柴胡皂苷d对肿瘤多药耐药逆转作用的医药用途
【专利摘要】本发明提供了柴胡皂苷D对肿瘤多药耐药逆转作用的医药用途，用于制备肿瘤多药耐药逆转的药物，提供了SS-d作为肿瘤MDR逆转剂应用临床，可克服肿瘤细胞MDR、减少化疗药物毒性，提高抗癌药物疗效，为癌症的治疗提供更好的方法。
【专利说明】柴胡皂苷D对肿瘤多药耐药逆转作用的医药用途
【技术领域】
[0001] 本发明提供了柴胡皂苷D对肿瘤多药耐药逆转作用的医药用途，用于制备肿瘤多 药耐药逆转的药物，属于医学制药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤已成为人类死亡的一个重要原因，据世界卫生组织报道，在2005年全球 5800万死亡总数中，恶性肿瘤约占所有死亡的13%。化学治疗在恶性肿瘤的综合治疗中占 有非常重要的地位，与手术治疗，放射治疗一起成为恶性肿瘤治疗的三把利剑。然而，在临 床化疗过程中有两个常见却又十分严重的问题影响着治疗的疗效，分别是肿瘤的多药耐药 问题与化疗的毒副反应问题。许多患者就是因为化疗过程中肿瘤多药耐药性的产生或化疗 毒副反应大不能坚持而中断、甚至放弃化疗。因此，预防或逆转肿瘤多药耐药及化疗增效减 毒的相关研究成功与否，直接关系到恶性肿瘤患者化疗的疗效及预后，其意义重大。
[0003] 多药耐药（Multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现 耐药的同时，对其他结构和作用机理不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，是导致化疗失败 的主要原因。研究表明，多种机制参与肿瘤MDR的产生，ABC结合盒转运体（ATP-binding cassette transporters)是跨膜转运蛋白超家族，可能量依赖性将结构和作用机制不同的 抗癌药物泵出细胞外，在MDR形成中发挥主要作用，其中关于P-glycoprotein (P-gp)研 究最为广泛和深入成员之一。P-gp为MDR1基因编码的分子量为170-kDa的跨膜转运蛋 白，在肿瘤细胞中的P-gp可能量依赖性地将结构和作用机制不同的化疗药物主动外排产 生 MDR。
[0004] 克服MDR有多种方法，如开发对MDR细胞不具有抗药性的新型抗肿瘤药物；寻找 低毒、有效且对抗癌药物药代动力学无影响的MDR逆转剂以及沉默耐药蛋白表达等。由于 P-gp在MDR中发挥主要作用，研究者们希望能够通过抑制P-gp功能减少药物外排，恢复 MDR细胞对化疗药物的敏感性。于是对开发高效、低毒MDR逆转剂进行了广泛深入的研究， 这也是恢复MDR细胞对化疗敏感性，提高化疗疗效的有效途径。
[0005] 自从Tsuruo等首次报告维拉帕米（VRP)能逆转P388/VCR细胞对长春新碱的耐药 性以来，针对各种耐药蛋白的MDR逆转剂研究发展非常迅速，其中又以P-gp介导的肿瘤MDR 逆转剂研究最为广泛和深入，其中有一些已处于临床试验阶段。由于中药具有的独特优势， 从中药中筛选高效、低毒的单体化合物用于MDR逆转及化疗增效减毒增效己成为当前肿瘤 化疗研究的热点。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了柴胡皂苷D对肿瘤多药耐药逆转作用的医药用途，目的是可克服肿 瘤细胞MDR、减少化疗药物毒性，提高抗癌药物疗效。
[0007] 本发明涉及柴胡皂苷D是从传统中药柴胡中提取出来的一种主要活性成分，有多 种药学作用，如具有镇静、抗惊厥、解热、抗病毒、免疫调节、抗炎、保肝护肾以及抗肿瘤等多 方面药理活性，其分子式为：C42H68013,分子量：780. 98。
[0008] 柴胡总皂苷有效成分主要有A，B，C，D 4种皂苷单体成分，其中以柴胡皂苷D (简 称：SS-d)的活性最强。将以SS-d与抗癌药物联合应用，克服肿瘤细胞MDR、减少化疗药物 毒性从而提高抗癌药物疗效，是本发明要实现的任务。
[0009] 通过SS-d对肿瘤细胞MDR逆转作用的大量实验，证明SS-d对乳腺癌MCF-7/ADR 细胞表现出的明显的P-gp介导MDR逆转作用；SS-d逆转P-gp介导的肿瘤MDR的机制是通 过下调P-gp表达，增加 MCF-7/ADR细胞内Rh-123积聚和外排作用；特别是SS-d与ADR联 合应用对MCF-7/ADR细胞具有协同、增敏作用。
