针对IL-17和TNFα的融合多肽及其应用的制作方法

针对IL-17和TNFα的融合多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种针对IL-17和TNFα的融合多肽及其应用。本发明提供了一种融合多肽，即IL-17scfv/sTNFRI融合多肽，由A片段和B片段组成；所述A片段为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述B片段为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。本发明提供的融合多肽可有效地缓解类风湿关节炎（RA）的临床症状，对于类风湿关节炎的治疗具有重大应用价值 。
【专利说明】针对IL-17和TNFa的融合多肽及其应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有同时抵抗白细胞介素-17和肿瘤坏死因子a活性的基因工程新型双特异性多靶点融合多肽，特别是涉及阻断自身免疫疾病的炎症反应的双特异性多靶点融合多肽。

【背景技术】
[0002]IL-17是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子(Fine-tuningcytokine)。IL-17可刺激角质细胞、成纤维细胞、上皮细胞及内皮细胞释放IL_6、IL-8、前列腺素E2 (PGE2)、金属蛋白酶-1 (MMP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和单核细胞化学趋化蛋白(MCP)-l等细胞因子。目前认为IL-17促进类风湿关节炎(RA)中骨破坏机制可能包括:诱导TNFa和IL-1的产生，使关节得破坏作用增强；增加核刺激因子受体和核刺激因子受体的数量，破坏骨保护蛋白与两者的平衡而加重骨破坏；IL_17还直接作用于破骨细胞，刺激破骨细胞的分化与活化。
[0003]IL-17具有强大的招募中性粒细胞的作用。IL-17与成纤维细胞共培养时，成纤维细胞可以持续促进⑶34+造血干细胞的增殖并向中性粒细胞分化；IL-6、IL-17、MIP-2的抗体均有抑制中性粒细胞在气道聚集的作用。说明IL-17是T细胞依赖性炎症反应的早期启动子，也在联系造血系统细胞因子网络和免疫系统中起到重要作用。
[0004]TNFa是一种主要由激活的巨噬细胞产生的细胞因子，是一种重要的生物活性因子，TNFa除具有较强的肿瘤杀伤活性外，还具有广泛的生物学活性，它能够激活巨噬细胞和多形核细胞，诱导多种细胞因子的产生并协同作用，参与免疫调节，促进组织相容性复合物的表达，增强机体的抗感染能力，参与骨组织的吸收和重塑等。然而，过多TNFa的产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，引起严重的炎症反应，并可导致发热、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。
TNFa主要通过与细胞膜上的特异性受体TNFR结合发挥生物学活性，TNFR有TNFRI和TNFRII两种，均能与TNFa和TNF0相结合，但所介导的生物学功能不尽相同。在体内，有一部分TNF膜受体胞外区从细胞膜上解离下来，游离在血液中，成为可溶性TNF受体sTNFR。sTNFR不介导信号的传导，但仍能与TNF a结合，中和TNF a的活性，在体内、体外抑制TNFa诱导的细胞毒性和自身免疫反应，是TNFa的天然拮抗剂。
IL-1和TNFa是目前公认的RA病中的重要炎症介质，IL-17能显著促进炎症细胞分泌IL-1和TNFa。IL-17与IL_1、TNF a合用可增强成骨细胞样细胞中激活蛋白21(AP21)家族成员、早期生长反应基因(Egr-1)、NF-KB的表达，且可上调TNFa刺激的基因26(TSG26)、IL-6、IL-8的表达水平。IL-17与其他炎症细胞因子的有效协同作用，使之位于炎症网络的中心，从而促进RA炎症的发展。抗白介素-17和肿瘤坏死因子a的中和活性的融合多肽可以与白介素-17和肿瘤坏死因子-a发生特异性的结合，阻断其生物学活性，有效的减缓炎症反应的发展，防止病情的恶化。针对白介素-17和肿瘤坏死因子a的融合多肽国内外均未见报道。
[0005]抗白介素-17单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体I构成的双特异性多靶点融合多肽，可以与白介素-17和TNFa发生特异性的结合，阻断其生物学活性。融合蛋白可以有效的减缓炎症反应的发展，防止病情的恶化。目前以TNFa、IL-17等以单一细胞因子作为靶标的生物抑制剂国内外均有报道，同时抵抗两种细胞因子的生物制剂国内外均未见报道。
[0006]


【发明内容】

[0007]本发明提供了一种以IL-17和TNFa为靶标的新型双特异性多靶点多肽类药物(IL-17scfv/sTNFRI融合多肽)，具有同时阻断两种细胞因子所引起的炎症反应的能力。
本发明提供了一种融合多肽，由A片段和B片段组成；所述A片段为如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述B片段为如下(c)或(d): (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
