寡核苷酸螯合物方法

寡核苷酸螯合物方法
【专利摘要】本发明描述了药物组合物和用寡核苷酸螯合物治疗病毒感染、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、阿尔茨海默病、朊病毒病和杜馨氏肌肉营养不良症的方法。
【专利说明】寡核苷酸螯合物方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月18日提交的美国临时申请号61/648, 694的优先权，所述 临时申请号的全部内容以引用的方式并入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及牵涉施用或使用寡核苷酸（ON)螯合物的疾病治疗方法。这些疾病可 以包括病毒感染、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease)、 朊病毒病或杜馨氏肌肉营养不良症（Duchene' s muscular dystrophy)。

【背景技术】
[0004] ON螯合物是分子间通过二价或多价金属阳离子连接的两个或两个以上ON。ON螯 合物中和ON的可能造成这些化合物的施用相关副作用的固有螯合性质。施用ON螯合物 是对受试者施用ON的新方法，其中减轻了与非螯合ON(它们是以本领域常用的钠盐形式 施用的0N)有关的施用相关副作用。这些副作用可能包括伴随静脉内输注的发抖、发热 和寒战或伴随皮下施用的注射部位硬化、炎症和疼痛。此外，通过将ON制备为螯合络合 物，可以改善它们的药动学特性，与国际申请公布号WO 2012/0 2198 5和美国申请公布号 2012/0046348(所述公布号以全文引用方式并入本文）中描述的非螯合ON相比用相似的剂 量可提供更1?的治疗性能。
[0005] 因此希望提供通过序列相关或序列无关的机制起作用的ON螯合物，它将对包括 病毒感染、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、阿尔茨海默病或朊病毒病在内的许多疾病病况 有治疗作用并且引起对ON来说常见的施用相关副作用减少或消除。
[0006] 因此，本领域需要提供一种用于治疗上述疾病病况的方法，这种方法包括对需要 治疗的受试者施用包含ON螯合物的药物组合物。


【发明内容】

[0007] 概述
[0008] 根据本说明书，现在提供一种通过施用呈螯合物形式的寡核苷酸来治疗可以通过 用寡核苷酸治疗进行影响的任何疾病病况的方法。
[0009] 根据本说明书，现在提供配制为螯合物的寡核苷酸用于治疗可以通过用所述寡核 苷酸治疗进行影响的任何疾病病况的用途。
[0010] 根据本说明书，现在提供配制为螯合物的寡核苷酸在制造用于治疗可以通过用所 述寡核苷酸治疗进行影响的任何疾病病况的药剂中的用途。
[0011] 提供一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗病毒ON 螯合物的步骤。
[0012] 提供抗病毒ON螯合物用于治疗病毒感染的用途。
[0013] 提供抗病毒ON螯合物在制造用于治疗病毒感染的药剂中的用途。
[0014] 在一个实施方案中，所述抗病毒寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO: 1-6或10-18的寡核苷酸。
[0015] 提供一种治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗胆 固醇ON螯合物的步骤。
[0016] 在一个实施方案中，所述抗胆固醇寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID N0:l、2、3、5、6、10、ll、12、15、16 或 17 的寡核苷酸。
[0017] 提供一种治疗高甘油三酯血症的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗 甘油三酯ON螯合物的步骤。
[0018] 在一个实施方案中，抗胆固醇寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO: 1、2、 3、5、6、10、11、12、15、16 或 17 的寡核苷酸。
[0019] 提供一种治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗阿 尔茨海默ON螯合物的步骤。
[0020] 提供一种治疗朊病毒病的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗朊病毒 ON螯合物的步骤。
[0021] 提供一种治疗由mRNA成熟期间不正确剪接引起的疾病的方法，所述疾病包括杜 馨氏肌肉营养不良症（DMD)，所述方法包括施用设计成纠正DMD中的不正确剪接的ON螯合 物的步骤。
[0022] 提供抗病毒ON螯合物用于治疗病毒感染的用途。
[0023] 提供抗病毒ON螯合物在制造用于治疗病毒的药剂中的用途。在一个实施方案中， 所述抗病毒寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO: 1-6或10-18的寡核苷酸。
[0024] 提供抗胆固醇ON螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
[0025] 提供抗胆固醇ON螯合物在制造用于治疗高胆固醇血症的药剂中的用途。
[0026] 在一个实施方案中，所述抗胆固醇寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID N0:l、2、3、5、6、10、ll、12、15、16 或 17 的寡核苷酸。
[0027] 提供抗甘油三酯ON螯合物用于治疗高甘油三酯血症的用途。
[0028] 提供抗甘油三酯ON螯合物在制造用于治疗高甘油三酯血症的药剂中的用途。
[0029] 在一个实施方案中，所述抗甘油三酯寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID N0:l、2、3、5、6、10、ll、12、15、16 或 17 的寡核苷酸。
[0030] 提供抗阿尔茨海默ON螯合物用于治疗阿尔茨海默病的用途。
[0031] 提供抗阿尔茨海默ON螯合物在制造用于治疗阿尔茨海默病的药剂中的用途。
[0032] 提供抗朊病毒ON螯合物用于治疗朊病毒病的用途。
[0033] 提供抗朊病毒ON螯合物在制造用于治疗朊病毒病的药剂中的用途。
