用于心脏组织保护的干细胞的组合物和方法

用于心脏组织保护的干细胞的组合物和方法【专利摘要】本公开内容描述了通过在含有溶血磷脂酸，优选还含有凝胶即，仿生凝胶的培养基中培养细胞来增强造血干细胞，优选来源于人脐带或外周血的CD34+在低氧和去血清条件下的存活的方法和组合物。所述方法和组合物可用于医学或化妆品应用，特别地，用于治疗心脏组织和/或心脏病，和/或用于治疗伤口愈合即糖尿病伤口愈合。【专利说明】用于心脏组织保护的干细胞的组合物和方法【
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】[0001]本公开内容涉及利用溶血磷脂酸处理的人造血干细胞的组合物和方法，所述组合物和方法增强在低氧和去血清条件下的存活并且在心肌梗塞后保护心脏组织。[0002]背景[0003]心脏病是发达国家和发展中国家中死亡和失能的首要原因，约占全部人死亡数目的40%。许多存活的患者患上被称为充血性心力衰竭（CHF)的心脏病的慢性形式，该疾病形式与心肌的进行性退化、瘢痕形成、LV(左心室）扩张和机能障碍相关。具有严重缺血性心力衰竭的患者具有高发病率和死亡率，而心脏移植是唯一可用的决定性疗法。[0004]最近，在经历MI(心肌梗塞）的人患者中已测试了不同来源的干细胞，包括成人外周血干细胞（APBSC)和骨髓来源的干细胞（BMDSC)(Losordo,D.W.，等人,IntramyocardialtransplantationofautologousCD34+stemcellsforintractableangina:aphaseI/IIadouble-blind,randomizedcontrolledtrial.Circulation,2007.115(25):p.3165-72；Schachinger,V.,等人,Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed，2006.355(12):p.1210-21)。已在大部分试验中报导了LV射血分数的改善(Schachinger,V.,等人，Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed,2006.355(12):p.1210-21；Passier,R.,L.ff.vanLaake,andC.L.Mummery,Stem-cell-basedtherapyandlessonsfromtheheart.Nature,2008.453(7193):p.322-9);然而，功能性改善仍然不明显（射血分数低于5%)。因此，需要替代的方法以（i)增强干细胞的治疗作用和（ii)治疗拥有具有削弱的生物活性的成体干细胞的老年患者（例如糖尿病患者，等）（Passier,R.，L.ff.vanLaake和C.L.Mummery,Stem-cell-basedtherapyandlessonsfromtheheart.Nature,2008.453(7193):p.322-9)。[0005]从人脐带血分离的⑶34+细胞可以是用于心脏再生的有前景的细胞疗法。这些干细胞可被自体地使用，可在体外或体内分化成血管细胞（LeRicousse_Roussanne，S.，等人，Exvivodifferentiatedendothelialandsmoothmusclecellsfromhumancordbloodprogenitorshometotheangiogenictumorvasculature.CardiovascRes，2004.62(l):p.176-84)并且在心肌缺血的动物模型中增强新生血管形成（Ma，N.，等A,HumancordbloodcellsinduceangiogenesisfollowingmyocardialinfarctioninNOD/scid-mice.CardiovascRes,2005.66(1):p.45-54；Hirata,Y.,等人,Humancordbloodbloodcellsimprovecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.BiochemBiophysResCommun,2005.327(2):p.609-14)。从人胳带血分离的CD34+细胞相较于APBSC和BMDSC具有几个有利方面，包括更高的增生率、相对低的在体内产生不想要的细胞的风险（与对于BMDSC所描述的风险相反）以及用于经历MI并且具有功能受损的人外周血CD34+细胞的患者的适当的细胞疗法[5,10]。为了获得临床功效，干细胞或其后代必须存活和移植入宿主组织。不幸地，许多细胞在递送后数天死亡（Ma，N.，等A,HumancordbloodcellsinduceangiogenesisfollowingmyocardialinfarctioninNOD/scid-mice.CardiovascRes,2005.66(1):p.45-54；Hirata,Y.,等人，Humancordbloodbloodcellsimprovecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.BiochemBiophysResCommun，2005.327(2):p.609-14;Henning，R.J·，等人，Humancordbloodprogenitorcellsareattractedtoinfarctedmyocardiumandsignificantlyreducemyocardialinfarctionsize.CellTransplant,2006.15(7):p.647-58)〇[0006]一般描述[0007]本公开内容的一个方面描述了通过在含有溶血磷脂酸，优选还含有凝胶（即，仿生凝胶）的培养基中培养细胞来增加造血干细胞，优选来源于人脐带或外周血的CD34+细胞在低氧和去血清条件下的存活的方法。