一种自然杀伤t细胞活化剂多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及药物领域，具体涉及具有活化自然杀伤T细胞，抑制肿瘤坏死因子释放酶、具有减轻急性炎症反应对机体破坏的多肽。其序列为FRQSFQKVLCLRKGS是全新的序列，在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。
【专利说明】一种自然杀伤T细胞活化剂多肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及自然杀伤T细胞活化剂及其应用，具体涉及具有活化自然杀伤T细胞，治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。
【背景技术】
[0002]急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其它器官中发现。急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3岁至7岁之间。ALL也可发生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年来随着医学研究的深入，对急性淋巴细胞性白血病的认识和治疗取得了很大进展。生物靶向治疗肿瘤是非常有前景的，靶向治疗是阻断肿瘤发生的某个过程，达到治疗肿瘤的目的。
[0003]自然杀伤T (natural killer T cells, NKT)细胞是一种具有特定标志的T细胞亚群，既表达T细胞表面标志，如CD3、TCRaB (人类表达Va24 Vfill，小鼠表达Val4 Jal8)，又表达NK细胞的表面标志。NKT细胞只能识别由⑶Id分子递呈的特异性糖脂类分子，而不是由主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)递呈的多肽。NKT细胞活化后可迅速分泌一系列的细胞坏死相关因子，如穿孔素和TNF-α，增强其杀伤肿瘤细胞的作用；还可通过激活其他具有杀伤活性的效应细胞，如NK细胞和CD8 +细胞，发挥抗肿瘤作用。
[0004]因此，活 化自然杀伤T细胞，抑制急性淋巴细胞性白血病发展，是治疗急性淋巴细胞性白血病的新靶点。但是，尚未有开发成熟的自然杀伤T细胞活化剂多肽的治疗急性淋巴细胞性白血病的药物。
[0005]本专利中的自然杀伤T细胞活化剂多肽已证明在急性淋巴细胞性白血病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。
【发明内容】
[0006]发明目的
本发明提供全新的序列，该序列自然杀伤T细胞活化剂，对急性淋巴细胞白血病具有很好的疗效。
[0007]技术方案
自然杀伤T细胞活化剂，其特征在于其序列为FRQSFQKVLCLRKGS。
[0008]自然杀伤T细胞活化剂在制备治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。
[0009]有益效果
利用固相合成法化学合成自然杀伤T细胞活化剂，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外活化自然杀伤T细胞，治疗急性淋巴细胞白血病。在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。【具体实施方式】
[0010]本发明涉及多肽由吉尔生化(上海)合成。
[0011]实施例1
多肽的化学合成方法
多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质(可在AdvancedChemTech公司购得)上有自由氨基，顺序连接氨基酸。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt7DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(4:1:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10 min0每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。
[0012]应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为FRQSFQKVLCLRKGS，该序列为全新序列。
[0013]实施例2 自然杀伤T细胞活化剂I对体外培养肿瘤细胞的生长和存活IC50。
[0014]采用MTT比色法。将对数生长的U937细胞，以1.0X 105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物自然杀伤T细胞活化剂I和阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h，分别在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式肿瘤细胞生长抑制率=(1_实验组吸光值/对照组吸光值)X 100%。计算出实验药物的IC50为5.77 μ M0
[0015]实施例3
用内毒素休克模型检测自然杀伤T细胞活化剂I的体内活力
在建立内毒素休克模型之前，我们首先测定了 LPS(E.coli 0111:B4，sigma公司购买)小白鼠的LD50为50 μg每只小鼠，在实验中我们采用了 100 μg每只小鼠，这样，对照组的小鼠可全部死亡。在我们前面的科研工作中，发现Regas印in2 (另外一条多肽抑制剂，已公开)可提高C57BL/6小鼠在内毒素休克过程中的生存率。为了在我们的小白鼠上建立内毒素休克模型，我们用Regas印in2做了一个阳性对照实验。对照组小鼠注射100 μg LPS，而Regasepin2实验组的小鼠在注射LPS 5分钟之后,每只小鼠再注射0.7 mg的多肽。通过制作Kaplan-Meier生存曲线发现Regasepin2可有效的保护注射了 100 Pg的小鼠,提高了生存率。成功地在小白鼠上建立内毒素休克模型之后，用该模型检测自然杀伤T细胞活化剂I的体内活力。对照组小鼠(12只)注射100 Pg LPS，而自然杀伤T细胞活化剂I组小鼠(12只)在注射LPS 5 min后，每只小鼠注射0.7 mg自然杀伤T细胞活化剂I。用Kaplan-Meier生存曲线分析，自然杀伤T细胞活化剂I可有效地保护小白鼠，提高内毒素休克小鼠的生存率。
[0016]实施例4
整合素阻断剂多肽1、多肽II和多肽III对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤生长抑制试验取生长旺盛期的瘤组织在无菌条件下碾磨，制备成I X 17个/ml细胞悬液，以0.1 ml接种于小鼠右侧腋部皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察整合素阻断剂多肽对受试动物肿瘤的抑制效果。肿瘤直径的测量次数为每2天I次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组左侧腋部皮下注射多肽，阴性组同时给等量生理盐水，给药14 d，其中环磷酰胺隔天皮下给药一次，紫杉醇组每3天皮下给药一次，多肽低剂量一天给药两次组一天给两次，其它各组一天给药一次。治疗14 d后,小鼠处死,手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为:
TV = l/2XaXb2
其中a、b分别表示长宽。
[0017]根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume, RTV),计算公式为:RTV = Vt/V0O其中Vtl为分笼给药时(即(Ici)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C (%)，计算公式如下:
【权利要求】
1.自然杀伤T细胞活化剂1，其特征在于其序列为FRQSFQKVLCLRKGS。
2.一种药物组合物，其特征在于其包含如权利要求1所述多肽与一种以上药学上可接受的赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。
4.如权利要求1所述的剂多肽，其特征在于有效剂量为10mg/kg。
5.如权利要求1所述的自然杀伤T细胞活化剂I在制备、治疗急性淋巴细胞性白血病药物中的 应用。
【文档编号】A61K38/10GK104031126SQ201410295889
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】罗瑞雪 申请人:苏州普罗达生物科技有限公司