[0034] 提供设计成纠正DMD中的不正确剪接的ON螯合物用于治疗由mRNA成熟期间的不 正确剪接引起的疾病的用途，所述疾病包括杜馨氏肌肉营养不良症（DMD)。
[0035] 提供设计成纠正DMD中的不正确剪接的ON螯合物在制造用于治疗由mRNA成熟期 间的不正确剪接引起的疾病的药剂中的用途，所述疾病包括杜馨氏肌肉营养不良症（DMD)。
[0036] 提供一种用于治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID N0:20的 寡核苷酸螯合物。
[0037] 提供包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
[0038] 提供包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸螯合物在制造用于治疗高胆固醇血症的药剂 中的用途。
[0039] 提供一种用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO: 19的寡核苷酸螯合物。
[0040] 提供包含SEQ ID NO: 19的寡核苷酸螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的用 途。
[0041] 提供包含SEQ ID NO: 19的寡核苷酸螯合物在制造用于治疗杜馨氏肌肉营养不良 症的药剂中的用途。
[0042] 提供一种用于治疗丙型肝炎感染的方法，所述方法包括施用包含SEQID N0:7的寡 核苷酸螯合物。
[0043] 提供包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸螯合物用于治疗丙型肝炎感染的用途。
[0044] 提供包含SEQ ID N0:7的寡核苷酸螯合物在制造用于治疗丙型肝炎感染的药剂中 的用途。
[0045] 提供一种药物制剂，其包含抗病毒寡核苷酸螯合物用于治疗病毒感染。
[0046] 提供一种药物制剂，其包含抗胆固醇寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症。
[0047] 提供一种药物制剂，其包含抗甘油三酯寡核苷酸螯合物用于治疗高甘油三酯血 症。
[0048] 提供一种药物制剂，其包含抗阿尔茨海默寡核苷酸螯合物用于治疗阿尔茨海默 病。
[0049] 提供一种药物制剂，其包含抗朊病毒寡核苷酸螯合物用于治疗朊病毒病。
[0050] 提供一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:20的螯合物用于治疗高胆固醇血症。
[0051] 提供一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO: 19的螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养 不良症。
[0052] 提供一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:7的螯合物用于治疗丙型肝炎感染。
[0053] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用二价金属阳离子制备的。
[0054] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用钙制备的。
[0055] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用镁制备的。
[0056] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用铁（2+)、锰、铜和/或锌制备的。
[0057] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含两种或两种以上不同二价金属阳 离子。
[0058] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含钙和镁。
[0059] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个双链寡核苷酸。
[0060] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个硫代磷酸 酯键的寡核苷酸。
[0061] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化的寡 核苷酸。
[0062] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有一个2'修饰的核糖 的寡核苷酸。
[0063] 在再一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个每个核糖都被2' 0-甲 基化的寡核苷酸。
[0064] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个5'甲基 胞嘧啶的寡核苷酸。
[0065] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个其中每个胞嘧啶都是5' 甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
[0066] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物含有至少一个完全硫代磷酸酯化的寡 核苷酸并且所有核糖具有2' 0甲基修饰并且所有胞嘧啶以5'甲基胞嘧啶形式存在。
[0067] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQID NO: 1-6或 10-18的寡核苷酸。
[0068] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于皮下施用。
[0069] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于静脉内输注。
[0070] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于选自由以下方式组成的 组的施用：眼内、口服、肠道、吸入、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静 脉内注射和局部。
[0071] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于通过气雾剂进行施用。