[0008]该组合令人惊讶地增加了低氧和去血清条件下的存活，并且在心肌梗塞后保护心脏组织。该混合物，特别地在血纤蛋白中利用溶血磷脂酸处理的来源于人脐带血的⑶34+，显示改善的结果。[0009]在公开的方法的实施方案中，仿生凝胶可以是下列物质的至少一种：血纤蛋白、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、胶原、PEG衍生物及其混合物。优选地血纤蛋白凝胶，更优选地血纤蛋白凝胶以l-l〇〇mg/ml的终浓度包含血纤蛋白原以及以l-500U/ml的终浓度包含凝血酶。更优选，血纤蛋白凝胶以10_30mg/ml的终浓度包含血纤蛋白原和以2-50U/ml的终浓度包含凝血酶。[0010]在公开的方法的实施方案中，溶血磷脂酸的浓度在1至1000μΜ之间变化，优选为100μm〇toon]本公开内容的一个方面描述了组合物，所述组合物包含：造血干细胞，优选来源于人脐带或外周血的⑶34+;以及溶血磷脂酸，优选还包含凝胶，即仿生凝胶。[0012]该组合令人惊讶地增加低氧和去血清条件下的存活，并且在心肌梗塞后保护心脏组织。该混合物，特别地血纤蛋白中利用溶血磷脂酸处理的人脐带血的⑶34+，显示改善的结果。[0013]在公开的组合物的实施方案中，仿生凝胶可以是下列物质的至少一种：血纤蛋白、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、胶原、PEG衍生物及其混合物。优选地血纤蛋白凝胶，更优选地血纤蛋白凝胶以l-l〇〇mg/ml的终浓度包含血纤蛋白原以及以l-500U/ml的终浓度包含凝血酶。更优选，血纤蛋白凝胶以10_30mg/ml的终浓度包含血纤蛋白原和以2-50U/ml的终浓度包含凝血酶。[0014]在公开的组合物的实施方案中，溶血磷脂酸的浓度在1与1000μΜ之间变化，优选为100μΜ。[0015]公开的组合物的实施方案可包含IX105-1Χ106个⑶34+细胞和1-100μΜ的溶血磷脂酸，以及100_200mL的仿生凝胶。[0016]在其它方面，公开的组合物可用于医学或化妆品应用，即药物组合物、医药组合物或化妆品组合物，即对于Cd34+细胞和LPA，先前的组分以治疗有效量存在，并且还可包含足够量的赋形剂。具体地，在心脏组织和/或心脏病的治疗中，和/或在伤口愈合即糖尿病伤口愈合的治疗中。[0017]在实施方案中，本公开内容的组合物可以是可注射制剂。[0018]在本公开内容中，显示了利用溶血磷脂酸（LPA)处理的并且在低氧和去血清条件下培养的造血干细胞即CD34+细胞使它们的存活相对于未处理的细胞加倍。令人惊讶地，细胞增殖并且相较于对照，分泌高水平的细胞因子例如IL-4、IL-8和TNF-α。最后，LPA-处理的细胞在心肌梗塞后保护心脏功能但未处理的细胞不保护。[0019]附图概述[0020]下列附图提供了优选实施方案来举例说明本说明书，并且不应当被看作限定本发明的范围。[0021]图1-LPA的化学结构。在具有或不具有药物的无血清培养基中于低氧中培养24h的⑶34+细胞的存活、细胞凋亡和坏死。结果为平均值土SEM(η=2-13)。[0022]图2-LPA增加在低氧和去血清条件下培养的细胞中的CD34+细胞存活。（Α)在常氧、低氧以及低氧和LPA处理中于无血清培养基中培养24h的CD34+细胞的存活、细胞凋亡和坏死。（B)LPA浓度对在低氧或常氧中于无血清培养基中培养24h的CD34+细胞的存活的作用。（C)LPA对在低氧中培养1(H1)或3天（H3)，在低氧中培养1天并在常氧中培养3天（H1+N3)，或在常氧中培养1(N1)或4天（N4)的细胞的存活的作用。在所有图中，用或不用LPA(lOOyM)培养细胞。结果为平均值土SEM(n=4-50)。在所有图中，*表示统计显著性：*Ρ〈0·05,**Ρ〈0·01，***Ρ〈0·001。[0023]图3-LPA影响细胞增殖并且对低氧和去血清条件下的细胞分化具有最低限度的影响。（A)在于低氧中培养1天和于常氧中培养3或6天后的细胞总数。（B)通过流式细胞术测量的细胞分化（n=1)。将细胞在低氧中培养1天，随后在常氧中培养6天或不培养6天。在所有图中，用或不用LPA(100μΜ)培养细胞。[0024]图4-LPA影响被封装在血纤蛋白凝胶中并且在低氧和去血清条件下培养的⑶34+细胞的细胞存活。（A.1)在具有或不具有LPAdOOyM)的无血清培养基中于低氧中培养细胞1天。（A.2)在具有或不具有LPAdOOyM)的无血清培养基中于低氧中培养细胞3天。在所有图中，结果为平均值土SEM(n=3-6)。在所有图中，*表示统计显著性：*P〈0.05,#P〈0.01，#*P〈0.001。[0025]图5-LPA主要通过过氧化物酶体增殖物激活物受体（PPAR)诱导⑶34+细胞存活。将细胞在具有LPA的无血清培养基中培养。在于低氧和包含LPA(100μM)的细胞培养基中培养24小时之前，利用Rho激酶抑制剂（Υ-2762,50μΜ)、分裂原活化蛋白激酶（ΜΑΡΚ)抑制剂（PD98059,60μM)、LPA1-和LPA3-特异性抑制剂（Kil6425,10μΜ)或过氧化物酶体增殖物激活受体g(PPARg)抑制剂（GW9662,50μΜ)预处理细胞1小时。