具有梯度弹性模量的生物可降解聚氨酯及其制备的组织工程纤维支架的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物可降解聚氨酯及其制备和在纤维环组织工程中的应用，所述生物可降解聚氨酯具有梯度弹性模量1.5?15.OMPa,可以通过静电纺丝方法制备组织工程纤维支架，纤维环来源干细胞能在支架上增殖，并且干细胞的分化受弹性模量的调控，在高弹性模量的支架上胶原蛋白I型基因表达比较高；而在较低弹性模量的纤维支架上，胶原蛋白II型基因和糖胺聚糖的基因表达量比较高。细胞牵引力测定结果表明在较高弹性模量纤维支架上的细胞牵引力比较小，在较低弹性模量纤维支架上的细胞牵引力比较大，这与实际纤维环的径向区域差异保持一致。这就为研制出能仿生纤维环区域差异性的纤维环组织工程支架提供了可能。
【专利说明】具有梯度弹性模量的生物可降解聚氨酯及其制备的组织工 程纤维支架
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种弹性模量可调的生物可降解聚氨酯及其制备方法，和它在纤维环 组织工程中的应用；具体涉及梯度弹性模量的生物可降解聚氨酯的合成以及所述聚合物在 仿生纤维环区域力学差异性结构的纤维环组织工程中的应用。
【背景技术】
[0002] 椎间盘退变是临床上引起下腰痛的主要原因之一，目前的手术治疗或生物学干预 等手段只能缓解临床症状，却无法从根本上阻止椎间盘退变。近年来组织工程的出现为永 久性修复椎间盘提供了新策略，而纤维环组织工程是成功构建组织工程椎间盘的关键环节 之一。近期的纤维环组织工程研究主要趋向于从模拟实际纤维环组织的斜行交错微观结构 入手构建工程支架，很大程度地提高了仿生纤维环的压缩模量，但是由于仿生纤维环中胶 原蛋白和糖胺聚糖等基质水平与实际组织的基质水平相差甚远，仿生纤维环的力学性能远 达不到实际组织的力学性能。主要是因为目前多数研究的纤维环支架都是单一基质材料， 而实际纤维环组织不仅微观结构复杂，其沿径向各区域的细胞类型、基质组成和力学特性 存在着明显差异。其内区主要由软骨样细胞、纤维软骨细胞及其分泌的II型胶原蛋白和软 骨聚集蛋白聚糖组成；外区主要由纤维样细胞及其分泌的I型胶原蛋白、纤调蛋白和核心 蛋白多糖等组成；中间区的细胞和基质类型则是内外二区的综合。细胞类型与所分泌基质 的区域递变造成了纤维环力学性能的递变，使纤维环具有径向模量梯度特性。因此，在纤维 环组织工程中，除使仿生构件具备与实际组织相似的微观结构外，还应保证其在基质组成 和力学特性上具有与实际纤维环相似的区域特异性，以实现其力学强度的提高。2008年弗 吉尼亚大学Li研究组和国内川北医学院冯刚教授研究组等就从模拟纤维环多区域结构出 发，用环状皮质骨脱钙骨基质明胶（富含I型胶原）模拟纤维环外区，用聚己内酯三醇苹果 酸接种软骨细胞作为内区纤维环并层状环绕皮质骨，发现软骨细胞在聚合材料上生长并分 泌II型胶原及蛋白聚糖，很好的模仿了内区纤维环（富含II型胶原）。
[0003] 大量研究表明细胞的增殖、迁移与分化会受细胞培养基底的力学性质影响，纤维 环细胞对力学效应尤其敏感。宾夕法尼亚大学的Nicoll研究组研究了绵羊椎间盘内层和 外层纤维环细胞在单层培养和三维培养过程中的变化，发现经多次传代或长时间培养后， 两种细胞在细胞形态、基因表达及蛋白表达方面无差异。但是，2011年上海交大戴力扬教授 研究组针对大鼠纤维环细胞的研究发现，在不同弹性模量的凝胶上培养时，细胞中基质如 Colla l、Coll2a l、aggrecan的mRNA表达直接受基材的弹性模量调控。由此表明，纤维环 工程支架材料的弹性模量将是纤维环组织工程支架设计中一个重要的参数。2006年，宾州 大学的Discher研究组发现间充质干细胞的分化也会受到细胞培养基材弹性模量的调控， 间充质干细胞于神经组织弹性模量类似的柔软基材上会分化成神经细胞，于模量更高、与 脂肪组织、肌肉组织或骨组织类似的基材上则会依次分化成为脂肪细胞、肌细胞或成骨细 胞。近几年来，已有很多研究表明在组织工程构建中，可以通过构建与目标组织弹性模量接 近的支架材料来诱导种子干细胞分化成为目标组织中相应的细胞类型，已成为组织工程学 界的研究热点。
[0004] 综上，在纤维环组织工程支架构建中，应考虑到纤维环组织的细胞与基质的区域 特异性、以及弹性模量径向梯度这一特性，除使仿生构件具备与实际组织相似的微观结构 夕卜，还应具有与实际组织相仿的模量梯度特性，以诱导纤维环源干细胞在不同区域分化成 为与实际纤维环组织相应类型的细胞，并能维持相应的细胞形态和分泌相应的细胞外基 质，使其在基质组成和力学特性上具有与实际组织相似的区域特异性，以恢复纤维环的正 常结构和功能。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有梯度弹性模量的生物可降解聚氨酯。
