一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能与GLP-1R特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋白。这些融合蛋白质可以高效地与人GLP-1R受体结合并激活受体信号通道，可以被用于糖尿病，超重，肥胖，及其相关病症的治疗。
【专利说明】—种能与GLP-1R特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋白质
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗体【技术领域】，特别涉及一种能与GLP-1R特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋白质。
【背景技术】
[0002]II型糖尿病的典型症状包括以下三个方面:1)外周胰岛素抵抗，主要是骨骼和肌肉对胰岛素的应激度下降，导致对这些组织的葡萄糖输出受到影响(Kahn and Goldfine,J Diabetes Complicat1n (1993)7:92-105 ；ffeyer 等，J Clin Invest.(1999)104:787-794) ；2)过度的肝脏葡萄糖生成，肝脏细胞对胰岛素的调节应激降低(Kahnand Goldfine, J Diabetes Complicat1n.(1993) 7:92-105 ；Lam 等，Am J Phys1lEndocrinol Metab.(2009) 11:375-378)和膜高血糖素的过度分泌(Unger and Orci,Arch Intern Med.(1977) 137:482-491) ;3)膜岛 beta 细胞失调，在疾病早期，beta 细胞的增殖和胰岛素分泌量增加代偿性弥补胰岛素抵抗对血糖的影响(Bonner-Weir, TrendsEndocrinol Metab.(2000)11:375-378),但随着时间和胰岛素抵抗程度的增加导致beta细胞耗竭，胰岛素分泌随之下降导致了 II型糖尿病的真正始发(DeFronzo, Diabetes.(1988) 37:667-687; Kahn 等，J Nutr.(2001) 131:354S-360S)。
[0003]胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是一个包含有30个氨基酸的肽段。它由肠道内L细胞分泌来应激葡萄糖的摄入(Orskov等，Diabetes (1994) 43:535-539; Drucker等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1987) 84: 3431-3438)。其应激分泌后，GLP-1 和胰腺上的GLP-1R (胰高血糖素样肽-1受体)结合激活下游腺苷酸环化酶信号通路来促进胰岛素的合成与分泌。GLP-1分泌还会减少胃排空，以此来减少食物消化后进入循环系统的葡萄糖的量(Wettergren 等，Dig.Dis.Sc1.(1993) 38:665_673)。在小鼠以及 I 型和 II 型糖尿病患者中，GLP-1增加了胰岛素的分泌降低血糖浓度(Nauck等，Diabetes.(1997)105:187-195; Todd 等，Eur J Clin Invest.(1997) 27:533-536)。有研究显示，GLP-1还能够抑制胰腺beta细胞的凋亡，促进其增殖(Perfetti等，Endocrinology (2000)141:4600-4605 ；Hui 等，Endocrinology (2003) 144:1444-1455)。临床已经证实了GLP-1在治疗糖尿病病人上的可行性和效果(Samson and Garber, Curr Opin EndocrinolDiabetes Obes.(2013) 20:87-97)，也已经有专利(U.S Pat.No 5，899，883，U.S.Pat.N0.6，989，148)叙述了使用GLP-1及其衍生物来治疗糖尿病的方法。但是GLP-1在体内半衰期较短，治疗效果不佳。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供一种能与GLP-1R特异性结合的抗体。
[0005]本发明的目的之二在于提供一种能与GLP-1R特异性结合的抗体与GLP-1形成的融合蛋白质，它能延长GLP-1的体内半衰期来保留GLP-1分子生物学活性。同时，GLP-1和能与GLP-1R特异性结合的抗体形成的融合蛋白质具有由抗体提供的分子靶向性，而且抗体的免疫源性也低于其他的融合蛋白质伙伴。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.选自以下序列之一的轻链⑶R3序列:
与选自L1-L13的轻链CDR3序列:SEQ ID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列；优选的与选自L1-L13的轻链CDR3序列:SEQ ID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链⑶R3序列；更优选的与选自L1-L13的轻链⑶R3序列:SEQ ID NO:46?SEQ ID NO: 53其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链⑶R3序列。
[0007]b.选自以下序列之一的重链⑶R3序列:
与选自H1-H13的重链CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；优选的与选自H1-H13的重链CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链⑶R3序列；进一步的与选自H1-H13的重链⑶R3序列:SEQ ID NO:2(TSEQ ID NO: 27其中之一相差总共不超过二个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链⑶R3序列；更进一步的与选自H1-H13的重链CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列。
[0008]c.(a)的轻链⑶R3序列和(b)的重链⑶R3序列。
[0009]作为优选，所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列:
a.选自以下之一的轻链⑶Rl序列:
与选自L1-L13的轻链CDRl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链⑶Rl ;优选的与选自L1-L13的轻链⑶Rl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO:37其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDRl序列；更优选的与选自L1-L13的轻链CDRl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDRl序列。