将无任何预处理并且在具有或不具有LPA的无血清培养基中于低氧中培养24h的细胞分别用作阳性和阴性对照。结果为平均值土SEM(n=3-6)。*表示统计显著性：*P〈0.05,#P〈0.01，*#P〈0.001。[0026]图6-LPA-处理的⑶34+细胞在心肌梗塞后保护心脏功能。通过冠状动脉左前降支（LAD)的永久性结扎诱发心肌梗塞。（A)具有（假处理组（sham)、凝胶+⑶34+细胞、凝胶+LPA-处理的CD34+细胞）或不具有LAD结扎（正常）的动物的心脏缩短分数。在LPA-处理的⑶34细胞中，在移植前lh利用100μΜ的LPA处理细胞。将细胞（lxlO6个细胞）于血纤蛋白凝胶前体溶液（100mL)中递送入裸大鼠的梗塞的心脏。（B)针对第1周标准化的第3周的心脏缩短分数。在所有图中，结果为平均值土SEM(η=6-10)。*表示统计显著性：*Ρ〈0.05,#Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001。[0027]发明详述[0028]在本公开内容中，显示了造血干细胞，即在低氧和去血清条件下培养的利用溶血磷脂酸（LPA)处理的CD34+细胞，令人惊讶地使它们的存活相对于未处理的细胞加倍。优选，细胞增殖并且相较于对照分泌高水平的细胞因子例如IL-4、IL-8和TNF-α。结果显示CD34+细胞存活主要通过过氧化物酶体增殖物激活物受体介导。最后，本公开内容显示LPA处理的细胞在心肌梗塞后保护心脏功能但未处理的细胞不保护。[0029]本发明使得造血干细胞（即CD34+细胞）的存活、（在数量和量级上）细胞增殖和对组织再生的治疗作用能够令人惊讶地增强，并且维持溶血磷脂酸的作用。[0030]在低氧和去血清条件下意外地观察到该作用，并且还令人惊讶地观察到干细胞，具体地⑶34+细胞表达LPAR(LPA-受体），并且上文所列的作用可通过用溶血磷脂酸（LPA)处理⑶34+来实现。[0031]实施方案[0032]从UCB分离CD34+细胞。在实施方案中，从依照葡萄牙法律签订知情同意书的供体采集所有人脐带血（UCB)。采集被MaternidadeDanieldeMatos的伦理委员会批准。样品被贮存在装有35mL柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖抗凝剂溶液的无菌袋中。从在Ficoll(优选地，Histopaque_1077HybriMax;优选地，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)密度梯度分离后获自UCB样品的单核细胞分离⑶34+细胞。按照制造商的推荐，使用mini-MACS免疫磁化分离系统（优选地，MiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germany,http://www.miltenyibiotec.com)阳性选择（2次）0)34+细胞。将⑶34+细胞立即用于细胞封装研究或体内实验而无需进一步处理。分离的细胞对于⑶34抗原的纯度高于95%，如通过FACS确认的。这些细胞是CD34+CD45+CD31+KDR-vWF-CD14-(Pedroso，D.C.，等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne,2011.6(1):p.el6114)〇[0033]细胞处理。在实施方案中，将UCB⑶34+细胞（IX106个细胞/mL)在药理学药物存在或不存在的情况下在低氧室（〇.5%的02和5%的C02)中于X-Vivo培养基（Lonza)中温育24h，以分别通过膜联蛋白V和PI的表达的FACS分析进一步评估细胞存活/凋亡和坏死。优选地，在进行低氧培养前用各自药物预处理细胞1小时，在低氧培养过程中维持处理。[0034]免疫染色。在实施方案中，用4%(v/v)多聚甲醛（优选地，EMS，Hatfield,USA)在室温固定细胞15-20分钟。在用1%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)溶液（优选，Sigma-Aldrich)封闭30分钟后，用抗人单克隆抗体PPARY和CD34对细胞染色lh。在每一个免疫荧光实验中，使用同种型匹配的IgG对照。利用抗小鼠IgGCy3缀合物（优选地，Sigma-Aldrich)检测一抗对特定细胞的结合。利用4'，6_二脒基-2-苯基吲哚（优选地，DAPI;Sigma-Aldrich)对细胞的核进行染色。在间接标记后，优选用Zeiss突光显微镜检查细胞。[0035]流式细胞术。在实施方案中，在FACSCalibur细胞计数器（优选地，BectonDickinson)上进行祖细胞和干细胞分型的多色分析。用APC或太平洋蓝抗人⑶45(优选地，e-Bioscience)、FITC抗小鼠CD45(优选地，-Bioscience)、PeCy7抗人CD33(优选地，BDBioscience)、PE抗人CDllb(优选地，BDBioscience)、FITC抗人CD19(优选地，BDBioscience)、PeCy7抗人CD3(优选地，BDBioscience)、PE抗人GlycophorinA(优选地，BDBioscience)、FITC抗人CD41(优选地，e-bioscience)和PeCy7抗人CD56(优选地，BDBioscience)对细胞染色lh，用染色培养基进行洗涤，随后进行分析。