 养的足细胞中引起与在平均7 □ 2年后在患者已确立DKD与大量白蛋白尿和低GFR时收集 的来自相同患者的血清相同程度的细胞空泡化。
[0102] 暴露于DKD+血清的足细胞和来自患有早期糖尿病的患者的肾小球中的受损的逆 向胆固醇转运。由于炎症、胰岛素抵抗、细胞凋亡以及细胞骨架重构通过非酒精性脂肪性肝 炎（NASH综合征）的发病机制中的脂质胞内积聚联系在一起，并且已在患有DKD的小鼠的 肾脏皮质中描述了胆固醇积聚，故我们探索了在患有DKD的患者的血清存在下培养的足细 胞是否积聚胞内胆固醇。我们能够展示ORO和菲律宾菌素阳性细胞在DKD-和DKD+处理的 细胞中数目增加，在DKD+处理的细胞中增加更多。总、游离以及酯化胆固醇的定量分析掲 露了在与用来自对照受试者的血清处理的细胞相比时，DKD+处理的细胞中的酯化胆固醇显 著增加。这种增加很可能是由于胆固醇外流受损，因为LDL-受体和HMG-CoA还原酶表达不 变，而ABCAlmRNA表达在DKD+处理的足细胞中下调。我们接着研究了在与32个正常活供 体相比时来自另外70名患有T2D和早期DKD的患者的肾小球中的脂质相关基因的mRNA表 达，并且证实了 ABCAl在DKD中明显下调。有趣的是，ABCAlmRNA表达的下调仅是DKD的特 征，因为ABCAl在其他蛋白尿肾小球疾病如膜性肾病变（MN, n = 21)和局灶节段性肾小球 硬化（FSGS，n = 18)中不被调节。
[0103] 环糊精在体外保护足细胞。由于培养中的足细胞暴露于DKD+血清引起与 ABCAl (-种负责胆固醇外流的转运蛋白）表达减少相关联的总胆固醇积聚，故我们继续测 试了以下假设：环糊精将保护足细胞免于在暴露于来自患有DKD的患者的血清之后观察到 的肌动蛋白细胞骨架重构和细胞空泡化。我们能够展示出CD使菲律宾菌素阳性细胞的数 目减少并且保留了磷酸化小窝蛋白到局部粘附部位的定位。定量胆固醇分析展示出CD在 DKD+处理的足细胞中预防总和酯化胆固醇的积聚。此外，用CD预防胞内胆固醇积聚也预防 DKD+诱发的细胞凋亡、胰岛素抵抗以及MyD88表达。在足细胞中用辛伐他汀阻断HMG-CoA 还原酶并不保护免于DKD+诱发的肌动蛋白细胞骨架重构。
[0104] 皮下给予CD保护BTBR ob/ob小鼠免于发展DKD。BTBR(黑色和褐色，短尾）〇b/ 〇b (瘦素缺失型）小鼠已被描述为进行性DKD的小鼠模型。在基于初步毒理学研究确立给 予的剂量和模式之后，我们用皮下给予每周三次注射的羟丙基-e _环糊精（CD，4, OOOrag/ kg体重）持续五个月来处理4周大的BTBR小鼠。尽管直到在纯合小鼠中开始处理后2个 月观察到白蛋白排泄率无变化，但在3个月时观察到在与未处理的BTBR ob/ob小鼠相比时 在经⑶处理者的晨点尿样品中的白蛋白/肌酐比明显下调（p<〇_ 〇〇1)。这种减小保持到处 死为止（在开始处理之后5个月。在处死时，CD处理的小鼠展示出肾脏重量减少。CD并不 影响肾脏皮质中的ABCAlmRNA表达但弓I起总胆固醇明显减少。血尿素氮（BUN)和肌酐不受 CD处理显著影响。然而，CD处理引起肾小球膜扩张减少且不影响肾小球表面积。
