Irf3基因在动脉粥样硬化中的功能及其抑制剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种IRF3基因在动脉粥样硬化中的功能及其抑制剂的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以ApoE-/-小鼠和IRF3-/-ApoE-/-小鼠为实验对象，通过高脂诱导获得动脉粥样硬化模型，进行了AS模型小鼠斑块面积测定和内含物分析，结果表明与ApoE-/-小鼠对比，IRF3-/-ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积显著减少。这提示一种IRF3基因在动脉粥样硬化疾病中的功能，主要体现在其具有促使主动脉斑块形成的作用，特别是IRF3基因能够恶化动脉粥样硬化。针对IRF3的上述功能，IRF3可作为药物靶标筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物；IRF3的抑制剂可用于制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物。
【专利说明】IRF3基因在动脉粥样硬化中的功能及其抑制剂的应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于基因的功能与应用领域，涉及一种IRF3 (interferon regulatoryfactor 3)基因在动脉粥样硬化中的功能及其抑制剂的应用。
【背景技术】
[0003]心脑血管疾病在许多发达国家中是主要致死性病因，在我国的发病率和致死率也逐年升高。心脑血管疾病的基础是动脉粥样硬化(Atheosclersisis, AS),动脉粥样硬化可使动脉管壁增厚、变硬、管腔狭窄，导致很多心脑血管事件发生。而动脉粥样硬化不稳定斑块的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠状动脉急性狭窄和闭塞是导致急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]动脉粥样硬化是多种遗传基因、危险因素及免疫机制共同参与的一种慢性炎症性疾病，局部和全身的炎症免疫反应在动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用，固有免疫和适应性免疫共同参与调节动脉粥样硬化病变，病理上表现为大、中动脉多处斑块形成，好发于血液分流、动脉弯曲及动脉分支等区域，其病变特征是血中脂质在动脉内膜沉积，弓丨起内膜灶性纤维性增厚，病灶深部为由坏死组织和细胞外脂质池形成的粥样物质。动脉粥样硬化斑块中存在着多种免疫细胞，其中以巨噬细胞和T细胞最为常见，此外还有少量的树突状细胞(Dentritic cell,DC)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)和肥大细胞(mast cell)等,偶有B 淋巴细胞。
[0005]动脉粥样硬化最早期肉眼可见的损伤是脂质条纹，主要由摄取了大量胆固醇的巨噬细胞源性泡沫细胞构成。血液循环中的单核细胞在动脉易损部位黏附到活性内皮细胞，启动了脂质条纹的形成，黏附的单核细胞随后受局部产生的化学趋附分子的吸引迁移到内膜下，并进一步分化为巨噬细胞；大量胆固醇脂在巨噬细胞内积聚，形成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化形成早期的特征性病理生理过程。动脉粥样硬化的发生是多因素共同作用的结果。目前已发现的动脉粥样硬化危险性因素很多，但相关针对治疗及控制效果均不理想，降脂和抗炎治疗是目前最主要的治疗措施。越来越多的证据显示免疫反应参与动脉粥样硬化发展的各个环节，因此探索调控免疫细胞功能的基因对控制动脉粥样硬化具有重要意义。
[0006]IRF3 是干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)家族中的一个成员。有研究表明IRF3与病毒感染时干扰素基因的表达密切相关，IRF3可表达在多种细胞中，主要存在于细胞浆中，在天然免疫中发挥重要的作用。
【发明内容】
[0007]为解决现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种IRF3及其抑制剂在制备动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:本发明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠与IRF3/ApoE双基因敲除(IRF3+AP0E+)小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型(AS)模型，进行了 AS模型小鼠斑块面积测定和内含物分析，结果表明与ApoE+小鼠对比，IRF3+AP0E+小鼠动脉粥样硬化主动脉斑块面积明显低于同种饲料饲养的ApoE+小鼠。这提示IRF3基因敲除会抑制动脉粥样硬化的发生，说明IRF3基因能够恶化动脉粥样硬化的发生，为研究防治动脉粥样硬化的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
[0009]一种IRF3基因在动脉粥样硬化中的功能，主要体现在IRF3基因具有恶化主动脉斑块形成的作用，特别是IRF3具有恶化动脉粥样硬化的作用。
