固相化的癌症靶标亲和柱、其制备和筛选方法及活性成分的制作方法
【专利摘要】固相化的癌症靶标亲和柱、其制备和筛选方法及活性成分。所述固相化的癌症靶标用于从天然药物中筛选潜在的抗癌症活性成分。所述癌症靶标为VEGF165蛋白质或碱性成纤维细胞生长因子。所述亲和柱为琼脂糖凝胶亲和柱。制备固相化的癌症靶标亲和柱的方法包括：琼脂糖凝胶装柱，并冲洗；将含所述癌症靶标的溶液加入所述凝胶柱中，固相化过夜制成亲和柱；固相化后，放出所述癌症靶标溶液，封闭所述亲和柱；洗涤所述亲和柱。固相化VEGF165琼脂糖凝胶能够从天然药物中筛选与VEGF165相互作用的潜在抗癌症有效成分。所述方法也适用于利用其他靶向分子筛选天然药物的功效成分。所述方法为从天然药物中筛选抗癌有效成分节约了时间和资金。
【专利说明】固相化的癌症靶标亲和柱、其制备和筛选方法及活性成分
【技术领域】
[0001]本申请涉及固相化的癌症靶标亲和柱、其制备方法和筛选方法及活性成分。
【背景技术】
[0002]肿瘤生成和转移受诸多因素的影响和制约，血管形成是其主要的因素之一。肿瘤血管形成是一个极为复杂的过程，需要一系列的调节因子发挥作用，其中作用最明确、研究最充分、备受重视的是VEGF。VEGF对肿瘤的影响机制可能有:1)促进肿瘤血管形成；2)促进肿瘤淋巴管生长；3)对肿瘤细胞的细胞动力影响；4)增强肿瘤细胞对放疗的耐受性及影响免疫功能。
[0003]VEGF是肿瘤血管生成的关键调控者，也是唯一表达于整个肿瘤生命周期的血管生成因子。把VEGF作为一种靶分子研制开发其拮抗剂，达到抑制肿瘤血管的新生、切断肿瘤血供、抑制肿瘤生长、发展及转移的目的，为肿瘤的治疗提供了一种新手段。当前，针对VEGF的肿瘤生物治疗已取得相当大的成绩。2004年2月26日，美国FDA批准了 Genentech的贝伐珠单抗Bevacizumab (安维汀，Avastin), 一种抗VEGF的重组人源化单克隆抗体,用于治疗结直肠癌等。这是美国第一个获得批准上市、唯一在临床上使用的抗肿瘤血管再生药物，经体内、体外检测系统证实，Avastin能够同人类VEGF结合并阻断其生物活性，抗血管生成作用明显。图1显示了 Avastin结合人类VEGF并阻断其生物活性，在正常情况下，血管生成主要通过VEGF和VEGFR-2的相互作用而介导；而Avastin可在胞外抑制VEGF，所以可抑制血管生成而不干扰VEGF通路以外的靶点。Avastin与标准化疗联用作为结肠直肠癌的一线、二线用药以及肺癌联合治疗的一线用药，在转移性结肠直肠癌、肺癌等治疗时的标准化疗联用效果显示可改善患者生存率。2006年，FDA批准了 Genentech的另一个抗VEGF的重组人源单克隆抗体药物-Ranibizumab(Lucentis)上市,用于治疗老年性黄斑病变和结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌。2011年，FDA批准了 Sanofi和Regeneron合作的针对VEGF的新药-Afliberc^pt (VEGF Trap)，是一个由针对VEGF的人源单克隆抗体和VEGF受体I和2胞外部分组成的嵌合体(Chimera)，用于治疗一种老年性由血管生长异常导致的失明(Wetage-related macular degenerat1n,wet AMD)。同时，这个嵌合体已进入治疗肠癌和前列腺癌的三期临床研究。
[0004]因此，只要能够结合VEGF、抑制VEGF诱导的血管发生就能有效地控制癌症的转移和扩散。把VEGF作为一种靶向分子从天然药物中筛选能够与其相互作用的成分，有望筛选到其中的抗癌有效成分，对于研究天然药物的抗癌机理具有十分重要的意义，可以使天然药物的药理研究更加具有目的性，大大缩短新药的研发时间，加快新药的开发，减低新药的研发成本。
[0005]应明确指出的是，虽然上述内容在“【背景技术】”的标题下描述，但是并不代表 申请人:承认上述内容全部为现有技术。相反，为了引出本发明的
【发明内容】
，加入了发明人的分析和引申，因此这一部分不应被简单地视为现有技术。
【发明内容】
[0006]本发明中将明确参与癌症扩散过程的癌症靶标固相化到琼脂糖凝胶柱上制成亲和柱，从天然药物中捕捉能够与所述癌症靶标相互作用的化合物，为从天然药物中筛选潜在的抗癌有效成分大大地节约了时间和资金。
[0007]本发明的一个方面涉及制备固相化的癌症靶标亲和柱的方法，所述方法包括:琼脂糖凝胶装柱；将含所述癌症靶标的溶液加入所述凝胶柱中，固相化过夜制成亲和柱；固相化后，放出所述癌症靶标溶液，封闭所述亲和柱；洗涤所述亲和柱。