[0072] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒是乙型肝炎病毒。
[0073] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒是嗜肝DNA病毒。
[0074] 在又一个实施方案中，引起感染的病毒是肝炎δ病毒。
[0075] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒是流感病毒。
[0076] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒选自由以下病毒组成的组：逆转录病毒科 的成员、HIV-1、HIV-2、疱疹病毒科的成员、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、痘病毒科的成员、副 粘病毒科的成员、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、布尼亚病毒科的成员、汉坦病毒、丝状病毒 科的成员、埃博拉病毒（Ebola virus)、马尔堡病毒（Marburg virus)、黄病毒科的成员、黄 热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、正粘病毒科的成员、披膜病毒科的成员、 冠状病毒科的成员、弹状病毒科的成员和砂粒病毒科的成员。
[0077] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO: 2 (REP2055)。
[0078] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO: 18 (REP2139)。
[0079] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO: 11 (REP2148)。

【专利附图】

【附图说明】
[0080] 现在参考附图：
[0081] 图1说明ON的共同理化特征。A)通过高效液相色谱法共同分离REP2006和具有 定义序列的21聚体硫代磷酸酯化ON。B)通过质谱法鉴别所述21聚体ON中的物质。C)通 过质谱法鉴别所述REP 20060N中的物质。
[0082] 图2A说明不依赖于ON序列的ON的一般化学特征。与其序列无关，任何ON作为 同时具有疏水和亲水活性的聚合物存在。硫代磷酸酯化（在这个图中的化学结构中描绘） 用来提高ON聚合物的疏水性但是不影响亲水性。图2B示意性表示二价和三价金属阳离子 的ON螯合性质。金属阳离子（由实心圈表示）通过磷酸二酯键中的两个或三个非桥接氧 或硫原子之间的金属离子桥（由省略号表示）分子间连接ON聚合物的亲水性表面。
[0083] 图3说明在不同ON和二价金属阳离子浓度下存在二价或多价金属阳离子时的ON 的溶液特性模型。A)低二价/三价金属阳离子，低ON浓度产生二聚体或低阶ON螯合物。 B)提高二价/三价金属阳离子浓度在溶液中形成更完全的ON螯合物。C)在二价或三价金 属存在下进一步提高ON浓度能够随着金属浓度提高产生较高阶ON螯合物。由于亲水性表 面仍然暴露于含水环境而维持溶解度，因此（A)至（C)中的所有螯合物均可溶于水溶液。D) 在足够的ON和金属浓度下，所有亲水性表面现将限制在ON螯合物内，仅使疏水表面暴露于 含水环境。这导致ON螯合物的沉淀。
[0084] 图4说明荧光-ON螯合物的溶液特性对荧光偏振的影响。随着金属浓度提高，ON 螯合物形成的大小（和质量）也增加（参见图3)并且因此在溶液中翻滚更缓慢。络合物 在溶液中的这种较慢的翻滚导致荧光偏振升高和mP值升高。

【具体实施方式】
[0085] 如国际申请公布号WO 2012/021985和美国申请公布号2012/0046348所述（所述 公布号的内容以全文引用方式并入本文），ON在含有任何二价简单金属阳离子（例如但不 限于，Ca 2+、Mg2+和Fe2+)的水溶液中都不以盐的形式存在，而是以ON的螯合络合物形式存 在。这些络合物由ON二聚体或较高阶分子组织组成，其中ON是通过二价金属离子桥连接 于它们的磷酸二酯骨架（参见图2B)。在特定的ON和金属阳离子浓度下，这些螯合络合物 是稳定并且可溶于水溶液中，并且使ON螯合物中的任何二价阳离子有效地隔离溶液相互 作用。这种螯合物形成也可能在带有3+电荷或更高电荷的简单金属阳离子情况下发生（如 图2B中描绘的）。因此ON起多价金属阳离子螯合剂（chelaters)的作用并且不与多价金 属阳离子形成盐。
[0086] ON螯合物可以含有各种多价金属阳离子，包括钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、 汞和铅。进一步显示这些多价金属阳离子的螯合导致形成由两个或两个以上通过金属阳离 子连接的ON构成的ON螯合物并且在长度大于6个核苷酸的ON的情况下和在具有磷酸二 酯或硫代磷酸酯键的存在下发生。ON可以任选每个键都被硫代磷酸酯化。螯合也在于核 糖上含有2'修饰（如2' 0甲基）或含有诸如5'甲基胞嘧啶或4-硫代尿嘧啶等修饰碱基 的ON的情况下发生。这些2'修饰可以存在于一个或多个或所有核糖上并且修饰的碱基可 以存在于一个或多个碱基上或普遍存在于每个碱基上（即所有胞嘧啶都以5'甲基胞嘧啶 的形式存在）。此外，ON螯合物可以包含含有多个修饰如每个键都被硫代磷酸酯化、每个核 糖都被2'修饰和每个碱基都被修饰的0N。下文进一步定义与ON螯合物形成相容的ON修 饰。此外，金属阳离子的螯合与存在的核苷酸序列无关，而是依赖于所有ON共同的理化特 征（参见图2A)。
[0087] 虽然ON螯合物的形成可以用任何二价金属阳离子实现，但是意图用作药物的ON 螯合物应该优选仅含有钙和或镁，但是也可以含有痕量的铁、锰、铜或锌，并且不应该包括 钴、钡、镍、镉、汞、铅或任何这里未列出的其他二价金属。
[0088] 重要的是，ON螯合物的形成不发生在诸如Na+、K+或NH4+等单价阳离子上并且因此 不可能发生在任何单价阳离子上。因此，术语"0N盐"更准确地仅限于ON与单价阳离子或 与不与ON形成螯合物的阳离子的盐。
[0089] 至少一部分已知的ON与血液中蛋白质组分的瞬时相互作用可能是由ON与诸如白 蛋白等金属结合蛋白和钙依赖性凝血级联的蛋白质的相互作用介导的。因此以螯合络合物 形式施用ON(这显著降低或消除它们与二价金属结合蛋白相互作用的倾向）可以减少这些 蛋白质在血液中的相互作用并且使伴随ON施用的副作用（如瞬时抗凝血）较少并且与非 螯合ON相比还可能提高到达靶器官（例如肝脏、肺或脾脏）的ON剂量分数。在本公开之 前，这种蛋白质相互作用减少对治疗活性的影响是未知的并且从未描述过。