[0010]针对IRF3的上述功能，本发明提供一种IRF3的应用，主要体现在IRF3作为药物靶标在筛选抑制主动脉斑块形成的药物中的应用。
[0011]针对IRF3的上述功能，提供一种IRF3的应用，主要体现在IRF3作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
[0012]针对IRF3的上述功能，本发明提供一种IRF3的抑制剂的应用，主要体现在IRF3的抑制剂在制备抑制主动脉斑块形成的药物中的应用。
[0013]一种抑制主动脉斑块形成的药物，包含IRF3的抑制剂。
[0014]针对IRF3的上述功能，本发明提供一种IRF3的抑制剂的应用，主要体现在IRF3的抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
[0015]一种治疗动脉粥样硬化疾病的药物，包含IRF3的抑制剂。
[0016]所述的IRF3的抑制剂优选为IRF3基因的siRNA、IRF3基因的RNA干扰载体、IRF3的抗体及其他能够抑制IRF3表达的抑制剂中的一种。
[0017]本发明的研究成果表明，IRF3+APOE+小鼠在高脂饮食诱导的动脉粥样硬化中，与ApoE+小鼠相比，主动脉斑块面积明显减少而胶原含量增多，说明IRF3基因在动脉粥样硬化疾病模型中有着重要的恶化作用。
[0018]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(I)本发明发现IRF3基因的新功能，即IRF3基因具有能够恶化动脉粥样硬化疾病的作用。
[0019](2)基于IRF3在恶化动脉粥样硬化疾病中的作用，IRF3可为研制动脉粥样硬化疾病的药物提供靶标，IRF3的抑制剂可用于制备治疗动脉粥样硬化的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的主动脉树结果图；A为小鼠主动脉树油红O染色图，B为主动脉树斑块面积统计柱状图。
[0021]图2是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠主动脉窦结果图；A为主动脉窦HE染色结果图，B为主动脉窦斑块面积统计柱状图，C为ApoE+和IRF3+APOE+小鼠体重统计柱状图(NS代表组间无差异)。
[0022]图3是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的斑块内含物的分析结果图；A是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的巨噬细胞(⑶68 )和平滑肌 细胞(SMA)标志物免疫荧光染色及结果统计柱状图(图中m代表主动脉中膜，L代表主动脉管腔)，B是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的天狼星红染色及结果统计柱状图。【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0024]实验用动物及饲养:
实验动物种属，性别，周龄及来源=ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠与IRF3/ApoE双基因敲除(IRF3+APOE+)小鼠，雄性，8周龄，体重19_25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE+小鼠，C57BL/6J 背景，购自 Jackson Laboratory，货号 002052)。IRF3+ApoE+小鼠由 IRF3 基因敲除小鼠(IRF3基因敲除小鼠，C57BL/6J背景，购自RIKEN BRC公司，BRC编号:RBRC00858)和ApoE基因敲除小鼠杂交得到。
[0025]实验动物饲料配方:高脂饲料(HFD，购自北京华阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，热量百分比:蛋白质15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%)。
[0026]动物饲养及环境条件:所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房(许可证号=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2°C，湿度40%-70%，小鼠自由饮水进食。
[0027]实施例1小鼠动脉粥样硬化模型(AS)获得
1.实验动物分组:选用8周龄，体重19-25g，雄性，ApoE+小鼠和IRF3+AP0E+小鼠，分别给予高脂饲料(Western Diets，HFD)饲养，ApoE+ HFD组，IRF3+ApoE+ HFD组共2个组别。
[0028]2.动脉粥样硬化模型通过高脂饲料诱导操作流程:
采用ApoE+小鼠和IRF3+AP0E+小鼠，建立AS模型，进行表型相关分析，明确IRF3基因对动脉粥样硬化发病发挥重要作用。小鼠从8周龄开始喂养高脂饲料直至28周处死并收集样本。
[0029]实施例2 AS模型小鼠斑块面积测定 1.小鼠终末组织取材
小鼠喂养高脂饲料直至28周时，称重，用3%戊巴比妥钠，90mg/kg麻醉小鼠，用针头固定于取材板，用纱布湿润小鼠胸腹部皮肤，用眼科剪剪开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，把输液器的针头刺进左心室，用50mL注射器缓慢推注10-15mL PBS缓冲液，待右心耳流出液清亮，换上4%多聚甲醛继续推注10-15mL。灌流结束后，清除胸腹腔脏器，仅保留心脏。将小鼠置于显微镜下，分离主动脉弓周围筋膜、脂肪组织，剪下头臂干，放入装有4%多聚甲醛的5mL EP管中，在升主动脉起始部剪下心脏，在胸主动脉中部剪断，并在颈总和锁骨下约3mm处剪断，把主动脉弓放入上述EP管中。