[0008]所述癌症革巴标可为VEGF165蛋白质。
[0009]所述亲和柱可为琼脂糖凝胶亲和柱。
[0010]在一个实施方式中，所述琼脂糖凝胶亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且每毫升所述NHS活化的琼脂糖凝胶上固相化的VEGF165的含量大于等于0.5mg0
[0011]本发明的另一个方面涉及使用上述方法制备的固相化的癌症靶标亲和柱。
[0012]所述癌症靶标可为VEGF165蛋白质。
[0013]所述亲和柱可为琼脂糖凝胶亲和柱。
[0014]在一个实施方式中，所述琼脂糖凝胶亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且每毫升所述NHS活化的琼脂糖凝胶上固相化的VEGF165的含量大于等于0.5mg0
[0015]本发明的另一个方面涉及利用固相化的癌症靶标从天然药物中筛选潜在的抗癌症活性成分的方法，其中，使用所述固相化的癌症靶标亲和柱进行筛选。
[0016]所述癌症革巴标可为VEGF165蛋白质。
[0017]所述亲和柱可为琼脂糖凝胶亲和柱。
[0018]在一个实施方式中，所述琼脂糖凝胶亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且每毫升所述NHS活化的琼脂糖凝胶上固相化的VEGF165的含量大于等于0.5mg0
[0019]本发明的另一个方面涉及使用上述方法从天然药物中筛选的潜在的抗癌症活性成分。
[0020]在一个实施方式中，所述天然药物为蟾酥液，所述亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且所述抗癌症活性成分在HPLC检测中的保留时间为4.473分钟。
[0021]在一个实施方式中，所述天然药物为三叶青，所述亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且所述抗癌症活性成分在HPLC检测中的保留时间为15.311分钟。
[0022]在一个实施方式中，所述天然药物为三叶青，所述亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为碱性成纤维细胞生长因子，并且所述抗癌症活性成分在HPLC检测中的保留时间为17.499分钟。
[0023]本发明所描述的方法也适用于利用其他靶向分子，例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，筛选天然药物的功效成分。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1显示了 Avastin结合人类VEGF并阻断其生物活性；
[0025]图2为不同浓度的VEGF165固相化效果的SDS-PAGE检测；
[0026]图3为Iml固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱纯化VEGF165兔多抗的SDS-PAGE检测；
[0027]图4为固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱纯化抗体的能力；
[0028]图5为环氧活化琼脂糖凝胶固相化VEGF165前后的蛋白检测；
[0029]图6为Iml固相化VEGF165环氧活化琼脂糖凝胶亲和柱纯化VEGF165兔多抗的SDS-PAGE 检测；
[0030]图7为蟾酥液中与不同靶向分子相互作用成分的HPLC检测；
[0031]图8为三叶青中与不同靶向分子相互作用成分的HPLC检测。
【具体实施方式】
[0032]一、VEGF165蛋白的固相化
[0033]1、称取 0.05mg rh_VEGF165 蛋白冻干粉，用 Iml 的 20mM PBS(pH8.0)溶解；
[0034]2、取Iml NHS活化琼脂糖凝胶装入3ml层析空柱中，用ImM HCl冲洗10个柱体积；
[0035]3、将VEGF165蛋白溶液加入到上述NHS活化琼脂糖凝胶中，放出1/5体积的液体以除去HCl，4°C固相化过夜制成亲和柱；
[0036]4、固相化结束后，将蛋白溶液放出并收集待检，向VEGF165亲和柱中加入Iml含有