[0090] 荧光偏振是用于研究分子间相互作用的常见方法。在这种技术中，用荧光标记物 (例如FITC)标记待测物（即任何0N)。在溶液中，待测物分子由于布朗运动而在溶液中自 由翻滚，这使得用恰当波长的光激发待测物时偏振荧光发射很弱。使用足够分子量的配体 (至少和待测物一样大小），待测物和配体之间的相互作用带来对所述络合物在溶液中翻 滚的实质性抑制。由于抑制了溶液中的这种翻滚，因此在激发时荧光发射被显著偏振。因此 使用这种技术，可以在溶液中测量相互作用而对任何一个结合配偶体都没有物理限制。荧 光偏振报告为无量纲的mP，它与反应中的结合型待测物分子的分数成正比。例如，如果非常 小的比例的待测物分子被特定配体结合，那么荧光偏振将会极少并且因此mP值也小。另一 个极端，如果大部分待测物分子被特定配体结合（或用较高浓度的配体），将有相当大的荧 光偏振并且因此mP值也大。用这种方式，可以通过在固定量的荧光标记待测物的存在下改 变配体浓度来产生特定待测物-配体相互作用的结合等势线。
[0091] 本文中使用不同的荧光标记ON来研究它们在多价金属阳离子存在下的络合物形 成。虽然通过荧光偏振监测络合物形成需要这些ON被荧光标记，但是这种标记固定在ON 的3'端上，以便不干扰所讨论的ON的含氮碱基或磷酸二酯骨架。此外，为了进一步排除溶 液中的正常ON行为的任何扰动，荧光标记物通过刚性的3碳接头与ON保持远离。因此本 文中使用荧光偏振用荧光标记ON观察到的任何ON络合物形成都是未标记ON(无论是否形 成络合物）溶液行为的准确表现。
[0092] 本领域中的标准清楚地用ON钠盐教导了对需要治疗的受试者施用ON的做法。这 通过在临床试验中施用众多钠盐形式的ON示范过，它们包括Fomivirisen(ISIS 2922)、 Mipomersen (ISIS 301012)、Trecovirsen (GEM91)、Custirsen (0GX-011/ISIS 112989)、 Genasense (G3139)、Aprinocarsem (ISIS 3531/LY 900003)、PRO-51 (GSK 2402968)和 ALN-RSV01 (Geary 等，2002, Clin. Pharmacokinetics, 41: 255-260 ;Yu 等，2009, Clin. Pharmacokinetics, 48:39-50 ;Sereni 等，1999, J. Clin. Pharmacol.，39:47-54 ;Chi 等， 2005, J. Nat. Cane. Inst.，97:1287-1296 !Marshall 等，2004, Ann. Oncol.，15:1274-1283 ; Grossman 等，2004，Neur〇-0ncol, 6:32-40 ;Goemans 等，2011NEJM 364:1513-1522)。目前 没有公开数据教导使用钙或镁或任何其他二价金属的任何肠胃外施用途径的寡核苷酸制 剂。
[0093] 与钠盐ON的施用有关的许多副作用都可以归因于它们的螯合效应。ON的抗凝血 至少部分是由血清钙被ON螯合从而削弱钙依赖性凝血级联引起的。血清钙的螯合以及它 能够导致的潜在血清低血钙还与通过IV施用来施用ON观察到的副作用一致，所述副作用 包括发热、发抖、虚弱和动脉血压下降（后者伴随快速IV输注或注射）。伴随皮下注射ON 观察到的注射部位反应（硬化、炎症、脆弱和疼痛）至少部分归因于在注射部位的ON对钙 和可能的其他二价阳离子（如镁）或多价阳离子的局部螯合。已显示施用螯合络合物形式 的ON可减轻许多这些副作用（参见WO 2012/021985)。
[0094] 术语寡核苷酸（ON)是指核糖核酸（RNA)和/或脱氧核糖核酸（DNA)的寡聚物或 聚合物。这个术语包括由修饰的核碱基（包括5'甲基胞嘧啶和4'硫代尿嘧啶）、糖和共价 核苷间（骨架）键联构成的ON以及具有功能类似的非天然存在的部分的0N。由于所希望 的特性，例如降低的免疫反应性、增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力以及增加的 在核酸酶的存在下的稳定性，这类修饰或取代的ON可能比天然形式优选。ON也可以是双链 的。
[0095] ON可以包括各种修饰，例如，稳定化修饰，并且因此可以在磷酸二酯键和/或在糖 上和/或在碱基上包括至少一个修饰。例如，ON可以包括（但不限于）一个或多个修饰， 或者被完全修饰以便含有具有所述修饰的所有键或糖或碱基。修饰的键可以包括硫代磷酸 酯键、二硫代磷酸酯键和/或甲基膦酸酯键。虽然修饰的键是有用的，但是ON可以包括磷 酸二酯键。其它有用的修饰包括（但不限于）在糖的2'位的修饰，包括2' -0-烷基修饰， 如2' -0-甲基修饰、2' 0-甲氧基乙基（2' M0E)、2' -氨基修饰、2' -齒代修饰，如2' -氟； 和/或非环核苷酸类似物。其他2'修饰也是本领域已知的并且可以使用，如锁核酸。具体 来讲，ON到处都具有修饰的键或者每个键都被修饰，例如，硫代磷酸酯化；具有3' -和/或 5'_帽子；包括末端3'-5'键；所述ON是或者包括由通过接头连接的两个或两个以上ON组 成的多联体。碱基修饰可以包括胞嘧啶碱基的5'甲基化（5'甲基胞嘧啶或在核苷酸的环境 中，5'甲基胞苷）和/或尿嘧啶碱基的4'硫化（4'硫脲嘧啶或在核苷酸的环境中，4'硫代 尿苷）。当合成条件在化学上相容时，如具有带有硫代磷酸酯键、2'核糖修饰（如2' 0-甲 基化）和修饰碱基（如5'甲基胞嘧啶），可以合并不同化学相容的修饰的键。ON可以用 所有这些不同修饰进一步完全修饰（例如每个键都被硫代磷酸酯化、每个核糖都被2'修饰 以及每个碱基都被修饰）。
[0096] 在本说明书中，术语"抗病毒0N"是指借助于其特定的生化活性（无论是序列相关 或序列无关的）能够直接或间接抑制病毒复制的一些方面或直接或间接增强宿主通过免 疫或其他机制清除感染的能力的任何0N。
[0097] 在本公开中，术语"抗病毒ON螯合物"是指在溶液中分子间通过多价金属阳离子 连接的两个或两个以上抗病毒ON的络合物。所述抗病毒ON螯合物可以包含两个或两个以 上具有不同序列的0N。
[0098] 在本公开中，术语"抗胆固醇ON"是指借助于其特定的生化活性（无论是序列相关 或序列无关的）能够直接或间接降低受试者的异常升高的总血清胆固醇和或低/极低密度 脂蛋白血清水平的任何0N。
[0099] 在本公开中，术语"抗胆固醇ON螯合物"是指分子间通过多价金属阳离子连接的 两个或两个以上抗胆固醇ON的络合物。所述抗胆固醇ON螯合物可以包含两个或两个以上 具有不同序列的0N。