[0010]b.选自以下之一的轻链⑶R2序列:
与选自L1-L13的轻链CDR2序列:SEQ ID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2 ;优选的与选自L1-L13的轻链CDR2序列:SEQ ID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列。
[0011]c.选自以下之一的重链⑶Rl序列:
与选自H1-H13的重链CDRl序列:SEQ ID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链⑶Rl ;优选的与选自H1-H13的重链⑶Rl序列:SEQ ID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链⑶R2序列。
[0012]d.选自以下之一的重链⑶R2:
与选自H1-H13的重链CDR2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链序列。优选的与选自H1-H13的重链⑶R2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDRl序列；更优选的与选自H1-H13的重链CDR2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO:19其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDRl序列。
[0013]一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一:
a.包含以下方案的一种或几种的轻链可变结构域:
1.选自SEQID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一的轻链CDRl序列；
i1.选自SEQID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一的轻链CDR2序列；
ii1.选自SEQID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一的轻链CDR3序列；
b.包含以下方案的一种或几种的重链可变结构域:
1.选自SEQID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一的重链CDRl序列；
i1.选自SEQID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一的重链CDR2序列；
ii1.选自SEQID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一的重链CDR3序列；
c.(a)的轻链可变结构域序列和(b)的重链可变结构域序列。
[0014]一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.选自以下方案之一的轻链可变结构域序列:
1.具有与选自L1-L13的轻链可变结构域序列:SEQID NO: 81，SEQ ID NO: 83，SEQID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95，SEQ ID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一至少80%相同的序列的氨基酸；
i1.与编码L1-L13的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列:SEQID NO: 80, SEQ IDNO: 82，SEQ ID NO: 84，SEQ ID NO: 86，SEQ ID NO: 88，SEQ ID NO: 90，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 94，SEQ ID NO: 96，SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 102，SEQID NO: 104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
b.选自以下的重链可变结构域序列:
1.与H1-H13 的重链可变结构域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一至少80%相同的氨基酸序列；
i1.与编码H1-H13的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列:SEQID NO: 54, SEQ IDNO: 56，SEQ ID NO: 58，SEQ ID NO: 60，SEQ ID NO: 62，SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 74，SEQ ID NO: 76，SEQ IDNO: 78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
c.(a)的轻链可变结构域序列和(b)的重链可变结构域序列。
[0015]作为优选，所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.选自L1-L13 的轻链可变结构域序列:SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一的轻链可变结构域序列；
b.选自H1-H13 重链可变结构域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一的重链可变结构域序列；
c.a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列。
[0016]作为优选，方案c中a的轻链可变结构域序列与b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一:L1HU L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、LIIHl1、L12H12、L13H13。
[0017]作为优选，所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列；
b.SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列；
c.SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列；
d.SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列；
e.SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列；
f.SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列；