[0008]本发明提供的IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽是通过抗体的铰链区将抗人IL-17单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体I相连接构成的双特异性多靶点融合多肽。
[0009]所述融合蛋白的制备方法包括如下步骤:(1)将序列表的序列2和序列4所示的双链DNA分子重叠PCR连接后，插入pET-27b(+)载体的多克隆位点，得到重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌；(3)将步骤(2)得到的重组菌培养至0D6(l(lmi=0.5，采用IPTG诱导培养4h，离心收集菌体；(4)取步骤(3)得到的菌体，超声破碎，收集包涵体，然后将包涵体变性溶解，逐滴加入50毫升复性液(溶剂为水，含2M尿素、0.1M NaH2P04 和 0.01M Tris_HCl，pH=8.0)中，4°C静置孵育 12h，然后在 ρΗ7.4 的 PBS缓冲液中透析，即得。
[0010]本发明还保护一种DNA组合物，由编码所述Α片段的DNA分子甲和编码所述B片段的DNA分子乙组成。所述DNA分子甲可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子:(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述A片段的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述A片段的DNA分子。所述DNA分子乙为如下(4)或(5)或(6)的DNA分子:(4)序列表中序列4所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码所述B片段的DNA分子；(6)与
(4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述B片段的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1% SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜一次。
[0011]本发明还保护一种质粒组合物，由含有所述DNA分子甲的重组质粒甲和含有所述DNA分子乙的重组质粒乙组成。
[0012]本发明还保护一种用于治疗和/或预防自身免疫疾病的药物，其活性成分为所述IL-17scfv/sTNFRI融合多肽。所述自身免疫疾病为类风湿关节炎。所述药物的疗效体现为涉及阻断类风湿关节炎的炎症反应。
[0013]本发明还保护所述融合蛋白在制备治疗和/或预防自身免疫疾病的药物中的应用。所述自身免疫疾病为类风湿关节炎。所述药物的疗效体现为涉及阻断类风湿关节炎的炎症反应。
[0014]本发明公开了一种治疗类风湿关节炎的双特异性多靶点多肽类药物，由抗人白介素-17( Interleukin-17)的单链抗体scFv与人可溶性肿瘤坏死因子受体I (soluble tumornecrosis factor receptor I)融合而成。本发明提供的融合多肽可有效地抑制胶原蛋白和多种前炎因子的表达，有效地缓解类风湿关节炎的临床症状，可通过直接应用或优化改造弥补目前临床使用的单靶点抗体药物或融合蛋白的不足，或取代现有抗体药物或融合蛋白，成为新一代多靶点融合蛋白药物，来提高对类风湿关节炎的治疗效果，对于类风湿关节炎的治疗具有重大应用价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为IL_17scfv/sTNFRI融合多肽的结构组成示意图。
[0016]图2为IL-17scfv/sTNFRI融合多肽同时结合抗原的Dot-blot结果。
[0017]图3为IL-17scfv/sTNFRI融合多肽阻断hTNF α生物学活性的ΜΤΤ结果。
[0018]图4为IL_17scfv/sTNFRI融合多肽阻断hIL-17产生IL-6的生物学活性Realtime PCR 结果。
[0019]图5为IL_17scfv/sTNFRI融合多肽阻断hIL-17产生IL-8的生物学活性Realtime PCR 结果。
[0020]图6为IL-17scfv/sTNFRI融合多肽对小鼠RA发病的影响。
[0021]图7为IL-17scfv/sTNFRI融合多肽对RA小鼠血清中CII抗体产生的影响。
[0022]图8为IL-17scfv/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子IL-1表达水平的影响。