[0036]血纤蛋白凝胶的制备。在实施方案中，通过在凝血酶存在的情况下交联血纤蛋白原（两者都来自Sigma-Aldrich)形成血纤蛋白凝胶。通过将人血纤蛋白原溶解于Tris缓冲盐溶液（TBS)(优选地，Sigma-Aldrich)，pH7.4(20mg/mL)中，随后通过经过0.22μm注射器式滤器（Acrodisc，Pall，NY，USA)的过滤进行灭菌来制备血纤蛋白原溶液。通过将人凝血酶以50U/mL的浓度溶解于pH7.4的TBS来制备新鲜凝血酶溶液。通过将3种不同的组分：血纤蛋白原（10mg/mL)、CaCl2(优选地，Merck,NJ，USA)(2.5μM)和凝血酶（0·2U/mL)混合来制备血纤蛋白凝胶（200μL，除非另有所述）。使该溶液在37°C和100%相对湿度胶化。[0037]血纤蛋白凝胶的降解。在实施方案中，通过将AlexaFluor?488人血纤蛋白原缀合物（优选地，Invitrogen)(0.156mg)与未标记血纤蛋白原（9.844mg)在lmL的TBS中混合来制备凝胶前体溶液。通过它们的荧光的减少来间接评估随时间过去具有或不具有细胞的血纤蛋白凝胶的降解速率。在〇时间点和期望的时间点上立即测量它们的荧光。通过在37°C利用200μL的TBS中的人纤溶酶（优选地，Sigma-Aldrich)(0·006U/凝胶）溶液温育过夜来诱导凝胶的完全降解。离心后，在SPECTRAmaxGeminiEM荧光微量板读数器（优选地,MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA,www.moleculardevices.com)中于520nm测量上清液级分的荧光。[0038]细胞因子分泌分析。在实施方案中，按照制造商的说明书，在Bio-Plex200系统(Bio-Rad,www.bio-rad.com)中，使用Bio-PlexProHumanCytokine17-PlexPanel测定（优选地，Bio-Rad,Hercules,CA，USA)评价细胞培养上清液的细胞因子的存在和浓度。人组I17-PlexPanel由下列分析物组成：白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8;IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白（单核细胞趋化活化因子[MCP-l(MCAF)]、巨噬细胞炎症蛋白-β(MIP-Ιβ)和肿瘤坏死因子-a(TNF-α)。收集上清液培养基样品，离心以除去沉淀，随后冷冻。使用〇.2至3,200pg/mL的标准范围。将样品和对照以一式三份运行，将标准和空白对照以一式两份运行。[0039]定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR)分析。在实施方案中，按照制造商的说明书，使用RNeasyMini试剂盒（优选地，Qiagen,Valencia,USA)提取细胞的总RNA。首先离心细胞，将其在Trizol中勻化。在所有情况下，使用Taqman逆转录试剂（优选地，AppliedBiosystems,FosterCity,USA)从1μg总RNA制备cDNA。使用PowerSYBRGreenPCRMasterMix(优选地，AppliedBiosystems)进行定量PCR(qPCR)，在7500FastReal-TimePCR系统（优选地，AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com)中进行检测。相对于参照（人或小鼠，取决于分析的细胞类型）GAPDH基因进行靶基因的定量：相对表达=2[_(Ct样品-CtGADPH)]。从4个独立反应计算平均最小循环阈值（Ct)。将引物序列公布为支持信息（表S1)。[0040]心肌梗塞动物模型。在实施方案中，用氯胺酮（75mg/kg，IP)和右美托咪啶(0.375mg/kg，IP)麻醉裸大鼠。提供利用平衡氧中2-3%的异氟醚的麻醉。用聚维酮碘擦洗腹部和前胸，随后用70%乙醇擦拭（进行数轮聚维酮碘擦洗、随后进行乙醇漂洗和施用聚维酮碘溶液的循环）。通过在动物的背部轻轻地在软毛巾上展开下的横向剖腹术（隔肌切口）或侧向地通过肋间隙4-5抵达心脏。利用高压灭菌器对仪器进行消毒。产生小的隔肌切口以产生心包开窗。利用11-0解剖刀在心包中产生5_切口。通过在动脉起端下2-3mm用6-OProline缝线永久性结扎冠状动脉左前降支来诱发心肌梗塞。左心室的苍白和局部室壁运动异常确认阻塞。让心包打开，或取出心包以避免填塞。在缝合胸膜腔后，利用18-规格的消毒针和3-ml注射器抽空胸膜腔。用Vicryl4-0缝合腹壁和皮下组织，随后用Vicryl4-0进行表皮下缝合。给动物拔管，随后让其恢复。在手术过程中维持每一只动物，让其在温暖的垫子下恢复直至苏醒和能够走动。在从该过程恢复后2天，动物在氯胺酮/咪达唑仑麻醉下经历超声心动图评估。将满足超声心动图纳入标准（低于50%的缩短分数）的动物分层至4组之一。随后将大鼠经历第二胸廓切开术，随后使用汉密尔顿氏注射器（优选地HamiltonCompany)和30-规格的针直接注射100μL治疗剂。在第二天中，通过超声心动描记术监控动物。在植入后2周，再次通过超声心动描记术分析存活的大鼠。