g.SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列；
h.SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列。
[0018]作为优选，所述抗体选自鼠源抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(fa’ )x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体。
[0019]一种GLP-1融合蛋白质，所述GLP-1融合蛋白质由GLP-1和本发明的抗体融合形成，其中GLP-1包含选自以下之一的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 127。
[0020]作为优选，GLP-1通过 N’ -R1-L-R2-C’、N’ -R2-L-R1-C’ 或者 N’ -R2_L-Rlr-C’ 的连接方式与权利要求1或3或4所述抗体的轻链和/或重链相融合；
其中L为肽接头序列，其包含全长的、部分的或者重复的选自LKf LK3的氨基酸序列:SEQ ID NO: 110，SEQ ID NO: 111，SEQ ID NO: 112 其中之一的氨基酸序列；
Rl为GLP-1的氨基酸序列；
Rlr为GLP-1的反向氨基酸序列；
R2为权利要求1或3或4所述抗体轻链或者重链的氨基酸序列；
C’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的羟基残基端；
N’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的氨基残基端。
[0021]—种多核苷酸，其编码本发明的GLP-1融合蛋白质。
[0022]—种载体，其包含本发明的多核苷酸。
[0023]一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
[0024]一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的本发明的GLP-1融合蛋白质。
[0025]一种包含或基于本发明的抗体或者GLP-1融合蛋白质的药用组合物在制备用于预防或治疗非胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。
[0026]考虑到GLP-1R在使用胰岛素样肽_1调控II型糖尿病人的血糖浓度方法中的所承担的关键作用，并且其显著的治疗特征是其刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖相关危险的能力。本发明将GLP-1与能与GLP-1R特异性结合的抗体相融合，延长GLP-1的体内半衰期来保留GLP-1分子生物学活性。同时，GLP-1和能与GLP-1R特异性结合的抗体形成的融合蛋白质具有由抗体提供的分子靶向性，而且抗体的免疫源性也低于其他的融合蛋白质伙伴。
[0027]本发明的有益效果是JfGLP-1与能与GLP-1R特异性结合的抗体相融合，延长GLP-1的体内半衰期来保留GLP-1分子生物学活性。同时，GLP-1和能与GLP-1R特异性结合的抗体形成的融合蛋白质具有由抗体提供的分子靶向性，而且抗体的免疫源性也低于其他的融合蛋白质伙伴。
[0028]发明详述
本发明针对GLP-1在体内被二肽基肽酶(DPP-1V)迅速清除而有效性不足的缺点用GLP-1R的抗体与其融合来增强其半衰期和生物学活性。所用于融合的抗体，具有不阻碍GLP-1与受体结合的前提下，特异性识别GLP-1R的生物学活性，本身与受体的高亲和力和稳定性能够长效地增加GLP-1在受体周围的局部浓度，从而大大增加其与受体结合的有效时间和效价。同时，与抗体的融合增加了 GLP-1被DPP-1V识别或者捕获的空间位阻，减少了其在体内被清除的几率而增加了 GLP-1的有效时长。据文献报道，GLP-1R的N端胞外区和其跨膜区部分的咬合状态的释放是GLP-1得以进入与GLP-1R的结合位点，行使其生物活性的关键步骤。而本发明中所述的抗体与GLP-1R结合很大程度上涉及到受体的N端胞外区，其和受体的结合有助于上述咬合状态的释放，利于GLP-1的进入。所以，GLP-1与针对GLP-1R的抗体融合后增加了自身的半衰期和亲和效价，有更强的生物学活性，是更进一步优越于GLP-1疗法的一个重要创新。更重要的是，本发明所用的部分抗体本身具有在GLP-1存在的情况下，增强GLP-1R的GLP-1激活的生物学特性。因为以上的一些原因，本发明所述的GLP-1融合蛋白质是比GLP-1更有效的GLP-1R激活剂。
[0029]融合蛋白质长时期反复施用时的抗原性存在普遍的顾虑。对于GLP-1融合物疗法，这尤其是一个顾虑，因为糖尿病患者一旦经诊断为该疾病，必须一生接受治疗。此外，如果免疫球蛋白的Fe部分保留不需要的效应子功能，Fe融合蛋白质疗法可能是一个顾虑。通过用电脑协助对免疫球蛋白的三维结构的预测以及抗体的序列的优化以及人源化，加上鉴定反复和长期施用后诱导免疫反应风险降低并且不再具有效应子功能的特定GLP-1融合蛋白质，本发明的中讨论的GLP-1部分的氨基酸优选通过富含甘氨酸和丝氨酸的肽接头与抗体的轻链和重链相融合。因为甘氨酸和丝氨酸带有较小的侧链，使肽接头序列具有相当的灵活性，减少了 GLP-1和抗体之间相对位置的刚性，使GLP-1可以自由地与GLP-1R相互作用。同时，肽接头的存在隔离了 GLP-1和抗体，避免了两者结构域的相互作用。甘氨酸和丝氨酸交替出现避免过度重复向融合蛋白质中引入不必要的免疫源性，但是肽接头无可避免的增加融合蛋白质在体内的免疫原性，优选肽接头长度，平衡结构柔度和免疫源性很重要，所以，本发明提供了 3个不同长度的肽接头用于融合。同时，本发明中提供了 GLP-1与抗体用肽接头通过不同的连接的方式来形成融合，由此而形成的GLP-1融合蛋白质的形式包括:
1)带有GLP-1与轻链通过N’-R1-L-R2-C’方式连接的融合蛋白质；
2)带有GLP-1与轻链通过N’-R2-L-R1-C’方式连接的融合蛋白质；
3)带有GLP-1与轻链通过N’-R2-L-Rlr_C’方式连接的融合蛋白质；
4)带有GLP-1与重链通过N’-R1-L-R2-C’方式连接的融合蛋白质；
5)同时带有I)和4)的融合蛋白质；
6)同时带有2)和4)的融合蛋白质；
7)同时带有3)和4)的融合蛋白质。
[0030]本发明中，编码GLP-1的DNA与所述抗体的全长/可变区/片段轻链或全长/可变区/全长重链DNA通过编码肽接头序列的DNA连接成融合轻链或融合重链DNA，同时在轻链DNA的5’末端还将引入编码信号引导肽的DNA来形成基因，并可以此基因基础连接突变/野生型的GLP-1和抗体序列。本发明通过基因合成的方法得到GLP-1的序列，并通过PCR的方法将其与肽接头序列以及抗体轻链或重链DNA相连接。针对GLP-1R的抗体轻链或重链可变区序列由特定杂交瘤细胞中通过PCR方法调取，并与特定抗体亚型的恒定区DNA相连接组成得到。野生型抗体亚型的恒定区DNA可以通过从特定的文库克隆得到并作为序列优化的基础。在此所述的用于表达融合蛋白质的基因，通过克隆方式放入表达载体中用于融合蛋白质的产生和表达。在表达过程中，轻链和重链表达载体搭配后，用共转染或者转化的方式将带有其基因的DNA引入宿主细胞中，并用优化适应诱导启动子，选择转化子或者扩增编码所希望序列的基因的培养基在适宜的PH，温度中培养。DNA引入方式选用普遍使用的CaPO4,电穿孔和PEI等方式。