0.5M NaCl 的 0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)，室温封闭 4h ；
[0037]5、依次用5倍柱体积的去离子水、含有0.5M NaCl的0.1M柠檬酸(pH4.0)、去离子水、含有0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)和去离子水充分洗涤VEGF165亲和柱；
[0038]6、将上述固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱在4?8°C条件下保存在20%乙醇中；
[0039]7、另分别称取0.1mg,0.25mg、0.5mg和L 5mg的rh_VEGF165蛋白冻干粉溶解于Iml的20mM PBS(pH8.0)后按照上述步骤分别固相化不同蛋白含量的VEGF165，NHS活化琼脂糖凝胶固相化不含任何蛋白的lml20mM PBS (pH8.0)作为阴性对照；
[0040]对步骤I中的VEGF165蛋白溶液同步骤4中收集的VEGF165固相化后蛋白溶液进行蛋白质浓度测定和SDS-PAGE凝胶电泳检测，分析NHS活化琼脂糖凝胶固相化不同浓度的VEGF165蛋白的效果，结果见表I和图2。
[0041]表1、NHS活化琼脂糖凝胶固相化不同浓度VEGF165的效果
[0042]
I固相化前VEGF165总量(mg) |固相化后VEGF165总量(mg)~|固相化效率亲和柱I bO0%
亲和柱 2 0.050.04794% 亲和柱 3Ιο.1Ιο.095[95%
亲和柱 40.250.24096%
亲和柱 50.50.48797.4%
亲和柱 61.51.46497.6%
[0043]图2为不同浓度的VEGF165固相化效果的SDS-PAGE检测，其中，M为蛋白质分子量标准(纽龙生物)，泳道I为Omg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道2为Omg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液,泳道3为0.05mg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道4为0.05mg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液，泳道5为0.lmg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道6为0.lmg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液，泳道7为0.25mg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道8为0.25mg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液，泳道9为0.5mg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道10为0.5mg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液，泳道11为1.5mg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道12为1.5mg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液。
[0044]从表I和图2可以看出，不同浓度的VEGF165蛋白有94%及其以上都能固相化到NHS活化琼脂糖凝胶上。VEGF165蛋白总量为0.5mg和1.5mg时固相化到NHS活化琼脂糖凝胶上的固相化效率相当。
[0045]二、固相化VEGF165结合其抗体能力的检测
[0046]Ulml固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱用20mM PBS(pH7.4)平衡5?10个柱体积；
[0047]2、取Iml VEGF兔多抗血清用20mM PBS (pH7.4)稀释10倍，然后加载到VEGF165亲和柱上；
[0048]3、用20mM PBS (pH7.4)淋洗5个柱体积平衡VEGF165亲和柱；
[0049]4、用10mM甘氨酸-HCl (pH2.7)洗脱4个柱体积并收集抗体洗脱液；