[0010] 所述肿瘤MDR逆转剂的剂型可为口服药剂或注射药剂，所述口服药剂可为滴丸、 软胶囊或冻干粉针等，所述注射药剂可为注射用乳剂等，注射用乳剂可为静脉注射用乳剂、 肌肉注射用乳剂、腹腔注射用乳剂或皮下注射用乳剂等。
[0011] 本发明的积极效果在于： 公开了柴胡皂苷D对肿瘤多药耐药逆转作用的医药用途，提供了 SS-d作为肿瘤MDR逆 转剂应用临床，可克服肿瘤细胞MDR、减少化疗药物毒性，提高抗癌药物疗效，为癌症的治疗 提供更好的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是RT-PCR显示MDR1、MRP1的mRNA表达情况； 图2是MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞P-gp表达情况； 图3是SS-d作用下MCF-7和MCF-7/ADR细胞的增殖抑制率； 图4是RT-PCR显示不同浓度SS-d对于细胞MDR1 mRNA表达影响； 图5是RT-PCR显示SS-d不同时间对细胞MDR1 mRNA的表达情况； 图6是不同浓度SS-d处理MCF-7/ADR细胞48h后对P-gp表达水平影响； 图7是SS-d处理MCF-7/ADR细胞不同时间后对P-gp表达水平影响； 图8是SS-d对MCF-7/ADR细胞内Rh-123积聚水平的影响； 图9是SS-d对MCF-7/ADR细胞内Rh-123外排的影响； 图10是SS-d对MCF-7/ADR细胞的增敏作用细胞形态学改变。
【具体实施方式】
[0013] 按照医药工业中已知的方法，将SS-d作为肿瘤细胞MDR逆转的药物，与一种或多 种医药上可接受的载体或赋形剂相混合，可以制成各种不同剂型的药物组合物。
[0014] 以下实验例通过SS-d对肿瘤细胞MDR逆转作用的药理药效实验来进一步说明本 发明，但并不表示本发明只限于该实施例。
[0015] 以下实验进一步表明本发明对肿瘤细胞MDR逆转作用的效果： 本实验采用SS-d与阿霉素联合对MDR的乳腺癌MCF-7/ADR细胞进行治疗，观察SS-d 对MDR细胞化疗药物敏感性的恢复效果及二者联用的治疗效果。
[0016] 逆转肿瘤细胞MDR的药效学实验： 1.细胞培养 MCF-7细胞培养于含10%超级新生牛血清的1640培养液中，MCF-7/ADR细胞培养于含 10%胎牛血清和lOOOng/ml ADR的1640培养液中以维持细胞耐药性，实验前一周将MCF-7/ ADR细胞置于无 ADR的1640培养液中培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0017] 2. RT-PCR鉴定各耐药基因 mRNA的表达情况 RT-PCR检测MCF-7/ADR细胞内耐药基因 MDR1和MRP1 mRNA的表达，HL60/ADR细胞作 为MRP1表达的阳性对照，MCF-7细胞作为耐药基因表达的阴性对照，β -actin作为内参照。
[0018] 3.流式细胞术鉴定细胞p-gp的表达情况 分别收集MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞，细胞培养液配成单细胞悬液，lOOOrpm，离心 5min，弃上清，冰PBS洗2次，再用500 μ 1 PBS将细胞制成单细胞悬液，细胞悬液中加入 P-gp单克隆抗体5μ 1，4°C避光孵育30分钟，PBS洗2次，取制成的单细胞悬液上流式细胞 仪检测，以相对荧光强度和细胞阳性百分率等指标表示P-gp的表达量。
[0019] 4. MTT法测定细胞耐药倍数 取对数生长期的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，用含2%胎牛血清的1640配成单细胞 悬液。实验组：八01?药物终浓度分别为0.14 8/1111、0.5 4 8/1111、14 8/1111、5 4 8/1111、1〇4区/ ml、25y g/ml、50y g/ml、100y g/ml、200y g/ml，对照组：接种细胞。置于 5%C02 3 7°C培养箱 中培养48h加入MTT，继续培养4h、弃培养液，加入DMS0，在酶联免疫检测仪测吸光值，计 算IC 5(I值。耐药倍数（RF)=耐药细胞IC5(I值/非耐药细胞IC5(I值。