[0031]适于表达此处所述载体中核酸的合适宿主细胞包括高等真核细胞，哺乳动物宿主细胞系表达的实例包括了中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)和人胚胎肾脏细胞(HEK293或者悬浮培养的HEK293细胞系)，位于轻链N末端的信号引导肽指导重组融合蛋白质的从哺乳动物宿主细胞系中的分泌。用于表达和克隆的载体上带有能够使载体在宿主细胞中不断复制的选择标记，用于筛选有能力吸收编码融合蛋白质的核酸的细胞并且带有与融合蛋白质编码序列有效连接并指导mRNA合成的启动子。其中一个实例是用带有抗生素抗性以及乙型肝炎病毒和猿病毒启动子(SV40)的载体优选稳定表达融合蛋白质的CHO宿主细胞。
[0032]本发明在宿主细胞系表达融合蛋白质后，用亲和层析的方法将其分泌在细胞培养上清中的部分纯化。本发明中的实例包括用蛋白G的亲和层析柱捕获融合有全长抗体的融合蛋白质，然后用低PH将其从层析柱料上洗脱后再收集。温和的洗脱条件有助于防止蛋白的变性。
[0033]可以用一种或多种赋形剂配制本发明的融合蛋白质。本发明的融合蛋白质可以与可药用的缓冲液、经调节提供可接受的稳定性的pH、以及可施用(例如胃肠外施用)的pH组合。任选地，可以添加一种或多种可药用的抗微生物剂。间甲酚和苯酚是优选的可药用抗微生物剂。可以添加一种或多种可药用盐溶液以调节离子强度或张力。可以添加一种或多种赋形剂以进一步调节制剂的等渗性。甘油是等渗性调节赋形剂的实例。可药用意味着适于施用于人类或其他动物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，并且不干扰其中活性化合物的活性。
[0034]可以以溶液制剂或能够用合适的稀释剂重构的冻干粉配制本发明的融合蛋白质。冻干剂型是其中融合蛋白质稳定的一种剂型，具有或不具有重构产品在预期的使用货架期内保持PH的缓冲能力。包含在此讨论的融合蛋白质的溶液在冻干前优选是等渗的，使之重构后能够形成等渗溶液。
[0035]本发明的融合蛋白质的可药用盐溶液形式在本发明范围内。常用于形成酸加成盐的酸为无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基一磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。优选的酸加成盐是与无机酸，例如盐酸和氢溴酸形成的盐。
[0036]碱加成盐包括从无机碱，例如铵、碱或碱土金属氢氧化物衍生的那些盐、碳酸盐、碳酸氢盐等。在制备本发明的盐溶液中有用的这类碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
[0037]本发明的融合蛋白质具有生物学活性。生物学活性指该融合蛋白质在体内结合并激活GLP-1R并引起细胞应激反应。反应包括但是不限于提高胰岛素的分泌、胰高血糖素分泌的抑制，抑制食欲、体重减轻、诱导过饱、抑制凋亡、诱导胰腺beta细胞增殖及胰腺beta细胞分化。对有代表性的一些GLP-1融合蛋白质测试体外和体内活性。首先，步骤4 (图1)提供了该融合蛋白质和GLP-1R相互作用的荧光检测数据。然后，步骤5提供了基于该融合蛋白质与人GLP-1R相互作用后将其活化的体外活性测定。在实验中使用过表达人类GLP-1R的CHO细胞。在这些细胞中，GLP-1R的活化引起腺苷酸环化酶的活化，该酶的活化又诱导由cAMP应答元件(CRE)驱动的报告基因的表达。步骤12(图2)提供了其中报告基因为萤光素酶的数据。体外的实验数据共同表明融合蛋白质能够结合并活化GLP-1R，并且在体外表现比GLP-1-Gly8(7-37)0H更有效。步骤13 (图3)提供对禁食并腹腔注射本发明的融合蛋白质之一后16h的小鼠灌服葡萄糖后血糖的变化数据。步骤13小鼠中产生的数据则显示该融合蛋白质在体内具有活性，并且比天然GLP-1具有更长的半衰期。
[0038]可以通过具有普通技能的内科医生已知有效的任意途径施用这些融合蛋白质。外周肠胃外属于其中一种此类方法。医学文献中通常将肠胃外施用理解为通过消毒注射器或一些其他机械装置例如注射泵向机体注射剂型。外周肠胃外可以包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用途径。
[0039]本发明的融合蛋白质也可以进行经口、直肠、经鼻或下呼吸道途径施用，它们是非肠胃外途径。这些非肠胃外途径中，优选下呼吸道途径和经口途径。
[0040]本发明的融合蛋白质可以用于治疗多种疾病和病症。本发明的融合蛋白质首先通过作用于GLP-1R而发挥其生物学作用。因此可以用本发明的GLP-1融合蛋白质治疗会对GLP-1R刺激或对GLP-1化合物施用做有宜应答的疾病和/或病症的受试者。将这些受试者称为“需要GLP-1化合物治疗”或“需要GLP-1R刺激”的受试者。包括非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(见WO 00 / 16797)、心肌梗死(见WO 98 / 08531)、肥胖(见WO 98 / 19698)、手术后分解代谢改变(见美国专利号6，006, 753)、功能性消化不良和肠易激综合征(见W099 / 64060)。也包括要求以GLP-1化合物预防性治疗的受试者，例如具有发展为非胰岛素依赖性糖尿病危险的受试者(见WO 00 / 07617)。糖耐量损伤或空腹葡萄糖损伤的受试者、体重对于受试者身高和体液高出正常体重约25%的受试者、部分胰切除的受试者、父母一方或双方具有非胰岛素疗的GLP-1融合蛋白质的“有效量”是与没有治疗相比引起对血糖浓度的更佳控制，从而导致糖尿病并发症(例如视网膜病、神经病或肾脏疾病)发作延迟的量。预防糖尿病的GLP-1融合蛋白质的“有效量"是与没有治疗相比延缓血糖水平升高的发作的量，所述发作需要以抗低血糖药物例如磺酰脲类、噻唑烷二酮、胰岛素和/或双胍类治疗。有效将患者血糖正常化的融合蛋白质的剂量取决于许多因素，其中包括但不限于受试者性别、体重和年龄、调节血糖无能的严重性、施用途径和生物利用率。融合蛋白质药物代谢动力学图谱、潜能和剂型。剂量可以为0.0l至I mg / kg体重，优选0.05至0.5 mg / kg体重。优选每周一次或二次施用本发明的融合蛋白质。取决于所治疗的疾病，可能有必要更频繁地施用该融合蛋白质，例如每周三次或更多次。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1是流式细胞术(FACS)检测重组表达的GLP-1融合蛋白质(GLP-1(A8G) -LK-L13H13)与稳定表达人源GLP-1R (hGLP-lR)的中国仓鼠卵巢细胞株(标有*的实线峰)以及中国仓鼠卵巢细胞株本身(虚线峰)的特异性结合的对比。
[0042]图2是通过报告基因方法得到的GLP-1野生型(圆形)和GLP-1 (A8G)-LK-L13H13(三角形)对稳定表达hGLP-lR的中国仓鼠卵巢细胞株的激活曲线。
[0043]图3是小鼠(ICR)糖耐量实验，检测GLP-1 (A8G) -LK-L13H13在5微克/只(方形)和15微克/只(三角形)单次1.p.注射16h后对禁食状态下的小鼠的糖耐量的影响。