[0050]5、用去离子水清洗VEGF165亲和柱5?10个柱体积；
[0051]6、对纯化获得的VEGF兔多抗进行蛋白质浓度测定和SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见表2和图3。
[0052]表2、Iml VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱纯化VEGF165兔多抗的能力
[0053]
FlI纯化的抗体(mg)
亲和柱I O
亲和柱2 0.026
亲和柱3 0.067
亲和柱4 0.114
亲和柱5 ?ΤΤθ
亲和柱6 [026
[0054]图3为Iml固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱纯化VEGF165兔多抗的SDS-PAGE检测。其中，M为蛋白质分子量标准(纽龙生物)，泳道I为VEGF165兔多抗上柱前血清，泳道2为血清穿透，泳道3为亲和柱I纯化的VEGF165兔多抗，泳道4为亲和柱2纯化的VEGF165兔多抗，泳道5为亲和柱3纯化的VEGF165兔多抗，泳道6为亲和柱4纯化的VEGF165兔多抗，泳道7为亲和柱5纯化的VEGF165兔多抗，泳道8为亲和柱6纯化的VEGF165兔多抗。
[0055]图4显示了固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱纯化抗体的能力，被固相化到NHS活化琼脂糖凝胶上的VEGF165保持了亲和结合其抗体的能力，并且这种能力从VEGF165固相化量达到0.5mg时开始逐渐呈现饱和的趋势。考虑到VEGF165的成本，故Iml NHS活化琼脂糖凝胶选择固相化多于0.5mg的VEGF165来制备VEGF165亲和柱。
[0056]三、固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱再生
[0057]1、VEGF165亲和柱在使用后先用10mM甘氨酸-HCl (pH2.7)清洗4个柱体积；
[0058]2、用去离子水清洗5个柱体积；
[0059]3、然后用20%乙醇清洗5个柱体积；
[0060]4、最后用70%乙醇清洗5?10个柱体积；
[0061]5、再生后的VEGF165亲和柱在4?8°C条件下保存于20%乙醇中。
[0062]四、不同方式固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱的制备及其抗体纯化效果检测
[0063]1、称取0.5mg rh_VEGF165蛋白冻干粉，用Iml的碳酸钠溶液溶解；
[0064]2、取Iml环氧活化琼脂糖凝胶装入3ml层析空柱中，用水冲洗10个柱体积；
[0065]3、将VEGF165蛋白溶液加入到上述环氧活化琼脂糖凝胶中，37°C固相化过夜；
[0066]4、固相化结束后，将偶联后蛋白溶液放出并收集待检，向VEGF165环氧活化琼脂糖凝胶亲和柱中加入Iml的IM乙醇胺，37°C封闭4h ；
[0067]5、依次用5倍柱体积的去离子水、含有0.5M NaCl的0.1M乙酸-乙酸钠(ρΗ4.0)、去离子水、含有0.5Μ NaCl的0.1M硼酸-四硼酸钠(ρΗ8.0)和去离子水充分洗涤VEGF165环氧活化琼脂糖凝胶亲和柱；
[0068]6、VEGF165环氧活化琼脂糖凝胶亲和柱在4?8°C条件下保存于20%乙醇中；
[0069]7、对步骤I中的VEGF165蛋白溶液同步骤4中收集的VEGF165固相化后蛋白溶液进行蛋白质浓度测定和SDS-PAGE凝胶电泳检测，分析环氧活化琼脂糖凝胶固相化VEGF165蛋白的效果，结果见表3和图5 ；
[0070]8、VEGF165环氧活化琼脂糖凝胶亲和柱的纯化效果检测步骤参见VEGF165的NHS活化琼脂糖凝胶亲和柱纯化效果检测，结果见表3和图6。
[0071]表3、Iml不同方式固相化的VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱比较
[0072]
序号活化方式固相^/?(^5固相化^ VEGF挪固相化效纯化的抗体(mg)
总量(mg)总量(mg)β
亲和柱 5 NHS 活化0.50.48797.4%0.19
亲和柱7 环氧活化0.50.13627 2°/0.03