图9为IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子IL-2表达水平的影响。 图10为IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子IL-6表达水平的影响。 图11为IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子IL-10表达水平的影响。 图12为IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子IL-17表达水平的影响。 图13为IL-17scfv/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子TNF α表达水平的影响。 图14为实验第49天的RA小鼠足部照片。

【具体实施方式】
[0023]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pET-27b (+)载体:Novagen，CB0471776。大肠杆菌 BL21 (DE3):TaKaRa 公司，9126。依那西普(sTNFR1-Fc):上海中信国健药业股份公司(上海，12.5mg/支)
实施例l、IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽的结构描述本发明提供的针对hIL-17和hTNF α的融合多肽命名为IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽，由A片段和B片段组成。A片段自上游至下游依次由抗人IL-17抗体的重链可变区(VH)、连接肽(GS linker)、抗人IL-17抗体的轻链可变区(VL)、位于CH1和CH2间的抗体铰链区(hinge reg1n)组成。A片段如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。B片段由可溶性肿瘤坏死因子受体I组成。B片段如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽的结构组成见图1。
[0024]实施例2、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽的制备
1、将序列表的序列2和序列4所示的双链DNA分子重叠PCR连接后，插入pET_27b (+)载体的多克隆位点，得到重组质粒。
[0025]2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌。
[0026]3、将步骤2得到的重组菌接种至含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37°C、120r/min 振荡培养至 0D6(l(lnm=0.5，加入 IPTG 并使其浓度为 0.5mmol/L, 37 V、120r/min 振荡培养4h，离心收集菌体。
[0027]4、取步骤3得到的菌体，超声破碎(20KHz、进行10个循环，每个循环中工作10秒停1秒)，离心(12000r/min，5min)收集沉淀(即包涵体)，用洗涤液(2M尿素溶液)洗涤后加入变性液(溶剂为水，含8M尿素、0.1M似&?04和0.01M Tris_HCl，pH=8.0)中，包涵体变性溶解，得到蛋白浓度为2.5mg/mL的变性溶液。
[0028]5、将2毫升步骤4得到的变性溶液逐滴加入50毫升复性液(溶剂为水，含2M尿素、
0.1M NaH2P04 和 0.01M Tris_HCl，pH=8.0冲，4°C静置孵育 12h，然后在 ρΗ7.4 的 PBS 缓冲液中透析，得到含有融合多肽的溶液，简称IL-17SCfV/STNFRI融合多肽溶液。
[0029]将本步骤制备的IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽溶液用于实施例3和实施例4，用生理盐水调整融合多肽的浓度(融合多肽的浓度以蛋白质的浓度计)。
[0030]实施例3、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽的生物学鉴定和阻断活性检测一、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽同时结合抗原的能力
将成熟的抗原蛋白hTNF α直接点在NC膜上(阴性对照为BSA)，封闭液(含5%脱脂奶粉)封闭2h，然后与封闭液稀释的IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽37°C孵育lh，PBST洗膜3次，每次lOmin ;再与封闭液稀释的成熟抗原蛋白h IL-17 (购自OriGene Technologies公司，LY400795)，37°C孵育lh，PBST洗膜3次，每次lOmin ;然后依次加入鼠抗人IL-17单抗(购自 eB1science 公司，14-7178)和羊抗鼠二抗(购自 LifeSpan B1Sciences 公司，LS-C60712-2000)。最后，ECL化学发光曝光。Dot-blot结果见图2，结果显示IL-17scfv/sTNFRI融合多肽具有同时结合hIL-17和hTNF α的能力。
[0031]二、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽阻断hTNF α生物学活性检测