[0044]图4是小鼠(C57BL)糖耐量实验，检测GLP-1 (A8G)-LK-L13H13在15微克/只(三角形)单次1.P注射40h后对禁食状态下的小鼠的糖耐量的影响。
[0045]图5是二型糖尿病小鼠(db/db Mice)血糖浓度时间糖曲线，检测GLP-1 (A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的浓度下(倒三角形)对二型糖尿病小鼠进行单次1.P.注射后的小鼠血糖浓度变化的时间曲线。
[0046]图6是二型糖尿病小鼠(db/db Mice)日进食量时间曲线，记录GLP-1 (A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的浓度下(倒三角形)单次对二型糖尿病小鼠进行
1.P.注射前3天到注射后5天这一时间段内小鼠日进食量的变化的时间曲线。图6和图5为平行进行的实验结果。
【具体实施方式】
[0047]下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0048]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0049]步骤1:免疫用抗原细胞稳定株的构建
接种CHO-DHFR细胞至6孔板中，培养24h后转染含hGLP-lR基因(核苷酸序列见SEQID NO: 113，氨基酸序列见SEQ ID NO: 114)的pYS质粒于6孔板中的细胞，转染前更换培养液，按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000的转染条件进行转染。48h后，再换为含有10 nM MTX的完全培养基，每隔3天换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，消化分散细胞集落，待长至50%愈合度时，逐渐提高MTX的浓度进行加压筛选，直至MTX的浓度为10 μ Mo构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用抗hGLP-lR的抗体(Abeam)鉴定加压后的细胞群体，10 μ M MTX筛选后的CHO-DHFR-hGLP-lR细胞膜上hGLP-lR有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得6株hGLP-lR高表达细胞稳定株。
[0050]步骤2:抗体的制备
将在弗氏佐剂中乳化的CHO-DHFR-hGLP-lR全细胞，以2xl06细胞/只的剂量皮下注射BALB/c小鼠(6-8周龄)。2周后,使用不完全弗氏佐剂乳化免疫原,加强免疫小鼠,此后每周加强一次。通过剪尾的方式采血，离心分离血清，进行FACS检测血清效价。直至达到适合抗体滴度时，断颈处死小鼠，无菌状态下获取脾脏细胞。收集生长状态处于对数生长期的SP2/0细胞,2000 rpm, 3min离心,沉淀用无血清培养至重悬,再次离心-重悬,计数。混合脾脏细胞和SP2/0细胞，保证SP2/0:脾脏细胞> 1:1，共“洗涤-离心”3次。弹散最后一次离心后的沉淀，逐滴加入ImL预温至37°C的PEG-1350 (30s内滴完)，上下吹吸慢加入30mL预热至37°C的无血清培养基(Invitrogen)以终止PEG的融合作用，1500rpm,5min离心，弹散细胞沉淀，加入添加有HAT (次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷；Invitr0gen)，20%FBS (B1ind)的RPMI1640 (Invitrogen)作为融合培养基，按每孔20000个脾细胞及5000个饲养层细胞铺于96孔板中，每孔ΙΟΟμΙ。融合后的杂交瘤细胞和饲养层细胞一起在96孔板中进行培养，并进行HAT筛选，以除去非融合的细胞。10天后收取培养板中的杂交瘤细胞上清进行ELISA检测。
[0051]步骤3:全细胞ELISA筛选
将CHO-DHFR-hGLP-lR过表达hGLP-1R的细胞和不表达hGLP-lR的CHO-DHFR-空白细胞分别接种至96孔板，长至90%愈合度。除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入100 μ I 100%甲醇4°C固定lOmin。再加入100 μ I新鲜配制的0.6% H2O2-PBS,室温处理20min，PBS洗涤2遍。经过PBS-1%BSA封闭后，加入杂交瘤细胞上清4°C孵育90 min。多次洗涤后，每孔加入 5000 倍稀释的 GxM-HRP-Fc 二抗(Sigma-Aldrich)10 μ 1，37°C孵育 0.5h。洗涤 5 次后，每孔加入100 μ I TMB显色底物，37°C反应15min, 2M H2SO4终止，读取0D450值。阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。选取分泌抗hGLP-lR抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌针对hGLP-lR的细胞株。最后选取杂交瘤细胞分泌的抗体上清进行FACS验证。
[0052]步骤4:阳性杂交瘤细胞上清流式分析鉴定(FACS)
用含1mM EDTA的PBS消化、收集15个CHO-DHFR-hGLP-lR细胞，分别加入1.5ml EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液(PBS，2% FBS)重悬。阳性处理组细胞每管加200μ I抗体上清，室温孵育；1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，每孔加入1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光抗体(BD Pharmingen) 200μ1，室温避光孵育30 min ;离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。杂交瘤细胞上清和表达有hGLP-lR的CHO-DHFR细胞有特异性结合，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清对应的实线峰(带有*标记)有明显右移(图1)。
[0053]步骤5:抗体基因的克隆及亚克隆