在第3周，通过无痛致死术处死动物。收集心脏和各种器官，将其在甲基Carnoy溶液中固定，处理，以进行组织学分析。[0041]LPA在低氧和去血清条件下诱导⑶34+细胞存活[0042]在优选实施方案中，为了鉴定在低氧和去血清条件下促进CD34+细胞存活的分子，我们开发了使用悬浮于X;ivo培养基（用于临床试验（Schachinger,V.，等人,Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed,2006.355(12):p.1210-21))中并在0.5%02,37°C下于低氧室中温育24h的人脐带血来源的⑶34+细胞（2X105个细胞/96孔板的孔）的测定。一些选择的药物已被FDA批准用于治疗心血管疾病（例如NebivololLombardo，R.M.，等人,Effectsofnebivololversuscarvedilolonleftventricularfunctioninpatientswithchronicheartfailureandreducedleftventricularsystolicfunction.AmJCardiovascDrugs,2006.6(4):p.259-63；IbersatanMassie,B.M.,等人，Irbesartaninpatientswithheartfailureandpreservedejectionfraction.NEnglJMed,2008.359(23):p.2456-67)，其它选择的药物正就改善具有心力衰竭的患者/模型的心脏功能在临床前/临床测定中接受评价（例如IN01001(Szabo，G.，等A,IN0-1001anovelpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitorimprovescardiacandpulmonaryfunctionaftercrystalloidcardioplegiaandextracorporalcirculation.Shock,2004.21(5):p.426-32);红细胞生成素（Belonje,A.M·,等A,Effectsoferythropoietinafteranacutemyocardialinfarction:rationaleandstudydesignofaprospective,randomized,clinicaltrial(HEBEIII)〇AmHeartJ,2008.155(5):p.817-22);裡黑激素（Chen,Z·,等人，Protectiveeffectofmelatoninonmyocardialinfarction.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2003.284(5):p.H1618-24);VX_702(Ma，X.L·，等人，Inhibitionofp38mitogen_activatedproteinkinasedecreasescardiomyocyteapoptosisandimprovescardiacfunctionaftermyocardialischemiaandreperfusion.Circulation,1999.99(13):p.1685-91)),其它选择的药物是在人体中发现的天然物质（LPA)。使用膜联蛋白V/普罗匹定碘化物（PI)染色，通过流式细胞术评价细胞活力。膜联蛋白V是具有针对磷脂酰丝氨酸的特异性的磷脂结合蛋白，其为至细胞凋亡状态的细胞转变的最早标志物之一。该磷脂被从质膜的内叶转移至外叶（Koopman，G·，等人，AnnexinVforflowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononBcellsundergoingapoptosis.Blood，1994.84(5):p.1415-20.)。PI进入坏死细胞并结合双链核酸，但被从具有正常完整性的细胞排除[20]。根据图1，未处理的⑶34+细胞显示极差的存活，仅?31%的存活细胞，?31%的凋亡细胞（膜联蛋白V+/PI-)，大部分细胞?39%处于坏死阶段（PI+)。在10种测试的药物中，LPA、前列腺素E2(PGE2)和红细胞生成素显著（P〈0.001)增加细胞存活。LPA(10μM)是具有最高促存活作用的（?69%的活细胞）的药物，从而对其进行进一步研究（图1和2Α)。令人惊讶地，LPA通过逆转（特别地在低氧和去血清条件下）⑶34+细胞的坏死和凋亡增加细胞存活。[0043]LPA的促存活作用是浓度依赖性的（从1至100μΜ)，在1μΜ的LPA上⑶34+细胞的存活相较于对照（未处理的细胞）已经在统计上是显著的（Ρ〈〇·001，η=6)(图2Β)。重要地，在利用1μMLPA处理并且在低氧条件下培养的⑶34+中活细胞的百分比与在常氧条件下培养的未处理的细胞相似。LPA的促存活作用按低氧时间的函数减小（图2C)。在LPA处理的⑶34+细胞中活细胞的百分比从第1天的78%下降至第3天的40%。综上所述，获得的结果令人惊讶地表明LPA是CD34+细胞的促存活分子并且其作用是时间和浓度依赖性的。[0044]LPA诱导细胞增殖而无需早期多能祖细胞的扩增[0045]LPA对于静止细胞是高度促有丝分裂的[21]。