取对数生长期的L929细胞，2.5g/L胰酶消化后用RPMI1640培养液调节细胞密度约为1.5X105/mL并接种于96孔细胞培养板上，每孔lOOyL。置于37°C，5% C02培养箱中培养
24h ;第2天预先将不同稀释度的IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽(浓度为100 μ g/mL，25 μ g/mL，6.25μ g/mL, 1.5625 μ g/mL)与等体积 100 μ g/mL TNFa 于4°C孵育2h，待细胞贴壁后吸出培养上清，加入100 μ L 11^-1780巧/8了,1?1融合多肽和了,0的混合物，并设IL_17scfv/sTNFRI融合多肽组(只加L929细胞和IL-17scfv/sTNFRI融合多肽)；TNFa组(只加入L929细胞和TNF a，未加入IL-17scfv/sTNFRI融合多肽)。每组设4个复孔；每孔再加入终浓度为1 mg/mL放线菌素D ;37°C、5% C02培养12?14h ;加入10 μ L/孔ΜΤΤ (5 mg/mL)，继续培养4h ;弃上清，每孔加入DMS0 100 μ L ;在490 nm波长下测定吸光度A值。 图3为IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽抑制TNFa对L929细胞的杀伤作用的MTT结果，结果显示IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽可以有效抑制TNFa对L929细胞的杀伤作用，并成剂量依赖性。
[0032]三、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽阻断hIL_17生物学活性的检测
在10%小牛血清(购自GIBC0公司)，链霉素100 U/mL,青霉素100 U/mL(均购自TaKaRa公司)，5% C02、37°C，饱和湿度条件下培养Hela细胞。当Hela细胞铺满单层时，分别向Hela细胞培养瓶中加入不同的刺激物。一瓶加入重组人IL-17成熟蛋白至50 yg/L，一瓶同时加入重组人IL-17成熟蛋白和IL-17sCfV/sTNFRI至终浓度均为50 μ g/L，一瓶加入IL-17scfv/sTNFRI至50 μ g/L，一瓶不加任何刺激物作为阴性对照。5% C02、37°C，饱和湿度条件下培养20 ho收集刺激后细胞，利用Trizol (购自Invitrogen公司)方法提取细胞总RNA，反转录成cDNA。利用Real time PCR方法检测各组IL_6、IL-8细胞因子的相对表达量。
[0033]图4、图5结果显示IL_17scfv/sTNFRI融合多肽可以中和hIL-17诱导的人Hela细胞产生细胞因子IL-6 (图4)和IL-8 (图5)的能力。该结果证明了 IL-17scfv/sTNFRI能很好的阻断hIL-17的生物学活性。
[0034]检测引物序列如下: β -actin:
上游引物:5 ’ GCCAAAAGGGTCATCATCTC 3，
下游引物:5，GGCCATCCACAGTCTTCT 3’
IL-6:
上游引物:5 ’ TTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCT 3，
下游引物:5’ GCTCTGGCTTGTTCCTCACTACT 3’
IL-8:
上游引物:5 ’ ACATACTCCAAACCTTTCCACC 3，
下游引物:5’ AAAACTTCTCCACAACCCTCTG 3’
实施例4、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽的应用 CII即鸡2型胶原:sigma公司，货号为9007-43-5。
[0035]本实施例中所采用的小鼠为6-8周龄的SPF级雄性昆明鼠:购自北京维通利华公司(动物合格证号:SCXK (京)2012-0001)。
[0036]将CII溶于0.lmol/L醋酸水溶液(4°C下搅拌使之充分溶解)，得到CII浓度为2g/L的CII溶液，4°C放置12小时后与弗氏完全佐剂等体积混合、乳化，得到CII乳剂(CII乳剂中CII浓度为lg/L)。
[0037]一、建立小鼠类风湿关节炎(RA)模型并分组给药
由于建立模型与分组给药为连续操作，从建立模型开始计实验天数。
[0038]1、建立小鼠RA模型
实验第1天，通过右后足肌肉注射的方式用CII乳剂免疫小鼠(每只小鼠免疫0.lmLCII乳剂，目的为致炎);实验第8天，通过背部皮下单点注射的方式用CII乳剂免疫小鼠(每只小鼠免疫0.lmL CII乳剂);实验第15-20天，观察小鼠并对小鼠的关节肿胀情况评分，总分为8±0.5范围内的小鼠为模型小鼠。
[0039]对小鼠每个足的评分标准如下:0分:无红肿；1分:小趾关节红肿；2分:趾关节和足趾肿胀；3分:踝关节以下的足爪肿；4分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。将小鼠四肢的评分相加，即为该小鼠的总分(最高为16分)。
[0040]2、从实验第21天开始，将模型小鼠分为5组(每组10只)，分别进行如下处理: IL-17scfv/sTNFRI融合多肽组:每2天通过腹腔注射的方式给予一次融合多肽(每次每千克小鼠给予20nmol IL-17scfv/sTNFRI融合多肽，每次每只小鼠的给药体积为100微升);