[0030]2.主动脉树斑块面积测定
主动脉树置于4%多聚甲醛中隔夜固定一纯水漂洗30min — 60%异丙醇处理IOmin —油红O染液染色60min — 60%异丙醇漂洗Imin X 3次至背景干净一解剖镜下去除残余外壁脂肪一将染色好的动脉平铺于黑色解剖蜡板上，染色后用数码相机拍照，并使用IPP图像分析软件进行斑块面积定 量测定。(油红O原液=0.5克油红0+100毫升100%异丙醇，油红O染液(工作液)=V (油红O原液)/V (H2O) =3/2)
主动脉树斑块面积(％)=斑块总面积/主动脉树总面积*100%。
[0031]3.病理组织处理3.1石蜡标本
心脏标本在4%多聚甲醛中隔夜固定后拿出，将头臂干、主动脉弓用滤纸小心包好，以防从包埋框间隙中漏出。流水冲洗30min后放入脱水机，30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75% 乙醇 15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100%乙醇15min — 二甲苯15min — 二甲苯15min —石腊30min —石腊30min。头臂干及主动脉弓脱水完成后，从脱水机拿出。头臂干呈Y直立于石蜡中，主动脉弓平躺于石蜡中。
[0032]3.2主动脉组织切片
蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行，调整切片厚度(5微米)。切下的片子，右手用弯镊子轻轻钳牢石蜡切片，左手用干燥毛笔将切片从切片取下，放入盛温水(约30°C )的玻璃皿内，将切片摊于温水面上，光亮的切面向下，待切片在恒温水内充分摊开展平后(大约不超过10秒钟)，将载玻片垂直插入水中轻靠切片，并用镊子将切片一边拨于玻片上，并调整好切片的位置，随即将玻片直立提起。用铅笔在玻片一端的磨砂玻璃上写上标本编号，将切片晾干过夜。
[0033]4、主动脉窦斑块面积测定
苏木素伊红染色(HE染色):石蜡白片65°C烘烤30分钟一二甲苯5分钟X3次一100%乙醇I分钟一95%乙醇I分钟一70%乙醇I分钟一纯水漂洗(以玻片上不挂有水珠为标准)—甩尽载玻片上的水分，苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)浸染5分钟一自来水漂洗(去除玻片上苏木素的浮色)一1%盐酸乙醇1-3秒一自来水漂洗(去除玻片上盐酸乙醇)一Scott液(碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水IOOmUl分钟一自来水浸洗(去除玻片上的Scott液)—甩尽在玻片上的水分，伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)染色10秒钟一纯水漂洗(去除玻片上伊红的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分钟，3次一趁二甲苯未干时封片(每拿出一张封一张，以切片无气泡为原则)一显微镜拍照。直接用IPP图像分析软件圈主动脉窦斑块面积(mm2)。
[0034]通过主动脉树油红O染色可大体评估动脉粥样硬化斑块形成的多少、分布情况及斑块面积大小。图1是小鼠AS模型后油红O染色结果图，头皮干和主动脉根部是动脉粥样硬化斑块最明显的部位。图2是小鼠AS模型后HE染色结果图，结果表明，与ApoE+小鼠相比，IRF3+APOE+小鼠主动脉树内斑块面积明显减少，IRF3+APOE+小鼠主动脉窦斑块面积明显减少，28周AS模型后ApoE+小鼠和IRF3+APOE+小鼠的体重则无明显变化(图2C)，表明IRF3基因的缺失可显著降低动脉粥样硬化斑块的大小。
[0035]实施例3 AS模型小鼠斑块内含物的分析
1.巨噬细胞及平滑肌细胞表达测定 免疫荧光染色检测巨噬细胞(⑶68)、平滑肌肌动蛋白(Smooth Muscle Actin，SMA)的表达。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec) , SMA (ab5694;1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG (Al 1077;Invitrogen, Carlsbad, CA) , Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG(Al1008; Invitrogen, Carlsbad, CA)。
[0036]主要步骤为:
I)烤片:将石蜡切片置于烤箱中30min以上。
[0037]2)脱蜡:二甲苯 5minX3 次。[0038]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0039]4)柠檬酸盐组织抗原修复(高压修复):取一定量的pH6.0柠檬酸盐抗原修复工作液于修复盒中，修复工作液的量必须能足够浸没整张切片，将修复盒放入已加入适量自来水的高压锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水合后的组织切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入修复盒中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时5min后，压力锅断开电源，去阀开盖，取出修复盒；室温放置20min自然冷却后取出切片。