LPA的促有丝分裂作用牵涉百日咳毒素不敏感性G蛋白的激活和随后的Ca2+动员以及蛋白激酶C的刺激，花生四烯酸以GTP依赖性方式的释放，和介导腺苷酸环化酶的抑制的百日咳毒素敏感性Gi蛋白的激活（vanCorven，E.J·，等人，Lysophosphatidate-inducedcellproliferation:identificationanddissectionofsignalingpathwaysmediatedbyGproteins.Cell,1989.59(1):p.45-54)。为了确定LPA是否可诱导CD34+细胞的增殖，将未处理的或LPA处理的细胞的悬浮液（2X105个细胞于200μL的X-vivo培养基中）暴露于低氧24h，随后在常氧条件下培养另外6天。LPA处理的细胞在7天的时间中使其数目增加约3倍，然而未处理的细胞减少至它们初始数目的一半（图3A)。[0046]为了检查LPA在⑶34+细胞自我更新/分化中的作用，将未处理的和LPA处理的CD34+细胞在低氧条件下于X-vivo培养基中培养1天，随后于常氧中培养6天或不进行所述常氧培养，最后通过FACS进行表征。在1天的低氧后，未处理的或LPA处理的⑶34+细胞都开始分化成肥大细胞（14至17%)和嗜中性粒细胞（5至8%)(图3B)。仅78%和72%的未处理的或LPA处理的⑶34+细胞表达⑶34标志物。⑶34表达在已暴露于低氧的细胞中比常氧条件中的细胞更高，因为仅6%的在常氧条件下培养24h的细胞表达CD34标志物。在低氧中培养1天，随后在常氧中培养6天的细胞进一步分化成数个细胞谱系，包括树突细胞（DC)、嗜碱性粒细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。对于未处理的和LPA处理的细胞观察到相似的分化特征谱。[0047]LPA在于血纤蛋白凝胶中封装的且在低氧和去血清条件下培养的细胞中诱导⑶34+细胞存活[0048]可注射支架是非常有前景的递送干细胞以用于再生医学的媒介物，因为它们为细胞存活和增殖提供了有利的结构支持（Pedroso,D.C.，等人，Improvedsurvival，vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne,2011.6(1):p.el6114；Kraehenbuehl,T.P.,R.Langer和LS.Ferreira，Three-dimensionalbiomaterialsforthestudyofhumanpluripotentstemcells.NatMethods，2011.8(9):p.731-6;Nakamuta，J.S·，等人，Celltherapyattenuatescardiacdysfunctionpostmyocardialinfarction:effectoftiming,routesofinjectionandafibrinscaffold.PLoSOne,2009.4(6):p.e6005.)。几个研究已显示通过支架移植入心脏装置的细胞增加细胞存活，诱导血管生成以及在梗塞后保护心脏功能（Nakamuta，J.S.，等人，Celltherapyattenuatescardiacdysfunctionpostmyocardialinfarction:effectoftiming,routesofinjectionandafibrinscaffold.PLoS0ne，2009.4(6):p.e6005;Christman，K.L·，等人，Fibringluealoneandskeletalmyoblastsinafibrinscaffoldpreservecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.TissueEng,2004.10(3-4):p.403-9；Kraehenbuehl,T.P.，等人，Humanembryonicstemcell-derivedmicrovasculargraftsforcardiactissuepreservationaftermyocardialinfarction.Biomaterials,2011.32(4):p.1102-9;Kutschka，I.，等人，Collagenmatricesenhancesurvivaloftransplantedcardiomyoblastsandcontributetofunctionalimprovementofischemicrathearts.Circulation，2006.114(lSuppl):ρ·1167-73)。最近，我们显示CD34+细胞对血纤蛋白凝胶相较于对聚苯乙烯皿、胶原和纤连蛋白具有更大的初始附着力（Pedroso,D.C.，等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsc〇-culturedwithendothelialcells.PLoSOne，201L6(1):p.el6114)〇此外，显示了血纤蛋白凝胶支持CD34+细胞存活至少10天，并且凝胶抗金属蛋白酶的降角军(Pedroso,D.C.,等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne，2011.6(1):p.el6114)。在优选实施方案中，为了检查血纤蛋白凝胶是否支持⑶34+细胞在低氧和去血清条件下的存活，将未处理的或LPA处理的细胞（2X105个）封装在血纤蛋白凝胶（200μL)中，并在0.5%02,37°C于低氧室中温育1和3天。