[0105] 在处理四个月之后，我们也观察到体重减少，这伴随着随机血糖的同时改善。此 夕卜，在处死时收集的血清证实了空腹血浆胰岛素和空腹血浆葡萄糖的明显提高。在处死前 一周执行的IPGTT在与纯合对照相比时在CD处理的纯合小鼠中被改善。由于观察到改善， 尽管是类似的胰岛素敏感性测试，故我们分析了低剂量CD对人类胰岛细胞的四种不同制 剂的作用。在与未处理的人类胰岛相比时在CD处理的人类胰岛中观察到葡萄糖刺激的胰 岛素释放的明显改善。为了确定CD对胰岛细胞功能的有利作用是否与胰岛中ABCAl表达 的调节有关，我们使用兔多克隆ABCAl抗体（来自A?门德斯博士（Dr. A. Mendez)的礼物） 执行了免疫荧光染色并且将ABCAl表达测定为平均荧光强度/所分析的胰。来自纯合BTBR ob/ob小鼠的胰的特征在于在与杂合同窝幼畜相比时ABCAl表达显著减少（p<〇. 〇〇1)，并 且CD处理显著增加纯合BTBR ob/ob (p<0_ 001)和杂合BTBR ob/+小鼠（p<〇_ 〇1)的胰中的 ABCAl表达。由于己在使用其他环糊精衍生物时在啮齿动物和人类中描述了溶血性贫血和 肝毒性，并且由于我们给予高剂量CD持续5个月的时段，故我们研究了处死时的血红蛋白、 天冬氨酸转氨酶（AST)、丙氨酸转氨酶（ALT)以及谷氨酰基转移酶（GGT)。观察到并无 因长期CD给予所致的异常，指示 CD的长期使用不伴随不良副作用（参见表）。
[0106] 本发明的功效和/或安全性可以参照在此随附的图式示出，这些图式的图例提供 于下文中：
[0107]图1示出了一系列图，（a)到⑴示出了所进行的支持⑶在体内改善糖尿病的实 验或研究的结果。具体地参考图1中的每一图，（a、b) -周三次皮下给予纯合和杂合BTBR ob/ob小鼠的CD(每组n = 6)引起了在处理开始之后四个月时开始的体重明显减少（平 均值土SD)。*p<〇. 05, **p<〇. 〇1。（c)给予纯合BTBR ob/ob小鼠的CD引起了在处理开始 之后四个月时开始的随机血糖（平均值土SD)明显减少。（d、e)空腹血浆胰岛素和葡萄糖 浓度的条形图分析（平均值土sd)。空腹血浆胰岛素r P<〇_〇i r*p<〇.001) (d)和空腹血 浆葡萄糖C*P<〇. 01) (e)在与杂合对照相比时在纯合小鼠中显著增加。该增加被CD处理 所预防（##P〈〇_ 01)。（f)在CD处理开始之后5个月时执行的IPGTT展示出在与未处理的 BTBR 〇V〇b小鼠相比时在CD处理的BTBR ob/ob小鼠中葡萄糖耐量提高。（g) CD处理不影 响BTBRob/ob小鼠中对单剂量短效胰岛素（4mU/g)的敏感性。（h)代表性灌注实验和曲线 下面积（AUC)的条形图分析展现了 〇.5福⑶对来自四个独立供体的人类胰岛中葡萄糖刺 激的胰岛素释放的作用（**p<〇.〇l)。（i)ABCAl的免疫荧光染色揭露了在与未处理的同窝幼 畜相比时CD处理的BTBR ob/ob小鼠的胰中的ABCAl表达增加（图6i，左）。条形图分析 (图6i，右）展示了从纯合BTBR ob/ob小鼠中分离的胰的特征在于在与杂合同窝幼畜相比 时ABCAl表达显著减少（###p〈0. 001)。CD处理显著增加纯合BTBR ob/ob (_p〈〇. 〇〇1)和 杂合BTBR ob/+小鼠（**p〈0. 01)的胰中的ABCAl表达。
[0108] 图2示出了支持CD在体内保护免于糖尿病性肾病的图（a)到⑴。（a) -周三次皮 下给予纯合和杂合BTBR ob/ob小鼠（每组n = 6)的CD引起在处理开始之后3个月时开始 的白蛋白/肌酐比（平均值土SD)减小。*p<0.05，p<0.01，***p<0.001。（b)肾脏重量（平 均值土SD)在纯合小鼠中显著增加r*p〈0. 001)，且该增加被⑶处理所预防（##p<0. 01)。（C) ⑶对纯合和杂合BTBR ob/ob小鼠的肾脏皮质中ABCAlmRNA表达的作用的条形图分析（平 均值土SD)。（d)CD对纯合和杂合BTBR ob/ob小鼠的肾脏皮质中总胆固醇含量的作用的条 形图分析（平均值土SD)。（e、f)条形图分析（平均值土SD)展示了血清BUN和肌酐浓度 在CD处理小鼠之后保持不变。到从小鼠处死时获得的血清执行测量。（g)在用或者CD或 者媒介物处理五个月之后来自纯合和杂合BTBR ob/ob小鼠的肾脏切片的代表性PAS染色。 (h、i)在用或者CD或者媒介物处理五个月之后来自纯合和杂合BTBR ob/ob小鼠的PAS染 色的肾脏切片的肾小球膜扩张分数（h)和肾小球表面积（i)的条形图分析（平均值土SD) 由两名盲法独立研究者评估。在比较DKD+对C时*p〈0. 05。在比较⑶处理的小鼠对未处 理的小鼠时#P<〇. 05。