收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为(5，-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC -3，)(SEQ ID NO: 115)，轻链逆转录引物为(5，- TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3，)(SEQ ID NO: 116)和(5，-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO: 117)。RT-PCR 的反应条件为:25 °C 5min ；50°C 60min ；70°C 15min。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释至500 μ 1，加入到超滤离心管(Amicon Ultra-0.5)中,2000g 离心 1min ;弃滤液，再加 500 μ I 的 0.1mM 的 TE”2000g离心1min ;弃滤液，将制备管倒置到新的离心管中，2000g离心lOmin，得到纯化后的cDNA ;取10μ I的纯化后的cDNA作为模板，加入4 μ I的5x的tailing buffer,4 μ I的dATP (ImM)和1U的末端转移酶(Promega)后混匀，37 °C孵育5min后65 V5min ;然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为 OligodT，重链下游引物为(5’ - TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3，) (SEQ ID NO:118)和(5，- TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)(SEQ ID NO: 119)，轻链下游引物为(5，-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3，)(SEQ ID NO: 120)。PCR 反应条件:95°C 5min ；95°C 30s,56°C 30s, 72°C Imin 40cycles ；72°C 7min ;PCR 产物连接到 PMD 18-T 载体后进行测序。测序得到的抗体轻链和重链可变区序列见附录序列表。
[0054]基于已测序得到的抗体的DNA序列设计PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgGl恒定区与表达载体ρΤΜ5相连。
[0055]步骤6:在悬浮ΗΕΚ293宿主细胞系中瞬时表达抗GLP-1R的抗体
接种悬浮ΗΕΚ293或者CHO表达细胞系至转瓶中，经过24h 37°C旋转培养后被用于转染。转染过程中使用Polyethylenimine (PEI)作为转染介质，将其与DNA混合后加入到细胞培养中。PEI和DNA的混合优选配比为1:1至5:1。细胞在接受PEI与DNA混合物后继续37°C旋转培养96h以上以表达抗原结合蛋白，其间向细胞培养中加入0.5%的胰蛋白胨作为表达需要的氨基酸源，最后收集细胞上清用于抗原结合蛋白质的纯化分离。
[0056]步骤7:抗体人源化及优化
首先，将筛选所得的鼠源抗体轻、重链可变区序列，并使用NCBI的在线抗体可变区序列比对工具Ig Blast，搜索与输入的抗体可变区序列同源的人源的抗体生殖细胞系基因序列(Ig Germline Gene sequence),并将除⑶R序列外，同源性最高的人源基因序列做为模板序列进行CDR嫁接，得到人源化抗体可变区序列，并外包合成人源化抗体轻、重链的基因。根据序列设计PCR引物，在合成序列的5’端和3’端引入合适的限制性内切酶位点，并通过PCR扩增后将其与人IgG2或者IgG4恒定区序列拼接后得到完整的重组人源化抗体序列。重组的抗体根据步骤6进行表达，并按照步骤4中的FACS技术验证其针对GLP-1R的亲和力。在保留了针对GLP-1R亲和力的人源化抗体群中，遴选出亲和力表现最优秀的抗体，并通过定点突变，对其可变区序列进行进一步的改造，更进一步提高其针对GLP-1R的亲和力。
[0057]步骤8 =GLP-1人源化融合蛋白质的基因克隆与亚克隆
优化后的人源化抗体在轻链的N端或者C端与GLP-1及其衍生物序列进行融合组成GLP-1融合蛋白质，两者的序列由肽接头序列(LK)做为桥梁进行连接。信号肽-GLP-1-肽接头的核苷酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，以合成基因为模板，PCR扩增“信号肽-GLPl-接头”部分的序列，PCR 上游引物为(5，-CCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3，) (SEQID N0:121)，PCR 下游引物为(5，- AGAGCCGGTGGCAGAGCCAG-3’ ) (SEQ ID N0:122)，PCR 反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 35cycles ；72°C 7min。另以人源化抗体的核苷酸序列为模板，扩增融合蛋白质的抗体部分的序列。
[0058]PCR 上游引物为(5，-CTGGCTCTGCCACCGGCTCTGCCATCCAGAT GACCCAGTCTCC-3，) (SEQ ID NO: 12 3) , PCR T 游弓丨物为(5，-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3，) (SEQ ID NO: 124)，PCR 反应条件为:95°C 5min ；95°C30s, 56°C 30s, 72°C Imin 35cycles ；72°C 7min。然后通过 overlapping PCR将融合蛋白质核酸序列的“信号肽-GLP-1-肽接头”部分与抗体部分连接，引物两端添加Nhel和Notl的酶切位点，从而将完整的融合蛋白质序列与表达载体pTM5相连。overlapping PCR上游引物为(5’-CCGGCTAGCCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3，)(SEQ ID NO: 125)，下游引物为(5，-AGTGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’)(SEQ ID NO: 126)。PCR 反应条件:95°C5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 35cycles ；72°C 7min ;PCR 产物连接到 PTM5 载体后进行测序。
[0059]步骤9:在悬浮HEK293宿主细胞系中瞬时表达GLP-1融合蛋白质。
[0060]接种HEK293悬浮细胞至转瓶中，在转染前换培养基。将包含融合蛋白质轻/重链基因的载体以 DNA 总量 0.5-1.5 μ g/ml 的浓度与 1.5-7.5 μ g/ml 的 Polyethylenimine(PEI)混合静置15-25分钟后，加入细胞培养中。24小时后，再向细胞培养加入0.5-1%的Trypton NI。培养5_10天后收取的上清中含有分泌表达的GLP-1融合蛋白质。
[0061]步骤10:在悬浮CHO宿主细胞系中稳定表达GLP-1融合蛋白质。
[0062]接种悬浮CHO细胞至6孔板中，通过步骤I中的转染条件转染融合蛋白质的表达载体。48小时后，加入300mg/ml的hygromycin (重链)和6mg/ml的puromycin (轻链)进行联合筛选。在细胞出现大量凋亡后(死亡率>90%)，逐步降低抗生素浓度恢复剩余细胞的生长，后转为转瓶扩大培养，并随后确认上清中抗体的表达。在随后的培养基中保持减半的抗生素浓度以维持细胞对GLP-1融合蛋白质的稳定表达。
[0063]步骤11 =GLP-1融合蛋白质从细胞培养上清中的纯化和制备