IL-1 β scfv/sTNFRI融合多肽组:每2天通过腹腔注射的方式给予一次融合多肽(每次每千克小鼠给予20nmol IL-1 β scfv/sTNFRI融合多肽，每次每只小鼠的给药体积为100微升);
IL-17 scfv组:每2天通过腹腔注射的方式给予一次IL-17 scfv单链抗体(每次每千克小鼠给予20nmol IL-17 scfv单链抗体,每次每只小鼠的给药体积为100微升)；
依那西普组:每2天通过腹腔注射的方式给予一次依那西普(每次每千克小鼠给予20nmol依那西普，每次每只小鼠的给药体积为100微升)；
CIA模型组:每2天给予一次生理盐水(每次每只小鼠的给药体积为100微升)；
同时设置正常组，由10只6-8周龄的SPF级雄性昆明鼠组成，不进行任何处理。
[0041]二、IL_17scfv/sTNFRI融合多肽对小鼠RA发病的影响
从实验第21天开始，每4天对小鼠的关节肿胀情况评分一次。结果见图6 (纵坐标代表总分，横坐标代表实验的第多少天；结果为各组小鼠的平均值；**代表与CIA模型组相比P < 0.01)。结果如图6表明，IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽对小鼠的多发性关节炎表征具有明显地抑制作用，效果优于单价抗体、IL-1 β scfv/sTNFRI和可溶性受体。
[0042]三、IL_17scfv/sTNFRI融合多肽对RA小鼠血清中CII抗体产生的影响实验第49天，通过眼球取血，检测小鼠血清中CII抗体水平。
[0043]1、将2g/L的CII溶液用PBS缓冲液稀释为5 μ g/mL的CII溶液。
[0044]2、用5 μ g/mL的CII溶液包被酶标板，100 μ L /孔，4°C过夜，弃上清。
[0045]3、完成步骤2后，封闭液(将lg脱脂乳溶解于20ml pH7.4的PBS缓冲液，现用现配)封闭酶标板，37 °C、2h，弃上清。
[0046]4、将待测血清样本用PBS缓冲液稀释至50倍体积后，加入完成步骤3的酶标板，每孔100μ 1，37°C孵育lh，用PBST缓冲液洗涤3次。
[0047]5、完成步骤4后，每孔加入100 μ 1羊抗鼠二抗(购自LifeSpan B1Sciences公司，LS-C60712-2000),37°C 孵育 lh，用 PBST 缓冲液(含体积比为 0.05% Tween20 的 ρΗ7.4 的PBS缓冲液)洗涤3次。
[0048]6、完成步骤5后，每孔加入100 μ L ΤΜΒ显色液,37 °C孵育5min,每孔加入50 μ L2mol/L硫酸终止反应，读取0D450nm值。
[0049]结果见图7，结果为各组小鼠的平均值；林代表与CIA模型组相比P < 0.01。CIA模型组小鼠血清中的CII抗体水平明显高于正常组。与CIA模型组相比，治疗组小鼠血清中的CII抗体水平均明显降低。IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽组小鼠血清中的CII抗体水平显著低于IL-17scfv组、IL-1 β scfv/sTNFRI组和依那西普组小鼠。
[0050]四、IL-17scfv/sTNFRI融合多肽对RA小鼠体内细胞因子表达水平的影响实验第49天，取小鼠脾脏，提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板，通过Realtime PCR (采用β-actin基因作为内参)检测各个细胞因子的相对表达量。
[0051]用于鉴定IL-1的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -CCATGGCACATTCTGTTCAAA-3'；
下游引物:5, -GCCCATCAGAGGCAAGGA-3'。
[0052]用于鉴定IL-2的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -GCACCCACTTCAAGCTCCA-3'；
下游引物:5' -AAAITTGAAGGTGAGCATCCTG-3'。
[0053]用于鉴定IL-6的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -ACAACCACGGCCTTCCCTACTT-3'；
下游引物:5, -CACGATTTCCCAGAGAACATGTG-3'。
[0054]用于鉴定IL-10的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -TGCCTTCAGCCAGGTGAAGACTTTC-3'；
下游引物:5' -CTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTCTG-3'。
[0055]用于鉴定IL-17的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -GGACTCTCCACCGCAATGA-3'；
下游引物:5, -GACCAGGATCTCTTGCTGGA-3'。