使用膜联蛋白V/普罗匹定碘化物（PI)染色，通过流式细胞术评价细胞活力。未处理的CD34+细胞在血纤蛋白凝胶具有差的存活（23.2±2.8%的活细胞，η=3,第1天；12.6±1.2%的活细胞，η=5，第3天），这显示了单独的基质不具有任何促存活作用（图4)。相反地，封装于血纤蛋白凝胶中的LPA处理的CD34+细胞显示可与在未封装于血纤蛋白凝胶中的LPA处理的细胞中观察到的值相当的高存活（第1天：69.0±0.7%对76.7±1.5%，分别地对于封装的和未封装的；第3天：51.1±0.8%对37.2±6.6%，分别地对于封装的和未封装的）。[0049]LPA主要通过过氧化物酶体增殖物激活物受体（PPAR)诱导⑶34+细胞存活[0050]LPA的生物作用是多样的，包括发育、生理和病理生理作用（Lin，Μ.E.，D.R.Heir和J.Chun，Lysophosphatidicacid(LPA)receptors:signalingpropertiesanddiseaserelevance.ProstaglandinsOtherLipidMediat，2010.91(3-4):p.130-8)。迄今为止已鉴定了达到5种LPA受体（LPAR):LPA1_LPA5(Choi，J.W.，等人，LPAreceptors:subtypesandbiologicalactions.AnnuRevPharmacolToxicol，2010.50:p.157-86)〇受体为G蛋白偶联受体（GPCR)并且可在多个组织中发现它们的存在。LPA1、LPA2和LPA3广泛地在大多数组织中表达（Ishii,I.，等人，Functionalcomparisonsofthelysophosphatidicacidreceptors,LP(Al)/VZG-l/EDG-2,LP(A2)/EDG-4,andLP(A3)/EDG-7inneuronalcelllinesusingaretrovirusexpressionsystem.MolPharmacol,2000.58(5):p.895-902)。LP4在特定器官例如胰腺、卵巢和胸腺中表达（Lee,C.W.,等人，LPA(4)/GPR23isalysophosphatidicacid(LPA)receptorutilizingG(s)-,G(q)/G(i)-mediatedcalciumsignalingandG(12/13)-mediatedRhoactivation.JBiolChem,2007·282(7):ρ·4310-7)。LPA5以低水平在多个组织中表达（Lee,C.W·，等人，GPR92asanewG12/13_andGq-coupledlysophosphatidicacidreceptorthatincreasescAMP,LPA5.JBiolChem,2006.281(33):p.23589-97)〇为了鉴定介导LPA(100μM)的促存活作用的受体，使用LPA1-和LPA3-特异性拮抗剂Kil6425(10μM)和过氧化物酶体增殖物激活物受体γ(PPARγ)的拮抗剂GW9662(50μM)。研究表明LPA对后一种受体具有高亲和力（McIntyre,Τ·Μ.，等人，Identificationofanintracellularreceptorforlysophosphatidicacid(LPA):LPAisatranscellularPPARgammaagonist.ProcNatlAcadSciUSA,2003.100(1):p.131-6；Gustin,C.,M.VanSteenbrugge和M.Raes,LPAmodulatesmonocytemigrationdirectlyandviaLPA-stimulatedendothelialcells.AmJPhysiolCellPhysiol,2008.295(4):p.C905-14)。该方法通过使用Υ-2762(50μΜ)和Η)98059(60μΜ)拮抗剂分别抑制受体的下游靶包括Rho激酶和分裂原活化蛋白激酶（ΜΑΡΚ)来补充。已知所有LPAR偶联G蛋白并激活其，这进而激活MAPK(LPA1、LPA2、LPA3和LPA4)和Rho激酶（LPA1、LPA2、LPA4和LPA5)(Choi,J.W.,等人，LPAreceptors:subtypesandbiologicalactions.AnnuRevPharmacolToxicol,2010.50:p.157-86)。将细胞在包含特定拮抗剂的X-Vivo培养基中处理lh，随后在低氧条件下培养24h。在膜联蛋白V/PI染色后，通过FACS分析评估细胞存活。结果表明在测试条件下，PPARY主要介导LPA的促存活作用（图5B)。PPARY的拮抗剂显著减少（P〈〇.〇〇1，η=11)LPA诱导的活细胞的数目，从?77%降至?53%;然而，其没有完全阻断LPA的促存活作用，因为无LPA的细胞具有39%的存活率（Ρ〈0.01)。Kil6425对LPA1和LPA3的抑制在CD34+细胞的存活中具有相对小的作用（图5B)。活细胞的数目从77%(+LPA)降至67%(P〈0.01，n=19)。重要地，MAPK信号转导途径的抑制以比Rho激酶信号转导途径的抑制更高的水平抑制LPA的促存活作用。因为两个信号转导途径是不同LPAR的下游靶（参见上文），这可能表明LPAR在⑶34+细胞的存活中的不同贡献。综上所述，数据显示LPA能够主要通过PPARY的激活在低氧和去血清条件下促进⑶34+细胞存活。