将细胞培养离心去除其中细胞，其上清经过偶联蛋白G配基的亲和层析柱后，用PH2.5-3.5的洗脱液将表达的GLP-1融合蛋白质从层析柱上洗脱。洗脱管中预置中和缓冲液及时中和洗脱液的低PH值。洗脱后收集的蛋白质溶液对PBS透析。
[0064]步骤12:报告基因实验检测GLP-1融合蛋白质在体外激活GLP-1受体的功能(见图2)。
[0065]以每孔20000 个接种共表达 hGLPlR-CRE-Luciferase 的 CHO-DHFR-细胞至 96 孔细胞培养板，37°C培养过夜。第二天除去培养基上清，用无血清培养基清洗细胞表面两次，吸去残液，再加入100 μ I用无血清培养基稀释纯化抗体或GLP-1，37°C孵育4小时。刺激结束后，加入10yl P1mega的Bright Glo化学发光底物，最后将细胞裂解物转移至白色96孔板,在Molecular Devices的SpectraMax L酶标仪上读取相对发光强度。
[0066]步骤13:小鼠(ICR)禁食状态下葡萄糖耐量实验。
[0067]测定小鼠静脉中葡萄糖耐量测定中评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1(A8G)-LK-L13H13))的效果。四组中每组包含至少三至五只小鼠。I组接受同体积PBS对照腹腔注射。II组接受15 μ g/只的单次腹腔注射。III组接受5 μ g/只的单次腹腔注射。在注射后，小鼠进行6-16 h的禁食处理，禁食完成后去小鼠血液样本测定其基础血糖浓度值。然后接受1.5g/kg浓度的葡萄糖灌胃。在葡萄糖灌胃后15，30，60和90分钟采集其血液样本以测定血糖浓度，见图3。
[0068]步骤14:糖耐量实验检测GLP-1融合蛋白质在小鼠(C57BL)体内长效性(40h)。
[0069]测定小鼠静脉中葡萄糖耐量测定中评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1 (A8G)-LK-L13H13))在小鼠体内的长效性。两组中包含至少三至五只小鼠。I组接受同体积PBS对照腹腔注射。II组接受Myg/只浓度的单次腹腔注射。在注射后24 h，小鼠进行16 h的禁食处理，禁食完成后取小鼠血液样本测定其基础血糖浓度值。然后接受1.5g/kg浓度的葡萄糖灌胃。在葡萄糖灌胃后15，30，60和90分钟采集其血液样本以测定血糖浓度，见图4。
[0070]步骤15 =GLP-1融合蛋白质降低二型糖尿病小鼠(db/db Mice)血糖浓度的长效性研究(72 h)。
[0071]在不同时间点测定二型糖尿病小鼠血糖浓度以评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1 (A8G)-LK-L13H13))在二型糖尿病小鼠体内降低其血糖浓度的长效性。两组中每组包含至少六只小鼠。在注射开始前取小鼠血液样本测定其基础血糖浓度值。之后，I组接受同体积PBS对照腹腔注射，II组接受30 μ g/千克浓度的单次腹腔注射。在注射后I，4，6，24，48，72小时分别采集其血液样本以测定两组小鼠血糖浓度，见图5。
[0072]步骤16 =GLP-1融合蛋白质减少二型糖尿病小鼠(db/db Mice)日进食量的长效性研究(120h)。
[0073]在对二型糖尿病小鼠日进食量改变的测定中评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1 (A8G)-LK-L13H13))在降低二型糖尿病小鼠进食水平方面的长效性。该步骤和步骤15在同一批小鼠上同步进行。两组中每组包含至少六只小鼠。在步骤15的注射前3天起至注射后5天(120小时)，每日早晨同一时间点称量每组小鼠日进食量，见图6。
[0074]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【权利要求】
1.一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列: a.选自以下序列之一的轻链⑶R3序列: 与选自L1-L13的轻链CDR3序列:SEQ ID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列； b.选自以下序列之一的重链⑶R3序列: 与选自H1-H13的重链CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列； c.(a)的轻链⑶R3序列和(b)的重链⑶R3序列。
2.根据权利要求1所述的一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列: a.选自以下之一的轻链⑶Rl序列: 与选自L1-L13的轻链CDRl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDRl ； b.选自以下之一的轻链⑶R2序列: 与选自L1-L13的轻链CDR2序列:SEQ ID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2 ； c.选自以下之一的重链⑶Rl序列: 与选自H1-H13的重链CDRl序列:SEQ ID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链⑶Rl ; d.选自以下之一的重链⑶R2: 与选自H1-H13的重链CDR2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链序列。
3.一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体包含以下方案之一: a.包含以下方案的一种或几种的轻链可变结构域: 1.选自SEQID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一的轻链CDRl序列； i1.选自SEQID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一的轻链CDR2序列； ii1.选自SEQID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一的轻链CDR3序列； b.包含以下方案的一种或几种的重链可变结构域: 1.选自SEQID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一的重链CDRl序列； i1.选自SEQID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一的重链CDR2序列； ii1.选自SEQID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一的重链CDR3序列； c.(a)的轻链可变结构域序列和(b)的重链可变结构域序列。