[0100] 在本公开中，术语"抗甘油三酯ON"是指借助于其特定的生化活性（无论是序列相 关或序列无关的）能够直接或间接降低受试者的异常升高的血清甘油三酯水平的任何0N。
[0101] 在本公开中，术语"抗甘油三酯ON螯合物"是指分子间通过多价金属阳离子连接 的两个或两个以上抗甘油三酯ON的络合物。所述抗甘油三酯ON螯合物可以包含两个或两 个以上具有不同序列的0N。
[0102] 在本公开中，术语"抗阿尔茨海默ON"是指借助于其特定的生化活性（无论是序列 相关或序列无关的）具有以下能力的任何ON :
[0103] A.直接或间接终止、延缓或逆转淀粉状蛋白_β在脑内的积累或表达；
[0104] Β.直接或间接终止、延缓或逆转阿尔茨海默斑在脑内的形成或生长；和/或 [0105] C.直接或间接终止、延缓或逆转与阿尔茨海默病发展有关的神经功能障碍。
[0106] 在本说明书中，术语"抗阿尔茨海默ON螯合物"是指分子间通过多价金属阳离子 连接的两个或两个以上抗阿尔茨海默ON的络合物。
[0107] 在本说明书中，术语"抗朊病毒0Ν"是指借助于其特定的生化活性（无论是序列相 关或序列无关的）具有以下能力的任何ON :
[0108] A.直接或间接终止、延缓或逆转朊蛋白在外周或脑内的形成；和/或 [0109] B.直接或间接终止、延缓或逆转与朊病毒病有关的神经功能障碍。
[0110] 在本说明书中，术语"抗朊病毒ON螯合物"是指分子间通过多价金属阳离子连接 的两个或两个以上抗朊病毒ON的络合物。所述抗朊病毒ON螯合物可以包含两个或两个以 上具有不同序列的0N。
[0111] 在本申请中，术语"简并ON"意指在每个位置上都具有摆动碱基（N)的单链0N，如 NNNNNNNNNN。每个碱基都合成为摆动碱基，以使这个ON实际上作为一群具有相同长度和理 化性质的不同随机生成的序列存在。例如，对于长度为40个碱基的简并0N，在所述群中的 任何特定序列理论上仅表示总分数的1/4 4°或8. 3X ΚΓ25。假定1摩尔=6. 022X1023个分 子，1摩尔40聚体ON的质量实际上大约为12-14kg (取决于存在的序列和修饰），任何具有 有效存在的特定序列的ON在任何制剂中不出现多于一次。因此在这种制剂中观察到的任 何螯合物形成或生物活性必定是由于ON的非序列相关（或与所述序列无关）的理化性质， 因为不能期望具有定义序列的任何特定ON(在所述制剂中是独特的）贡献来源于其特定核 苷酸序列的任何活性。
[0112] 作为这个概念的再一个示例，实施例I通过高压液相色谱法和质谱法比较REP 2006(具有简并的完全硫代磷酸酯化的序列的40聚体0N)与具有定义序列（也完全被硫 代磷酸酯化）的21聚体ON的表征，并明确显示具有相似大小和化学修饰（即硫代磷酸酯 化）的任何ON将具有不受存在的核苷酸序列影响的高度相似的（如果不相同）理化特征 (参见图1A-C)。
[0113] 在本申请中，术语"核酸聚合物"或NAP意图用来鉴别不包含序列特异性功能的任 何单链ON。NAP的生化活性不依赖于ON的Toll样受体识别、与靶核酸的杂交或需要来源 于存在的核苷酸的特定顺序的特定二级三级ON结构的适体相互作用。NAP可以包括如上所 述的碱基和或键和或糖修饰。
[0114] ON可以通过序列相关或序列无关的众多机制来发挥它们的作用。序列相关的机制 是其活性需要特定的核酸序列并且其中所述活性因存在的核苷酸序列中的一个或多个改 变而降低的那些机制。这个特定的序列可能涵盖ON的整个长度或只有它的一部分（序列 基序）。序列相关的ON的实例包括：
[0115] 1.反义ON(单链或双链（例如小干扰RNA (siRNA)或小发夹RNA (shRNA))与疾病 病况（即病毒感染或胆固醇的调节）中涉及的信使RNA(mRNA)(即病毒mRNA或宿主mRNA) 的特定部分互补并且当引入细胞时，它们通过RNA酶H或RNA诱导的沉默络合物（RISC)引 导这些目标mRNA降解。
[0116] 2.空间阻断（Stearic blocking) ON是与mRNA的特定部分互补但被工程改造成不 活化RNA酶H的单链反义0N。这些ON与它们的靶mRNA的杂交产生对通常作用于所述mRNA 的蛋白质提供位阻（stearic hindrance)的双链结构。这些ON可以用于阻断特定mRNA的 翻译或者用于干扰特定mRNA的转录后剪接和成熟。这些ON可被工程改造成通过遍及其中 或在存在于ON中的每个核糖上的2'核糖修饰（如2' 0甲基化）来阻断RNA酶H的活化 (因为RNA酶H的活化与这些ON的作用机制不是一个整体）。
[0117] 3.适体是采取能够进行特异性蛋白质相互作用（即与病毒蛋白质或宿主蛋白质） 的特定三维构象并且不容易与宿主DNA或RNA相互作用的0N。适体也可以包括镜像异构 体，它使用L-核苷酸以赋予所述ON对核酸酶降解的抗性。
[0118] 4.免疫刺激性ON使用特定的6聚体核酸基序（XXCGXX)来刺激哺乳动物中的免疫 应答。最佳的基序随物种的改变而改变，但是严格依赖于与XXCGXX基序一致的特定序列。
[0119] 5.微型RNA(miRNA)结合并阻断疾病病况（即病毒复制或胆固醇调节）中涉及的 天然存在miRNA的功能。
[0120] 反义ON可以应用于各种疾病病况，如通过催化病毒mRNA的降解而靶向病毒活性 (例如 ALN-RSV01 ;Zamora 等，2011，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183:531-538)或通过催 化 ApoBlOOmRNA 的降解而祀向 LDL 和 VLDL 的产生（例如 mipomersen [Kynamro?] ;Raal 等， 2010, Lancet 375:998-1006)。反义ON也可以用于纠正基因转录产物的错误剪接，基因转 录产物的错误剪接可以产生异常的蛋白质，如纠正发生在杜馨氏肌肉营养不良症中的肌萎 缩蛋白基因转录产物的错误剪接（例如PR0-051，Goemans等，2011，NEJM 364:1513-1522)。
[0121] miRNA可以应用于各种疾病病况，如与细胞内的天然存在miR-122杂交并催化 其降解，所述miR-122在LDL和VLDL产生的调节以及丙型肝炎的产生中均涉及到（例如 miravirsen :Janssen等2013年3月27日NEJM，在印刷之前的电子出版）。
[0122] 唯一报告的序列无关的ON的实例是硫代磷酸酯化的NAP，它以大小（长度）相关 的方式借助于两亲聚合物的理化性质选择性地与两亲蛋白质结构相互作用（参见例如美 国专利号8, 008, 269)。