[0051]LPA调节⑶34+细胞的细胞因子释放[0052]为了测定LPA在CD34+细胞释放信号转导细胞因子和生长因子中的作用，使用细胞因子珠粒阵列。将细胞在LPA(100μM)存在或不存在的情况下，在常氧或低氧条件下于无血清培养基X-Vivo中温育24h。常氧中未处理的⑶34+细胞表达高水平（>100pg/mL)的IL-8和MIP-lb，中等水平（100至lpg/mL)的IL-6、TNF-α和GM-CSF，以及低水平（〈lpg/mL)的IL-1β、IL-4和IL-17(图5C)。低氧和去血清条件下培养的CD34+细胞比在常氧条件下表达显著更高的水平的IL-1β(?8倍）、IL-4(?2倍）、IL-6(?1.2倍）、IL-8(?10倍）、IL-17(?4倍）和GM-CSF(?2倍）。有趣地，在低氧和去血清条件下但在LPA存在的情况下培养的CD34+细胞相较于在相同条件下但在LPA不存在的情况下培养的细胞增加IL-4(从?0·9至?2.7pg/mL)、IL-8(从?10,000至?17,OOOpg/mL)和TNF-α(从?3至?15pg/mL)的分泌，和减少IL-1β(从?9至?2pg/mL)、IL-6(从?4至?2pg/mL)和GM-CSF(从?4至?lpg/mL)的分泌。[0053]LPA处理的⑶34+细胞在心肌梗塞后保护心脏功能[0054]已显示梗塞后人⑶34+细胞在心脏中的移植改善了左心室射血分数并且保护心脏组织。为了评价LPA处理的⑶34+细胞的治疗潜能，将利用LPA(100μM)处理的细胞(1Χ106个细胞）于血纤蛋白凝胶前体溶液（ιοομυ中递送至裸大鼠的梗塞的心脏。通过冠状动脉左前降支（LAD)的永久性结扎诱发心肌梗塞。将无任何处理的（假处理组）或利用悬浮于血纤蛋白凝胶前体溶液中的⑶34+细胞处理的梗塞的心脏用作对照。植入后2周，通过超声心动描记术评价心脏的功能性质。对照大鼠的左心室在第1天和第2周分别具有42.7±1.6(η=10)和41.6±3.8(η=10)的平均缩短分数；利用封装在血纤蛋白凝胶前体溶液中的CD34+细胞处理的大鼠在第1天和第2周分别具有36.7±3.4(η=6)和44.5±3.0(η=6)的平均缩短分数；最后利用LPA处理的并且封装在血纤蛋白凝胶前体溶液中的⑶34+细胞处理的大鼠在第1天和第2周分别具有37.5±1.2(η=6)和47.0±2.0(η=6)的平均缩短分数（图6Α)。因为初始缩短分数在实验组间是不同的，因此使用第2周和第1天的缩短分数之差来比较处理的治疗功效（图6Β)。在LPA处理的细胞+凝胶组和假处理组中缩短分数的差异的中位数分别为7.5和2.6,差异在统计上是显著的（Ρ〈0.05)。在利用⑶34+细胞与假处理处理的心脏之间未观察到统计差异（Ρ>0.05)。综上所述，LPA处理的⑶34+细胞至梗塞的心脏内的递送改善了心脏缩短分数，并且作用优于未处理的⑶34+细胞。[0055]本发明当然绝不以任何方式限定于上述实施方案，本领域普通技术人员将预见其修饰的许多可能性而不背离所附权利要求中定义的本发明的基本概念。[0056]下列权利要求显示了本发明的特定实施方案。【权利要求】1.一种通过在包含溶血磷脂酸的培养基中培养造血干细胞来增强造血干细胞在低氧和去血清条件下的存活的方法。2.权利要求1的方法，其中所述造血干细胞为⑶34+细胞。3.权利要求2的方法，所述造血干细胞为从脐带血或外周血分离的⑶34+。4.前述权利要求的方法，其中所述溶血磷脂酸的浓度在1至1000μΜ之间变化。5.前述权利要求的方法，其中所述溶血磷脂酸的浓度为100μΜ。6.-种包含造血干细胞和溶血磷脂酸的组合物。7.权利要求6的组合物，其中所述造血干细胞为⑶34+细胞。8.权利要求7的组合物，其中所述造血干细胞为从脐带血或外周血分离的⑶34+。9.权利要求6-8的任一项的组合物，其中所述溶血磷脂酸的浓度在1至1000μΜ之间变化。10.权利要求9的组合物，其中所述溶血磷脂酸的浓度为100μΜ。11.权利要求6-10的任一项的组合物，其还包含凝胶，特别是仿生凝胶。12.权利要求6-11的任一项的组合物，其包含IX105-1Χ106个⑶34+细胞，和1-100μΜ的溶血磷脂酸，以及100-200mL的仿生凝胶。13.权利要求6-12的任一项的组合物，其中所述凝胶为下列物质的至少一种：血纤蛋白、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、胶原或PEG衍生物。14.权利要求6-13的任一项的组合物，其中所述凝胶为血纤蛋白。15.权利要求6-14的任一项中描述的组合物，其中所述组合物为药物组合物、医药组合物或化妆品组合物。16.权利要求6-14的任一项的组合物，其中先前的组分以治疗有效量存在。17.权利要求6-16的任一项中描述的组合物，其用于药剂或化妆品。18.权利要求17的组合物，其用于细胞疗法，即用于心脏组织。19.权利要求17的组合物，其用于治疗心脏病。20.权利要求17的组合物，其用于治疗伤口愈合。21.权利要求17的组合物，其用于治疗糖尿病伤口愈合。22.前述权利要求的任一项的组合物，其还包含足够量的赋形剂。23.前述权利要求的任一项的组合物，其中所述组合物是可注射制剂。【文档编号】A61P17/02GK104254602SQ201380021644【公开日】2014年12月31日申请日期:2013年4月24日优先权日:2012年4月24日【发明者】L·达席尔瓦费雷拉,I·M·费达尔戈多斯桑托斯席尔瓦卡瓦尔霍申请人:克瑞奥埃斯塔麦诺健康与技术股份有限公司