[0020] 5. SS-d对MCF-7和MCF-7/ADR细胞生长的影响 取对数生长期的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞用含2%胎牛血清1640培养液配成单细 胞悬液，细胞浓度为1X l〇5/ml，铺于96孔板，每孔分别加入不同浓度的SS-d，终浓度分别 为 0· 5μ g/ml、l μ g/ml、2y g/ml、3y g/ml、4y g/ml、5y g/ml、8y g/ml、10y g/ml 及 15μ g/ ml，同时设无药细胞对照组，MTT法测IC5(I值及最大无毒剂量(抑制率彡10%)。
[0021] 确定对MCF-7/ADR细胞抑制率< 10%的药物浓度为该药的非细胞毒性剂量。抑制 率=1-(对照孔A值-试验孔A值/对照孔A值）。
[0022] 6. SS-d 作用 MCF-7/ADR 细胞 MDR1 mRNA 表达 RT-PCR检测不同浓度SS-d作用，实验分组如下： ① SS-d (0· 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 1 μ g/ml) +MCF-7/ADR ② 细胞对照组 RT-PCR检测不同时间柴胡皂苷D作用，实验分组如下： ① 0· 5 μ g/ml SS-d 分别作用 MCF-7/ADR 细胞 24h、48h、72h ② 细胞对照组 图像分析系统扫描定量，将MDR1 cDNA/0-actin cDNA的光密度比值作为MDRlmRNA的 相对表达水平。
[0023] 7. SS-d对MCF-7/ADR细胞P-gp表达水平影响 流式细胞术检测不同浓度SS-d作用，实验分组如下： ① SS-d (0· 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 1 μ g/ml) +MCF-7/ADR ② 细胞对照组 流式细胞术检测不同时间SS-d作用，实验分组如下： ① 0· 5 μ g/ml SS-d 分别作用 MCF-7/ADR 细胞 24h、48h、72h ② 对照组：MCF-7/ADR仅加入1640培养液。
[0024] 8. SS-d对于MCF-7/ADR细胞Rh-123积聚与外排的作用 ss-d对于MCF-7/ADR细胞Rh-123积聚的作用 MCF-7/ADR细胞接种于6孔板，培养24h使贴壁后分组如下： ① 实验组：〇· 5 μ g/ml SS-d+MCF-7/ADR ② 阳性对照组：5 μ g/ml VER+MCF-7/ADR ③ 空白对照组：MCF-7/ADR 继续培养48 h后弃去含药物的培养液，加入用新鲜培养液配制成的荧光染料Rh-123， 避光孵育 〇111；[11、30111；[11、60111；[11、90111；[11、120111；[11、150111；[11。孵育结束后，弃去含1?11-123的培养 液，胰酶消化细胞，4°C离心，冰PBS洗2次，将细胞重悬于PBS中，上流式细胞仪检测。
[0025] SS-d对于MCF-7/ADR细胞Rh-123外排的作用 MCF-7/ADR细胞接种于6孔板，培养24h使贴壁后，分组同积聚实验。
[0026] 继续培养48h后弃去含药物的培养液，加入用新鲜培养液配制成的荧光染料 Rh-123,于37°C、5%C02条件下分别避光孵育120min。孵育结束后弃去含Rh-123的培养液， 用胰酶消化细胞，4°C离心，冰PBS洗2次。将细胞重悬于培养液中分别外排5min、15min、 30min、60min后离心，冰PBS洗2次以充分除去残留的Rh-123,将细胞重悬于500 μ 1 PBS， 上流式细胞仪检测。