[0109] 图3是示出了 CD在遵循皮下给予每周三次注射的羟丙基环糊精（CD, 4, 000mg/kg体重）持续五个月处理的4周大BTBR小鼠中的安全性的表。由于更老和更具 毒性的CD衍生物已展示会引起贫血和肝毒性，故我们测试了在糖尿病和对照小鼠中长期 给予高剂量羟丙基-P -环糊精的作用。
[0110] 在图4(a)到⑴中，结果展示出胆固醇积聚发生在暴露于DKD+血清的足细胞中 (a)在与C和DKD-血清相比时暴露于DKD+血清的足细胞的代表性油红0染色。黑色箭头 指向主要脂滴积聚的点。（b)在与C和DKD-相比时暴露于DKD+血清的足细胞的代表性菲 律宾菌素染色（橙色）和磷酸化小窝蛋白染色（绿色）。（c)暴露于来自10名患有DKD-、 DKD+的患者的血清池或来自对照的血清池的足细胞中油红〇阳性细胞的条形图定量分析 (平均值土SD)展现出暴露于DKD-和DKD+血清均弓丨起所培养的人类足细胞中的明显脂滴 积聚。V〇. 〇5,、<0? 001。（d、e、f)在与C和DKD-相比时在暴露于DKD+血清池的足细 胞中如经由酶促反应测定的总胆固醇（Tot C)、游离胆固醇（Free C)以及酯化胆固醇（Est C)的条形图分析（平均值土SD)。*p<〇.〇5。（g、h、i)在暴露于单独患者血清的足细胞中的 LDL受体、HMG-CoA还原酶以及ABCAl表达的定量RT PCR分析（平均值土SD)。_p<0. 001。 (j).在与32名活供体相比时在患有早期MD的70名患者、患有膜性肾病变（MN)的21名 患者以及患有局灶节段性肾小球硬化（FSGS)的18名患者中脂质相关基因的肾小球基因表 达的转录分析。数字反映在与活供体相比时疾病的倍数变化。
[0111]图5的图（a)到⑴展示了 〇)保护足细胞免于在暴露于DKD+血清之后观察到 的变化。（a)在存在（CD)或不存在（对照）CD的情况下在与C和DKD-血清相比时暴露于 DKD+血清的正常人类足细胞的代表性鬼笔环肽（红色）和磷酸化小窝蛋白（绿色）共聚 焦图像。DAPI (蓝色）用于鉴别细胞核（b、c) CD对在与c和DKD-血清相比时暴露于DKD+ 血清的CD处理（+)对未处理（―）足细胞中总（B)和酯化胆固醇 （c)的作用的条形图分析 (平均值土 SD)。在比较DKD+对C时*p<0. 05。在同一组中比较CD处理对未处理足细胞时 #p<0. 05。（d、e、f)在与C和DKD-血清相比时暴露于DKD+血清的CD处理（+)对未处理 (_)足细胞中裂解的半胱天冬酶3、胰岛素刺激的AKT磷酸化以及MyD88表达的条形图分析 (平均值土SD)。在比较DKD+对C时*p<0.〇5和、<〇_〇1。在同一组中比较CD处理对未处 理足细胞时#P<〇.〇5。