[0123] 任何0N，无论它在生理环境中如何发挥其生物学效应，都预期会在所述寡核苷酸 进入血液循环中时形成二价阳离子介导的相互作用，在血液循环中包含一些游离的二价或 三价阳离子，但是其中大部分血清二价金属是与蛋白质结合的（例如钙与诸如白蛋白、凝 血酶和纤维蛋白原等钙结合蛋白结合）。因此，在体内环境中大部分二价金属介导的寡聚 物相互作用很可能是与蛋白质发生的，而不是与另一个寡核苷酸（在螯合物中）。因为已 经证明众多ON在按照其设计（无论作为单链反义、siRNA、shRNA抑或miRNA)在体内施用 时具有可预测的功能，所以这些钙介导的蛋白质相互作用虽然具有ON的耐受性方面的影 响（如国际申请公布号W02012/021985和美国申请公布号2012/0046348中所述），但是似 乎是可逆的，以便不妨碍ON的器官积累、ON的胞内运输和这些ON与其体内核酸靶标的相 互作用。能够合理地预测这些相互作用的可逆性是与这些二价金属介导的寡聚物-蛋白质 相互作用有关。因为施用寡核苷酸螯合物可能会干扰这些蛋白质相互作用（如美国申请公 布号2012/0046348中所述），所以本领域技术人员将合理地预测，施用ON螯合物会改变ON 的药动学特性（和器官积累），特别是已知在肾脏、肝脏、肺和脾脏中积累并且在本领域中 公认与ON-蛋白质相互作用有关的硫代磷酸酯化ON(PS-ON)。
[0124] 此外，如美国申请公布号2012/0046348中所述的ON螯合物的制备涉及在不存在 任何蛋白质以及存在比通常存在于血液循环中的浓度高的浓度的二价金属阳离子的情况 下的ON相互作用，并且根据如美国申请公布号2012/0046348中所描述教导的技术可以合 理地预测，这些ON螯合物会丧失其通常与血液中的蛋白质相互作用的能力（所有ON必须 通过血液循环转移，无论其在体内的最终命运如何）。因此，虽然施用ON螯合物会防止或 减轻ON在体内的螯合特性并且因此减轻源于寡聚物螯合效应的副作用，但是在本发明提 供能够实现的公开内容之前用于制备ON螯合物制剂（它们是在体外和非生理环境中形成 的）的ON在以螯合物形式施用（与以钠盐形式对受试者施用时的ON活性相比）是否会保 留其特异性器官积累和功能是不可预测或不明显的。因为ON螯合物不是在体内形成的，所 以可能不能解离和或转运到细胞内和或接纳正确的蛋白质和或在体内发生其他生化相互 作用以发挥其功能（例如与互补DNA或RNA链退火或与蛋白质中的两亲螺旋相互作用或与 特定的蛋白质形成序列特异性适体相互作用）。此外，与以简单ON盐形式施用时的相同ON 相比，施用预先形成的ON螯合物可能会导致宿主受试者体内的需要部位中的积累减少。因 此，在本文中的公开内容之前，并不清楚当引入生理环境中时或当对受试者施用时任何特 定的ON螯合物会保留其非螯合ON盐前体（progenitor)的生化功能。
[0125] 此外，因为在溶液中与二价金属形成螯合物的螯合性质和能力是任何ON所固有 的，所以当以螯合物形式施用时任何特定的ON保留生物活性的验证将提供明确的证据和 教导，即当以螯合物形式施用时任何ON的生物活性将被保留，而无论其特定的作用方式或 靶标疾病如何。
[0126] 若干基于抗病毒ON的药物目前正在开发用于治疗病毒感染，包括用于治疗HBV 的 NAP REP 9AC(REP 2055 或 SEQ ID N0:2, REP 9AC'（REP2139 或 SEQ ID N0:18)和 REP 9AC-m(REP 2148或SEQ ID勵：11)，用于治疗!1(^的1^四￥化8611和用于治疗呼吸道合胞病 毒（RSV)的ALN-RSV01。这些ON各有不同的作用机制：基于核酸的聚合物阻断HBV病毒进 入并且还阻止HBV表面抗原蛋白（HBsAg)释放进入血液（一种抑制免疫功能的蛋白质）， miravirsen ( 一种miRNA)阻断微型RNA mir-122的作用，已知mir-122在HCV复制中发挥 作用，以及ALN-RSV01 (-种siRNA)阻断RSV衣壳蛋白的合成，从而防止RSV病毒粒子产 生。所有这些ON药物可在受试者中非常有效地引起其预期作用：REP 9AC/REP 9AC'对于从 血液中清除HBsAg非常有效，miravirsen对于抑制mir-122功能非常有效，而ALN-RSV-Ol 对于阻断衣壳蛋白质生产非常有效。然而，在肠胃外施用这些基于ON的化合物的任何情况 下，当通过静脉内输注施用时，它们与诸如发热、寒战、发抖等施用相关的副作用有关，或者 当通过皮下施用进行施用时与注射部位的疼痛、炎症或硬化有关。
[0127] 已经证明若干ON在治疗人患者的高胆固醇血症和高甘油三酯血症中有效。它们 是mipomersen (Kynamro?)，一种祀向Apo B100合成的第二代反义寡核苷酸；PCS-GalNAc， 一种靶向PCSK9和NAP的糖缀合siRNA (参见实施例V)。
[0128] 还在动物中在体外和体内证明了 NAP能够阻止朊病毒病的发展（Kocisko等， 2006,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50:1034-1044)。
[0129] 使用寡核苷酸来纠正疾病病况中的异常RNA剪接也是各种疾病病况中公认的治 疗干预（Du 和 Gatti, 2009, Curr. Op. Mol. Ther.，11:116-123)。在杜馨氏肌肉营养不良 症的情况下，寡核苷酸PR0-051被设计成在成熟期间结合肌萎缩蛋白RNA并且诱导跳过 成熟mRNA中的外显子51，从而恢复患病肌纤维中的正常肌萎缩蛋白产生（Goemans等， 2011，NEJM 364:1513-1522)。然而，传统的PR0-051施用伴随有注射部位反应，这至少部分 是由于美国申请公布号2012/0046348中所述的ON的螯合介导的性质。
[0130] 为了使其施用相关的副作用最小化，希望任何这些基于ON的药物被制备为ON螯 合物，前提是它们能够保留其生化功能。本公开证明ON可以被制备成螯合物并且仍然保留 其生化功能。制剂中的ON螯合物可以来源于具有抗病毒活性的任何0N，其实例在表1中提 供。
[0131] M 1
[0132] 可以制备成螯合物的ON的实例。
[0133]

【权利要求】
1. 一种药物制剂，其包含抗病毒寡核苷酸螯合物用于治疗病毒感染。
2. -种药物制剂，其包含抗胆固醇寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症。
3. -种药物制剂，其包含抗甘油三酯寡核苷酸螯合物用于治疗高甘油三酯血症。
4. 一种药物制剂，其包含抗阿尔茨海默寡核苷酸螯合物用于治疗阿尔茨海默病。
5. -种药物制剂，其包含抗朊病毒寡核苷酸螯合物用于治疗朊病毒病。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用二价金 属阳离子制备的。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用钙制备 的。