[0027] 9. SS-d处理后MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性变化 取对数生长期的MCF-7/ADR细胞配成1 X 105/ml单细胞悬液，铺于96孔板，待细胞贴 壁后按照实验如下： ① 实验组：〇· 5 μ g/ml SS-d+MCF-7/ADR ② 阳性对照组：5μ g/ml VER+MCF-7/ADR ③ 空白对照组：MCF-7/ADR 分别向实验各组加入 〇· 1 μ g/ml、0. 5μ g/ml、2. 5μ g/ml、5y g/ml、10y g/ml、25y g/ ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml及200 μ g/ml浓度的ADR，MTT法测量各孔的吸光值。
[0028] 10.利用联合指数分析SS-d与阿霉素的联合效应 细胞实验分组如下： ① SS-d (0· 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 1 μ g/ml) +MCF-7/ADR ② 阳性对照组：5 μ g/ml VER+MCF-7/ADR ③ 空白对照组：MCF-7/ADR 再分别向实验各组中加入0.11^/1111、0.54区/1111、2.54区/1111、54区/1111、1(^区/1111、 25 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml 浓度的 ADR。MTT 法测量吸光值。
[0029] 采用联合作用指数（combined index, CI)判断两种药物的协同性。CI=DA/ ICX，A+DB/ICX，B (A，B代表两种不同药物，ICX，A和ICX，B是两种药物单独使用使生长抑 制率达X时的药物浓度，DA和DB是两药联用使生长抑制率达X时两种药物的浓度）。判断 方法，0. 9彡CI彡1. 1为叠加作用，0. 8彡CI彡0. 9为低度协同作用，0. 6彡CI彡0. 8为中 度协同作用，〇. 4 < CI < 0. 6为高度协同作用，0. 2 < CI < 0. 4为强协同作用。
[0030] 11.利用剂量下降指数研究ss-d对阿霉素的增敏作用 选用ss-d非细胞毒性剂量以下浓度0. 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 1 μ g/ml ;阳性对照VER 非细胞毒性剂量5 μ g/ml分别与不同浓度ADR(0. 1 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、l μ g/ml、5 μ g/ml、 10μ g/ml、25y g/ml、50y g/ml、100y g/ml、200y g/ml)联合作用于 MCF-7/ADR 细胞。MTT 法测量吸光值，计算IC5(I值，求出SS-d作用后的剂量下降指数（Dose Reduction Index, DRI)，DRI=对照组IC5(/实验处理组IC5。。
[0031] 12.实验结果 12. 1 MCF-7 细胞及 MCF-7/ADR 细胞 MDR1、MRP1 的 mRNA 表达情况 RT-PCR结果显示MCF-7/ADR细胞表达MDR1 (341bp)但不表达MRPl，MCF-7细胞既不表 达 MDR1 也不表达 MRP1 (参见图 l，l:Marker(DL2000) ;2:HL60/ADR 细胞；3:MCF-7/ADR 细 胞；4:MCF-7 细胞）。
[0032] 12. 2 MCF-7 细胞及 MCF-7/ADR 细胞 P-gp 表达情况 流式细胞仪检测结果显示，MCF-7/ADR细胞高表达P-gp，而MCF-7细胞无 P-gp表达（图 2)。