[0056]用于鉴定TNF-α的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -GGAAACCCAGAGGCATTGAC-3'；
下游引物:5, -TCAGGATCTGGCCCTTGAAC-3'。
[0057]用于鉴定β-actin内参基因的相对表达量的引物如下:
上游引物:5' -GAGACCTTCAACCCC-3'；
下游引物:5, -GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3'。
[0058]结果见图8-13，结果显示，与CIA模型组相比，IL_17scfv/sTNFRI融合多肽组、IL-17scfv组、IL-Ιβ scfv/sTNFRI融合多肽组、依那西普组小鼠脾脏中的IL-1(图8)、IL_2(图9)、IL-6 (图10)、IL-17 (图12)和TNFa (图13)的表达水平均显著降低，而IL-10(图11)的表达水平均显著升高，IL-17scfv/sTNFRI融合多肽组的降低或升高幅度最大，即IL-17scfv/sTNFRI融合多肽的治疗效果优于IL_17scfv、IL-1 β scfv/sTNFRI和依那西普，达到差异显著。结果为各组小鼠的平均值代表与CIA模型组相比P < 0.01 ；#代表与IL-17scfv 组、IL-1 β scfv/sTNFRI 组和依那西普组相比 P < 0.05。
[0059]五、小鼠临床症状的监测
正常组小鼠在试验期间四肢的各关节无红肿现象，行动灵活自如。模型组小鼠在首次免疫后10d左右，出现足跖部皮肤充血，足垫升高；12?16d后足踝、趾关节肿胀明显，足趾呈鼓棰状；第21d左右整个后足，包括踝关节在内的肿胀更为明显，皮肤紧绷，后足皮肤表面充血，无法负重，RA模型造模成功。IL-17sCfV/sTNFRI融合多肽及各治疗组，典型关节炎症状减轻，IL-17scfv/sTNFRI融合多肽较IL-1 β scfv/sTNFRI融合多肽、IL_17scfv和依那西普治疗效果明显。结果见图14，该融合多肽对小鼠类风湿关节炎有显著的治疗作用。
【权利要求】
1.一种融合多肽，由A片段和B片段组成； 所述A片段为如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质； 所述B片段为如下(C)或(d): (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
2.DNA组合物，由编码权利要求1中的所述A片段的DNA分子甲和编码权利要求1中的所述B片段的DNA分子乙组成。
3.如权利要求2所述的DNA组合物，其特征在于: 所述DNA分子甲为如下(I)或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码所述A片段的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述A片段的DNA分子； 所述DNA分子乙为如下(4)或(5)或(6)的DNA分子: (4)序列表中序列4所示的DNA分子； (5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码所述B片段的DNA分子； (6)与(4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述B片段的DNA分子。
4.质粒组合物，由含有权利要求2或3中的所述DNA分子甲的重组质粒甲和含有权利要求2或3中的所述DNA分子乙的重组质粒乙组成。
5.一种用于治疗和/或预防自身免疫疾病的药物，其活性成分为权利要求1所述的融合多肽，其特征在于:通过抗体的铰链区将抗人IL-17单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体I相连接构成的双特异性多靶点融合多肽，即IL-17sCfV/sTNFRI，能同时结合人白介素-17和人肿瘤坏死因子α。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于:所述自身免疫疾病为类风湿关节炎。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于:所述药物的疗效体现为涉及阻断类风湿关节炎的炎症反应。
8.如权利要求1所述的融合多肽在制备治疗和/或预防自身免疫疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于:所述自身免疫疾病为类风湿关节炎。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于:所述药物的疗效体现为涉及阻断类风湿关节炎的炎症反应。
【文档编号】A61P29/00GK104311670SQ201410162984
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】李德山, 任桂萍, 阚方明, 韩晓辉 申请人:哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司