8. 如权利要求1至6中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用镁制备 的。
9. 如权利要求1至6中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用铁 (2+)、锰、铜或锌制备的。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含两种或 两种以上不同二价金属阳离子。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含钙和 镁。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个双链寡核苷酸。
13. 如权利要求1至12中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个具有至少一个硫代磷酸酯键的寡核苷酸。
14. 如权利要求1至13中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸。
15. 如权利要求1至14中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个具有一个2'修饰的核糖的寡核苷酸。
16. 如权利要求1至15中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个每个核糖都被2' 0-甲基化的寡核苷酸。
17. 如权利要求1至16中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个具有至少一个5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
18. 如权利要求1至17中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个其中每个胞嘧啶都是5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
19. 如权利要求1至18中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物含有至少 一个完全硫代磷酸酯化并且所有核糖都具有2' 0甲基修饰并且所有胞嘧啶都以5'甲基胞 嘧啶形式存在的寡核苷酸。
20. 如权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少 一个选自SEQIDN0:1-6或10-18的寡核苷酸。
21. -种药物制剂，其包含含有SEQIDN0:20的螯合物用于治疗高胆固醇血症。
22. -种药物制剂，其包含含有SEQIDN0:19的螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良 症。
23. -种药物制剂，其包含含有SEQIDN0:7的螯合物用于治疗丙型肝炎感染。
24. 如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成 用于皮下施用。
25. 如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成 用于静脉内输注。
26. 如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成 用于选自由以下方式组成的组的施用：眼内、口服、肠道、吸入、肌内注射、腹膜内注射、鞘内 注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射和局部。
27. 如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成 通过气雾剂进行施用。
28. 如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的病毒是乙型肝炎病毒。
29. 如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒是嗜肝DNA病毒。
30. 如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒是肝炎S病毒。
31. 如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒是流感病毒。
32. 如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒选自由以下病毒组 成的组：逆转录病毒科的成员、HIV-1、HIV-2、疱疹病毒科的成员、HSV-1、HSV-2、巨细胞病 毒、痘病毒科的成员、副粘病毒科的成员、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、布尼亚病毒科的成 员、汉坦病毒、丝状病毒科的成员、埃博拉病毒、马尔堡病毒、黄病毒科的成员、黄热病毒、登 革热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、正粘病毒科的成员、披膜病毒科的成员、冠状病毒科 的成员、弹状病毒科的成员和砂粒病毒科的成员。
33. 如权利要求1所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含SEQIDNO:2。
34. 如权利要求1所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含SEQIDNO: 18。
35. 如权利要求1所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含SEQIDNO: 11。
36. 抗病毒寡核苷酸螯合物用于治疗病毒感染的用途。
37. 抗胆固醇寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
38. 抗甘油三酯寡核苷酸螯合物用于治疗高甘油三酯血症的用途。
39. 抗阿尔茨海默寡核苷酸螯合物用于治疗阿尔茨海默病的用途。
40. 抗朊病毒寡核苷酸螯合物用于治疗朊病毒病的用途。
41. 如权利要求36至40中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用二价金属 阳离子制备的。