[0112] 图6的图（a)到（f)示出了鞘脂相关酶（即SMPDL3b)的表达在目标器官（如肾 脏）的糖尿病中增加并且引起脂质依赖性损伤。（a)在与32名活供体相比时在患有DKD 的12名患者中SMPDL3b的肾小球基因表达的转录分析。数字反映在与活供体相比时疾病 的倍数变化。*P<〇. 05(b)在来自健康对照（C)或年龄和性别匹配的患有DKD的糖尿病患者 (DKD+)或无DKD的糖尿病患者（但具有相同糖尿病持续时间和血浆脂质特征曲线）的血清 存在下培养的正常人类足细胞中SMPDL3b蛋白质表达的代表性蛋白质印迹和相对条形图 分析。p<0. 05 (c、d)在正常培养基（对照）或补充TNFct的培养基中培养的正常人类足细 胞和过度表达SMPDL3b的足细胞（SMPDL3b 0E)中油红0、胆固醇、甘油三酯以及磷脂的代 表性油红〇染色和条形图分析。在比较了呢(3处理或8]^01^313(^与对照时邮<0.05。在 比较SMPDL3b OE对空载体（EV)对照中的油红〇染色时###p, 〇? 001 ( □)代表性鬼笔环肽 染色展现暴露于DKD+血清的正常人类足细胞中的肌动蛋白细胞骨架重构，一种在SMPDL3b 被沉默的细胞（SMPDL3b KD)中得到预防的现象。（f)代表性蛋白质印迹和条形图分析展 现SMPDL3b KD人类足细胞对在暴露于DKD+血清之后观察到的RhoA表达增加具有抵抗性。 *p<〇_ 〇5。
[0113] 结论
[0114] 2-羟丙基-P-环糊精（2-HPPCD，一种强胆固醇受体）是在体内和体外螯合胆固 醇以及保护受糖尿病、前驱糖尿病、代谢综合征以及肥胖影响的任何细胞免于胆固醇依赖 性损伤的有效方式。
[0115] 应认识到，相关发明可能处于在此披露内容的精神内。此外，在当前申请中没有遗 漏旨在将本发明人限制于当前权利要求书或披露内容。虽然本发明的某些优选和替代实施 例已为了披露本发明的目的进行阐述，但本领域的普通技术人员可进行对所披露的实施例 的修改。
【权利要求】
1. 一种用于减少患者的细胞或细胞质膜中的脂质含量的方法，该患者罹患一种选自以 下各项的病况：糖尿病（1型）、糖尿病（2型）、前驱糖尿病、肥胖、代谢综合征、糖尿病性肾 病变、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病相关的微血管并发 症、糖尿病相关的大血管并发症、动脉粥样硬化、外周血管疾病、冠状动脉疾病、充血性心力 衰竭、心脏肥大、心肌梗塞、内皮功能障碍以及高血压、中风、脑血管意夕卜、心肌梗塞、心脏病 发作、心血管意外、脂肪肝、脂肪性肝炎、NASH以及胰岛素抵抗，所述方法包括向该患者给予 有效量的一种减少细胞脂质含量的化合物。
2. 如权利要求1所述的方法，其中该化合物抑制与胆固醇积聚有关的一种细胞内流机 制或增强与胆固醇积聚有关的一种细胞外流机制。
3. 如权利要求1所述的方法，其中该化合物调节一种鞘脂酶以减少细胞胆固醇积聚。
4. 如权利要求1所述的方法，其中该细胞位于受糖尿病影响或造成糖尿病发展的一种 中心或外周器官中。
5. 如权利要求4所述的方法，其中该器官是一个胰脏。
6. 如权利要求2所述的方法，其中该化合物进一步干扰一种细胞胆固醇合成路径。
7. 如权利要求1所述的方法，其中该化合物是一种环糊精或一种环糊精的一种衍生物 或类似物。
8. 如权利要求7所述的方法，其中该环糊精是羟丙基β环糊精。
9. 如权利要求1所述的方法，其中该病况是选自肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病、糖尿 病、糖尿病性肾病或者与其相关的病况或症状。
10. 如权利要求7所述的方法，其中该环糊精或一种环糊精的衍生物通过选自肌内、腹 膜内、静脉内（全身）、皮下、经皮、经口、经直肠、吸入、局部以及鼻内的一种途径给予。
11. 如权利要求10所述的方法，其中该给予途径是皮下。
12. 如权利要求7所述的方法，其中该环糊精或一种环糊精的衍生物以在从约2-20mg/ kg/天到约4, 000-20, 000mg/kg/周范围内的一个剂量给予。
13. 如权利要求12所述的方法，其中该环糊精或一种环糊精的衍生物给予每周至少一 次到每天约三次。