[0073]图5为环氧活化琼脂糖凝胶固相化VEGF165前后的蛋白检测，其中，M为蛋白质分子量标准(纽龙生物)，泳道I为0.5mg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道2为0.5mg/ml VEGF165固相化后蛋白溶液，泳道3为Omg/ml的VEGF165蛋白溶液，泳道4为Omg/mlVEGF165固相化后蛋白溶液。
[0074]图6为Iml固相化VEGF165环氧活化琼脂糖凝胶亲和柱纯化VEGF165兔多抗的SDS-PAGE检测，其中，M为蛋白质分子量标准(纽龙生物)，泳道I为VEGF165兔多抗上柱前血清，泳道2为血清穿透，泳道3为亲和柱I纯化的VEGF165兔多抗，泳道4为亲和柱7纯化的VEGF165兔多抗。
[0075]结论:从表3可以看出，同样量的VEGF165蛋白通过环氧活化方式固相化，仅有27.2%偶联到琼脂糖凝胶上，且固相化后的亲和柱纯化抗体的能力较低。VEGF165蛋白通过NHS活化方式固相化，有97.4%的蛋白偶联到琼脂糖凝胶上，纯化抗体的能力是环氧活化方式的6倍以上，故选择通过NHS活化方式将VEGF165蛋白固相化到琼脂糖凝胶上制备VEGF165亲和柱。
[0076]五、NHS活化方式固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱从蟾酥液中筛选与其相互作用的成分
[0077]蟾酥液注射剂是国家药监局批准用于临床治疗癌症患者的生物制剂，但是其治疗癌症的有效成分不明，本发明选择蟾酥液用于验证固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱从天然药物中筛选与VEGF165相互作用成分这一方法的可行性。
[0078]参考NHS活化方式固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱纯化抗体的步骤，用NHS活化方式固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱从蟾酥液中筛选与VEGF165具有相互作用的活性成分。同时使用与固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱相同方式制备的固相化bFGF (碱性成纤维细胞生长因子,Human fibroblast growth factor-basic)琼脂糖凝胶亲和柱和固相化HSA (人血清白蛋白，Human serum albumin)琼脂糖凝胶亲和柱作为对照。
[0079]Ulml NHS活化方式固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱用20mM PBS(pH7.4)平衡5?10个柱体积；
[0080]2、取Iml蟾酥液用20mM PBS (pH7.4)稀释10倍，然后加载到VEGF165亲和柱上；
[0081]3、用20mM PBS (pH7.4)淋洗5个柱体积平衡VEGF165亲和柱；
[0082]4、用10mM甘氨酸-HCl (pH2.7)洗脱4个柱体积并收集抗体洗脱液；
[0083]5、用去离子水清洗VEGF165亲和柱5?10个柱体积；
[0084]6、用bFGF亲和柱从蟾酥液中分离与其结合的活性成分的步骤同上述步骤I?5 ;
[0085]7、用HSA亲和柱从蟾酥液中分离与其结合的活性成分的步骤同上述步骤I?5 ;
[0086]8、对分别用VEGF165亲和柱、bFGF亲和柱和HSA亲和柱从蟾酥液中筛选出的分别能够与VEGF165、bFGF和HSA相互作用的成分进行HPLC分析，分析条件如下，结果如图7:
[0087]色谱系统:Agilentl260
[0088]色谱柱:VenusilMP C18 柱(Agela Technologies), 4.6 X 250mm, 5 μ m, 100A
[0089]流动相:I %磷酸溶液:乙腈=3:97
[0090]洗脱时间:1min
[0091]检测波长:21nm
[0092]流速:lml/min
[0093]柱温:25°C
[0094]进样体积:20ul
[0095]与VEGF互作成分的保留时间:4.473min。
[0096]图7为蟾酥液中与不同靶向分子相互作用成分的HPLC检测。图7中，箭头表示蟾酥液中含有能够与VEGF165相互作用的成分，而该成分却无法与bFGF或者HSA相互作用。
[0097]六、NHS活化方式固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱从三叶青中筛选与其相互作用的成分