42. 如权利要求36至41中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用钙制备 的。
43. 如权利要求36至42中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用镁制备 的。
44. 如权利要求36至43中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用铁（2+)、 锰、铜或锌制备的。
45. 如权利要求36至44中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含两种或两 种以上不同二价金属阳离子。
46. 如权利要求36至45中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含钙和镁。
47. 如权利要求36至46中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 双链寡核苷酸。
48. 如权利要求36至47中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 具有至少一个硫代磷酸酯键的寡核苷酸。
49. 如权利要求36至48中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸。
50. 如权利要求36至49中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 具有一个2'修饰的核糖的寡核苷酸。
51. 如权利要求36至50中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 每个核糖都被2' 0-甲基化的寡核苷酸。
52. 如权利要求36至51中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 具有至少一个5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
53. 如权利要求36至52中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 所有胞嘧啶都是5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
54. 如权利要求36至53中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个 完全硫代磷酸酯化并且所有核糖都具有2' 0甲基修饰并且所有胞嘧啶都以5'甲基胞嘧啶 形式存在的寡核苷酸。
55. 如权利要求36至40中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含选自SEQ IDN0:1-6或10-18的寡核苷酸。
56. 包含SEQIDN0:20的寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
57. 包含SEQIDN0:19的寡核苷酸螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的用途。
58. 包含SEQIDN0:7的寡核苷酸螯合物用于治疗丙型肝炎感染的用途。
59. 如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于 皮下施用。
60. 如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于 静脉内输注。
61. 如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述0N螯合物配制成用于选自 由以下方式组成的组的施用：眼内、口服、肠道、吸入、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘 内输注、气管内、静脉内注射和局部。
62. 如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于 通过气雾剂进行施用。
63. 如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是乙型肝炎病毒。
64. 如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是嗜肝DNA病毒。
65. 如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是肝炎S病毒。
66. 如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是流感病毒。
67. 如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒选自由以下病毒组成的 组：逆转录病毒科的成员、HIV-1、HIV-2、疱疹病毒科的成员、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、痘 病毒科的成员、副粘病毒科的成员、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、布尼亚病毒科的成员、汉 坦病毒、丝状病毒科的成员、埃博拉病毒、马尔堡病毒、黄病毒科的成员、黄热病毒、登革热 病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、正粘病毒科的成员、披膜病毒科的成员、冠状病毒科的成 员、弹状病毒科的成员和砂粒病毒科的成员。
68. 如权利要求36所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含由SEQIDN0:2组成的 寡核苷酸。
69. 如权利要求36所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含由SEQIDNO: 18组成的 寡核苷酸。
70. 如权利要求36所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含由SEQIDNO: 11组成的 寡核苷酸。
【文档编号】A61K31/7088GK104379152SQ201380025475
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2012年5月18日
【发明者】米歇尔·巴齐内, 安德鲁·瓦利恩特 申请人:里普利科股份有限公司