[0033] 12. 3 MCF-7/ADR细胞耐药倍数的测定 实验结果显示：ADR 对 MCF-7 细胞 IC5(I= 0. 80±0. 05 ;ADR 对 MCF7/ADR 细胞 IC5Q= 192. 79±0. 02 ;耐药倍数（RF) = 192. 79/0. 80=242倍。此实验结果表明MCF-7/ADR具有很 强的耐药性，可作为下一步实验研究的MDR细胞模型。 12. 4 SS-d对MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞的药物毒性作用 实验结果显示：SS-d 9个浓度分别作用MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞48h后，随着浓 度的增加，MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞的增殖抑制率也相应增加，呈剂量-效应关系（图 3)。SS-d对MCF-7/ADR细胞的非细胞毒性剂量为彡0. 5 μ g/ml，以此作为最佳药物逆转浓 度。
[0034] 12. 5 SS-d作用MCF-7/ADR细胞对MDR1 mRNA的表达的影响 不同浓度SS-d作用MCF-7/ADR细胞显示，SS-d可呈剂量依赖性下调MCF-7/ADR细 胞 MDR1 mRNA 表达（参见图 4,其中，1 :Marker (DL2000) ;2 :对照组；3 :SS-d 0· 1 μ g/ ml+MCF-7/ADR ;4 :SS-d 0· 25 μ g/ml+MCF-7/ADR ;5 :SS-d 0· 5 μ g/ml+MCF-7/ADR)。
[0035] 不同时间SS-d作用MCF-7/ADR细胞显示，SS-d同样呈时间依赖性下调MCF-7/ADR 细胞 MDR1 mRNA 表达（参见图 5,其中，l:Marker(DL2000);2:对照组；3:SS-d 0.5yg/ ml+MCF-7/ADR+24h ;4 :SS-d 0· 5 μ g/ml+MCF-7/ADR+48h ;5 :SS-d 0· 5 μ g/ml+MCF-7/ ADR+72h)。
[0036] 12. 6 SS-d对MCF-7/ADR细胞对P-gp表达的影响 不同浓度SS-d作用MCF-7/ADR细胞对p-gp表达的影响结果显示，随着SS-d浓度的增 加在同样的48h处理时间下，SS-d呈剂量依赖性下调MCF-7/ADR细胞P-gp表达（图6)，与 对照组相比P-gp表达下降具有统计学差异（P〈〇. 05)。
[0037] SS-d不同时间对MCF-7/ADR细胞P-gp表达水平影响结果显示，与空白对照相比， 处理24h、48h与72h后SS-d组P-gp表达有不同程度的下降（图7)，作用24h及48h后 P-gp表达下降有显著统计学差异（P〈〇. 05)，72h后P-gp表达水平有所恢复。
[0038] 12. 7 SS-d对MCF-7/ADR细胞Rh-123积聚和外排的作用 SS-d对于MCF-7/ADR细胞Rh-123积聚作用：Rh-123是特异性的p-gp底物，相比化疗 药物，Rh-123对细胞的毒性小，是指示P-gp功能与表达水平的常用荧光物质。结果显示： 用0. 5 μ g/ml SS-d处理过48小时的MCF-7/ADR耐药细胞，经Rh-123孵育不同时间后，与 空白对照组相比细胞内Rh-123的积聚水平均显著的提高（P〈0. 05)(图8)。
[0039] SS-d对于MCF-7/ADR细胞Rh-123外排的作用：在不同的外排时间下0. 5μ g/ml ss-d处理组细胞内的Rh-123浓度均高于相应时间的对照组细胞（图9)。
[0040] 12. 8 SS-d处理后MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性变化 结果显示，ss-d与不同浓度ADR的联合作用可使MCF-7/ADR的IC5(I值与逆转前的IC5Q 值比较均有显著性差异（P〈 0.01)(表1)。
[0041] 表1 SS-d与ADR联合作用下MCF-7/ ADM细胞对阿霉素的敏感性变化
【权利要求】
1. 柴胡皂苷D在制备肿瘤多药耐药逆转的药物中的用途。
2. 柴胡皂苷D制成的肿瘤MDR逆转剂为医学上可实现的任何剂型。
【文档编号】A61K31/7048GK104138386SQ201410350108
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】盖晓东, 历春, 张瑞兰, 冯丽娟, 陈立松, 王曼力, 孙维琦, 任爱华, 葛宝金 申请人:北华大学