14. 如权利要求7所述的方法，其中该化合物以主要由至少一种环糊精或至少一种环 糊精的衍生物和至少一种医药学上可接受的赋形剂或媒介物组成的一种组合物形式给予。
15. 如权利要求7所述的方法，其中该化合物以包括一种环糊精或一种环糊精的衍生 物、并非一种环糊精或一种环糊精的衍生物的一种第二活性成分以及一种赋形剂或媒介物 的一种组合物形式给予。
16. 如权利要求15所述的方法，其中该第二活性成分是选自一种抗糖尿病剂、一种胆 固醇生物合成抑制剂、一种胆固醇吸收抑制剂、一种胆酸螯合剂、烟酸或烟酸衍生物、一种 贝特类药、一种胆固醇酯转移酶蛋白以及一种乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶抑制剂或一种 生物制剂。
17. 如权利要求15所述的方法，其中该第二活性成分是选自一种免疫抑制剂、胰岛素、 磺脲、列汀类药、二甲双胍、噻唑烷二酮、胰岛素敏化剂、肠促胰岛素类似物、DPP4抑制剂、 VEG干扰剂、生长因子、消炎药、维生素 D衍生物、RAS系统阻断剂以及醛固酮阻断剂。
18. -种用于治疗、抑制、预防或改善由细胞或细胞质膜中胆固醇积聚引起的病况、症 状或继发性病况的方法，所述方法包括向一名罹患该病况或症状或继发性病况的患者给予 有效量的一种化合物，该化合物通过影响与胆固醇积聚有关的一种细胞内流机制或与胆固 醇积聚有关的一种细胞外流机制来减少细胞胆固醇积聚。
19. 如权利要求18所述的方法，其中细胞胆固醇积聚发生在以下各项中：糖尿病（1 型）、糖尿病（2型）、前驱糖尿病、肥胖、代谢综合征、糖尿病性肾病变、糖尿病性肾病、糖尿 病性神经病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病相关的微血管并发症、糖尿病相关的大血管并 发症、动脉粥样硬化、外周血管疾病、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、心脏肥大、心肌梗塞、 内皮功能障碍以及高血压、中风、脑血管意外、心肌梗塞、心脏病发作、心血管意外、脂肪肝、 脂肪性肝炎、NASH、胰岛素抵抗。
20. 如权利要求18所述的方法，其中细胞胆固醇积聚由糖尿病（1型）、糖尿病（2型）、 前驱糖尿病、肥胖、代谢综合征、糖尿病性肾病变或糖尿病性肾病造成。
21. 如权利要求18所述的方法，其中该化合物抑制与胆固醇积聚有关的一种细胞内流 机制或增强与胆固醇积聚有关的一种细胞外流机制。
22. 如权利要求18所述的方法，其中该细胞位于受糖尿病影响或造成糖尿病发展的一 种中心或外周器官中。
23. 如权利要求22所述的方法，其中该器官是一个胰脏。
24. 如权利要求18所述的方法，其中该化合物调节一种鞘脂酶以减少细胞胆固醇积 聚。
25. 如权利要求24所述的方法，其中该化合物进一步干扰一种细胞胆固醇合成路径。
26. 如权利要求18所述的方法，其中该化合物是一种环糊精或一种环糊精的一种衍生 物。
27. 如权利要求26所述的方法，其中该环糊精是羟丙基β环糊精。
28. 如权利要求18所述的方法，其中该化合物通过选自肌内、腹膜内、静脉内（全身）、 皮下、经皮、经口、经直肠、吸入、局部以及鼻内的一种途径给予。
29. 如权利要求26所述的方法，其中该环糊精或一种环糊精的衍生物以在从约2mg/ kg/天到约20,000mg/kg/周范围内的一种剂量给予。
30. 如权利要求26所述的方法，其中该环糊精或一种环糊精的衍生物给予每周至少一 次到每天约三次。
31. 如权利要求18所述的方法，其中该化合物以主要由至少一种环糊精或至少一种环 糊精的衍生物和至少一种医药学上可接受的赋形剂或媒介物组成的一种组合物形式给予。