[0040]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0041]6)组化笔划圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封闭，于湿盒中37°C封闭60mino[0042]7)弃封闭液,滴加适当比例稀释的一抗，4°C孵育过夜,37°C复温30min,弃去一抗，PBS 洗 IOminX 3 次。
[0043]8)滴加二抗，于湿盒中37°C孵育60min，弃去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0044]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0045]10)荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4°C保存。
[0046]荧光统计方法:SMA (%)=斑块内SMA阳性吸光度值/斑块总面积*100% KD68 (%)=斑块内CD68阳性吸光度值/斑块总面积*100%。
[0047]2.天狼星红(PSR)染色
主要步骤为:55 V烘烤30min — 二甲苯2min，3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —流水冲洗IOmin —双蒸水Imin —质量分数0.2%磷钥酸2min — 0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上,湿盒中染色90min —去除残液一0.01N盐酸4s — 70%酒精I次一90%酒精I次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即盖玻片封片,显微镜拍照。
[0048]统计方法:胶原(％)=斑块内胶原阳性总面积/斑块总面积*100%。
[0049]平滑肌细胞可分泌多种细胞基质，是动脉粥样硬化斑块内分泌胶原的细胞源，主要作用是修复被破坏的细胞基质成分从而起到保护作用；巨噬细胞是斑块内最重要的细胞成分，它主要有血液循环单核细胞进入内皮下后分化而来，单核/巨噬细胞可分泌多种粘附、趋化因子如细胞黏附分子(ICAM-1)、单核细胞趋化和激活因子(MCP-1)等，增进斑块内细胞的进入，此外巨噬细胞还可分泌多种基质金属蛋白酶(MMPs)，降低斑块内胶原面积，从而破坏斑块的稳定性；胶原成分是斑块内最重要的细胞外基质，也是纤维帽的主要成分，具有抗血流冲击防止斑块破裂的作用，也是维护斑块稳定性的重要评估指标。
[0050]图3是ApoE+和IRF3+AP0E+小鼠的斑块内含物的分析结果图。为检测斑块内巨噬细胞和平滑肌细胞的表达情况，将主动脉窦切片分别进行CD68 (巨噬细胞标志)和SMA (平滑肌细胞标志)等免疫荧光染色分析巨噬细胞与平滑肌细胞成分。免疫荧光发观察SMA, CD68在ApoE+小鼠和IRF3+ApoE+小鼠斑块内均有表达，SMA在IRF3+ApoE+小鼠斑块内表达量明显高于ApoE+小鼠<D68在IRF3+AP0E+小鼠斑块内表达量则显著低于ApoE+小鼠(A) ；PSR染色结果表明高脂饮食后的模型，IRF3+AP0E+组小鼠的胶原比例明显高于ApoE+小鼠，说明IRF3+AP0E+组小鼠的斑块更稳定(B)。结果表明IRF3基因敲除在AS模型中可降低斑块内面积，促进斑块的稳定性。[0051]上述实施例结果显示，ApoE+小鼠及IRF3+APOE+小鼠在高脂饮食的诱导下发生动脉粥样硬化，IRF3/ApoE双基因敲除后，小鼠主动脉斑块面积较ApoE+小显著减少。这些结果提示，IRF3基因可促进主动脉斑块的形成和动脉粥样硬化的发生发展。本发明证明了IRF3基因在动脉粥样硬化模型中有着重要的恶化作用，其可作为药物靶标筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物。
[0052]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的 置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.1RF3作为药物靶标在筛选抑制主动脉斑块形成的药物中的应用。
2.1RF3作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
3.1RF3的抑制剂在制备抑制主动脉斑块形成的药物中的应用。
4.一种抑制主动脉斑块形成的药物，其特征在于:包含IRF3的抑制剂。
5.1RF3的抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
6.一种治疗动脉粥样硬化疾病的药物，其特征在于:包含IRF3的抑制剂。
7.根据权利要求3或5所述的应用或权利要求4和6所述的药物，其特征在于所述的IRF3的抑制剂为IRF3基因的siRNA、IRF3基因的RNA干扰载体或IRF3的抗体中的一种。
【文档编号】A61K48/00GK103784971SQ201410031535
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】李红良, 蒋曦, 蒋丁胜, 胡俊飞, 邓克穷, 王丕晓 申请人:武汉大学