[0098]三叶青是一种在临床上被证明具有治疗癌症功效的天然中药资源。在120例癌症病人的临床研究中，其治疗癌症的有效率达到74%，但其有效成分不明。本发明选择三叶青用于验证固相化VEGF165琼脂糖凝胶亲和柱从天然药物中筛选与VEGF165相互作用成分这一方法的可行性。
[0099]整个过程操作同“五、VEGF165的NHS活化琼脂糖凝胶亲和柱从蟾酥液中筛选与其结合的活性成分”相同。
[0100]对分别用VEGF165亲和柱、bFGF亲和柱和HSA亲和柱从三叶青中筛选出的分别能够与VEGF165、bFGF和HSA相互作用的成分进行HPLC分析，分析条件如下，结果如图8:
[0101]色谱系统:Agilentl260
[0102]色谱柱:VenusilMP C18 柱(Agela Technologies), 4.6 X 250mm, 5 μ m, 100Α
[0103]流动相:梯度洗脱，5%?30%乙腈冰
[0104]洗脱时间:20min
[0105]检测波长:21nm
[0106]流速:lml/min
[0107]柱温:25°C
[0108]进样体积:20ul
[0109]与VEGF互作成分的保留时间:15.31 Imin
[0110]与bFGF互作成分的保留时间:17.499min
[0111]图8为三叶青中与不同靶向分子相互作用成分的HPLC检测。图8中，VEGF柱子中的箭头表示三叶青中含有能够与VEGF165特异性相互作用的成分，但该成份无法同bFGF或者HSA相互作用；bFGF柱中箭头表示三叶青中含有能够与bFGF特异性相互作用的另一种成分，但该成分无法同VEGF或者HAS相互作用。
[0112]本发明中将明确参与癌症扩散过程的靶向分子VEGF165固相化到琼脂糖凝胶上，从天然药物中筛选能够与VEGF165相互作用的化合物，为从天然药物中筛选抗癌有效成分大大地节约了时间和资金。本发明所描述的方法也适用于利用其他靶向分子(例如bFGF)筛选天然药物中与靶向分子相互作用的成分。
【权利要求】
1.一种制备固相化的癌症靶标亲和柱的方法，所述方法包括: 琼脂糖凝胶装柱； 将含所述癌症靶标的溶液加入所述凝胶柱中，固相化过夜制成亲和柱； 固相化后，放出所述癌症靶标溶液，封闭所述亲和柱； 洗涤所述亲和柱。
2.如权利要求1所述的制备固相化的癌症靶标亲和柱的方法，其中，所述亲和柱为琼脂糖凝胶亲和柱。
3.如权利要求1所述的制备固相化的癌症靶标亲和柱的方法，其中，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质或碱性成纤维细胞生长因子。
4.如权利要求1所述的制备固相化的癌症靶标亲和柱的方法，其中，所述琼脂糖凝胶亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且每毫升的所述NHS活化的琼脂糖凝胶上固相化的VEGF165的含量大于等于0.5mg。
5.—种固相化的癌症靶标亲和柱，用权利要求1?4的任一项所述的方法制备。
6.一种利用固相化的癌症靶标从天然药物中筛选潜在的抗癌症活性成分的方法，其中，使用权利要求5所述的固相化的癌症靶标亲和柱进行筛选。
7.一种从天然药物中筛选的潜在的抗癌症活性成分，其中，使用权利要求6所述的方法进行筛选。
8.如权利要求7所述的潜在的抗癌症活性成分，其中，所述天然药物为蟾酥液，所述亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且所述抗癌症活性成分在HPLC检测中的保留时间为4.473分钟。
9.如权利要求7所述的潜在的抗癌症活性成分，其中，所述天然药物为三叶青，所述亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为VEGF165蛋白质，并且所述抗癌症活性成分在HPLC检测中的保留时间为15.311分钟。
10.如权利要求7所述的潜在的抗癌症活性成分，其中，所述天然药物为三叶青，所述亲和柱为NHS活化的琼脂糖凝胶亲和柱，所述癌症靶标为碱性成纤维细胞生长因子，并且所述抗癌症活性成分在HPLC检测中的保留时间为17.499分钟。
【文档编号】A61K36/48GK104128019SQ201410310277
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】钱永常 申请人:杭州纽龙日尚生物制品有限公司