32. 如权利要求18所述的方法，其中该化合物以包括一种环糊精或一种环糊精的衍生 物、并非一种环糊精或一种环糊精的衍生物的一种第二活性成分、以及一种赋形剂或媒介 物的一种组合物形式给予。
33. 如权利要求32所述的方法，其中该第二活性成分是选自一种抗糖尿病剂、一种胆 固醇生物合成抑制剂、一种胆固醇吸收抑制剂、一种胆酸螯合剂、烟酸或烟酸衍生物、一种 贝特类药、一种胆固醇酯转移酶蛋白以及一种乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶抑制剂或一种 生物制剂。
34. 如权利要求32所述的方法，其中该第二活性成分是选自一种免疫抑制剂、胰岛素、 磺脲、列汀类药、二甲双胍、噻唑烷二酮、胰岛素敏化剂、肠促胰岛素类似物、DPP4抑制剂、 VEG干扰剂、生长因子、消炎药、维生素 D衍生物、RAS系统阻断剂以及醛固酮阻断剂。
35. -种用于治疗、抑制、预防或改善由细胞胆固醇积聚引起的症状或相关病况的组合 物，所述组合物包括有效量的一种环糊精或环糊精衍生物和一种医药学上可接受的赋形剂 或媒介物。
36. 如权利要求35所述的组合物，其中该组合物基本上由作为该组合物中的一种活性 医药成分的一种或多种环糊精或环糊精衍生物组成。
37. 如权利要求35所述的组合物，其中该组合物进一步包括并非一种环糊精或一种环 糊精的一种衍生物的一种第二活性医药成分。
38. 如权利要求35所述的组合物，其中该第二活性成分是选自一种抗糖尿病剂、一种 胆固醇生物合成抑制剂、一种胆固醇吸收抑制剂、一种胆酸螯合剂、烟酸或烟酸衍生物、一 种贝特类药、一种胆固醇酯转移酶蛋白以及一种乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶抑制剂或一 种生物制剂。
39. 如权利要求35所述的组合物，其中该第二活性成分是选自一种免疫抑制剂、胰岛 素、磺脲、列汀类药、二甲双胍、噻唑烷二酮、胰岛素敏化剂、肠促胰岛素类似物、DPP4抑制 齐U、VEG干扰剂、生长因子、消炎药、维生素 D衍生物、RAS系统阻断剂以及醛固酮阻断剂。
40. -种制品，包括一种组合物于一种容器中，所述组合物包括至少一种环糊精或一种 环糊精的一种衍生物，其中该容器是与书面指示一起包装的，该书面指示关于该组合物用 于治疗由细胞脂质积聚引起的一种病况或由细胞脂质积聚引起的症状的用法。
41. 如权利要求40所述的制品，其中该病况是选自糖尿病（1型）、糖尿病（2型）、前驱 糖尿病、肥胖、代谢综合征、糖尿病性肾病变、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性 视网膜病变、糖尿病相关的微血管并发症、糖尿病相关的大血管并发症、动脉粥样硬化、夕卜 周血管疾病、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、心脏肥大、心肌梗塞、内皮功能障碍以及高血 压、中风、脑血管意外、心肌梗塞、心脏病发作、心血管意外、脂肪肝、脂肪性肝炎、NASH以及 胰岛素抵抗。
42. 如权利要求40所述的制品，其中该病况是选自肥胖、代谢综合征、前驱糖尿病、糖 尿病、糖尿病性肾病或者与其相关的病况或症状。
43. 如权利要求35所述的制品，其中该细胞脂质是胆固醇。
【文档编号】A61K31/724GK104244956SQ201380019867
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月12日 优先权日:2012年4月13日
【发明者】阿莱西亚·弗莫尼, 桑德拉·梅尔舍-戈麦斯 申请人:L&F保健有限公司