4.一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列: a.选自以下方案之一的轻链可变结构域序列: 1.具有与选自L1-L13的轻链可变结构域序列:SEQ ID NO: 81，SEQ ID NO: 83，SEQID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95，SEQ ID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一至少80%相同的序列的氨基酸； i1.与编码L1-L13的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列:SEQ ID NO: 80, SEQ IDNO: 82，SEQ ID NO: 84，SEQ ID NO: 86，SEQ ID NO: 88，SEQ ID NO: 90，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 94，SEQ ID NO: 96，SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 102，SEQID NO: 104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列； b.选自以下的重链可变结构域序列: 1.与H1-H13 的重链可变结构域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一至少80%相同的氨基酸序列； i1.与编码H1-H13的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列:SEQID NO: 54, SEQ IDNO: 56，SEQ ID NO: 58，SEQ ID NO: 60，SEQ ID NO: 62，SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 74，SEQ ID NO: 76，SEQ IDNO: 78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列； c.(a)的轻链可变结构域序列和(b)的重链可变结构域序列。
5.根据权利要求4所述的一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列: a.选自L1-L13 的轻链可变结构域序列:SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一的轻链可变结构域序列； b.选自H1-H13 重链可变结构域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一的重链可变结构域序列； c.a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列。
6.根据权利要求5所述的一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:方案c中a的轻链可变结构域序列与b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一:L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13。
7.根据权利要求6所述的一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列: a.SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列； b.SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列； c.SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列； d.SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列； e.SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重链区氨基酸恒定序列； f.SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列； g.SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列； h.SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列。
8.根据权利要求1或3或4所述的一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，其特征在于:所述抗体选自鼠源抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(fa’ )x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体。
9.一种GLP-1融合蛋白质，其特征在于:所述GLP-1融合蛋白质由GLP-1和权利要求1或3或4所述抗体融合形成，其中GLP-1包含选自以下之一的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 127。
10.根据权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，其特征在于=GLP-1通过N’ -R1-L-R2-C’、N’ -R2-L-R1-C’ 或者 N’ -R2_L-Rlr-C’ 的连接方式与权利要求1 或 3 或 4所述抗体的轻链和/或重链相融合； 其中L为肽接头序列，其包含全长的、部分的或者重复的选自LKf LK3的氨基酸序列:SEQ ID NO: 110，SEQ ID NO: 111，SEQ ID NO: 112 其中之一的氨基酸序列； Rl为GLP-1的氨基酸序列； Rlr为GLP-1的反向氨基酸序列； R2为权利要求1或3或4所述抗体轻链或者重链的氨基酸序列； C’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的羟基残基端； N’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的氨基残基端。
11.一种多核苷酸，其特征在于:其编码权利要求9的GLP-1融合蛋白质。
12.—种载体,其特征在于:其包含权利要求11的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，其特征在于:其包含权利要求12的载体。
14.一种药用组合物，其特征在于:其包含与药用可接受载体混合的权利要求9的GLP-1融合蛋白质。
15.一种权利要求14的药用组合物在制备用于预防或治疗非胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。
【文档编号】A61P3/10GK104371019SQ201410349725
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2013年8月13日
【发明者】张 成, 景书谦, 章华, 汪笑峰, 药晨江 申请人:杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司