[0006] 为解决上述问题，本发明第一方面提供的技术方案是：一种具有梯度弹性模量 的生物可降解聚氨酯PECUU，其软段为A-B-A型聚碳酸酯二醇，其中A为聚三亚甲基碳酸 酯（PTMC)，B段为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0);硬段为1，6_二异氰酸 酯（HDI)和丁二胺（BDA)，聚氨酯的硬段与软段比例为1. 5 :1?2. 0 :1，弹性模量为1. 5? 15MPa。
[0007] 本发明的优选技术方案中，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0) 的分子量为llOODa ;聚三亚甲基碳酸酯（PTMC)的分子量为0?2000Da。
[0008] 本发明的第二方面提供一种组织工程纤维支架的制备方法，所述组织工程支架是 由上述生物可降解聚氨酯通过静电纺丝的方法制备得到，包括以下步骤：
[0009] (1)将生物可降解聚氨酯PECUU溶解于六氟异丙醇中得到聚氨酯静电纺丝溶液， 质量浓度为20?25% ;
[0010] (2)将聚氨酯静电纺丝液经静电纺丝成型设备制成纤维支架，静电纺丝过程的工 作电压8?20KV，接收板距离2?15cm，进样速率1. 0?3. OmL/h的工作条件下进行；
[0011] (3)将纤维支架在40°C下真空干燥2?5天，得到组织工程纤维支架。
[0012] 本发明的第三方面提供一种组织工程纤维支架，其由下述方法制备得到：将生物 可降解聚氨酯PECUU溶解于六氟异丙醇中得到质量浓度为20?25%聚氨酯静电纺丝溶液； 将聚氨酯静电纺丝液经静电纺丝成型设备制成纤维支架，其中静电纺丝的工作电压8? 20KV，接收板距离2?15cm，进样速率1. 0?3. OmL/h ;最后40°C真空干燥2?5天，得到 组织工程纤维支架。
[0013] 本发明的优选技术方案中，所述组织工程支架的厚度为0. 10mm-0. 15mm，纳米纤维 无规则排列，纤维直径为200?400nm。
[0014] 本发明的第四方面提供一种仿生纤维环区域力学差异性结构的纤维环组织工 程支架，包括如下步骤：将灭菌后的组织工程纤维支架置于细胞培养板内，用培养基浸泡 8-12小时，在所述细胞培养板内种植纤维环来源干细胞，37°C、5 %二氧化碳条件下孵育 7_8天后得到。
[0015] 本发明的优选技术方案中，所述培养基为DMEM培养基。
[0016] 本发明的优选技术方案中，所述细胞培养板为96孔或24孔板，所述孔内孔接种 2*103-5*104 个细胞。
[0017] 因此，由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0018] 1.聚碳酸酯型聚氨酯中作为软段的聚碳酸酯具有极好的室温柔顺性；降解产物 为中性的二元醇和二氧化碳，不会产生聚内酯降解后的酸性环境；且属于表面溶蚀材料， 能在生理条件下维持较长时间的力学性能。生物可降解聚氨酯具有优异的力学性能，良好 的生物相容性和生物可降解性，并可以方便地进行分子结构设计获得力学性能各异的聚氨 酯。
[0019] 2.不同弹性模量的纤维环组织工程支架具有仿生纤维环内外层的区域力学性能 差异。在高弹性模量的支架上胶原蛋白I型基因表达比较高；而在较低弹性模量的纤维支 架上，胶原蛋白II型基因和糖胺聚糖的基因表达量比较高。细胞牵引力测定结果表明在较 高弹性模量纤维支架上的细胞牵引力比较小，在较低弹性模量纤维支架上的细胞牵引力比 较大，这与实际纤维环的径向区域差异保持一致。这就为研制出能仿生纤维环区域差异性 的纤维环组织工程支架提供了可能。
[0020] 3.不同弹性模量的纤维环组织工程支架接种纤维环来源干细胞后，能够调控纤维 环来源干细胞的分化，细胞增殖分化后的特定蛋白和基因的表达（胶原蛋白I型、胶原蛋白 II型、糖胺聚糖）、以及细胞牵引力受到支架弹性模量的调控，与实际纤维环的区域差异性 保持一致。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0022] 图1为实施例中生物可降解聚氨酯的结构表征。A :核磁表征，B :红外表征。
[0023] 图2为实施例中不同弹性模量聚氨酯静电纺丝纤维支架SEM观察，依次放大倍数 为1000倍、2000倍和5000倍。
[0024] 图3为实施例中纤维环来源干细胞在不同弹性模量聚氨酯静电纺丝纤维支架上 的细胞增殖。
[0025] 图4为实施例中纤维环来源干细胞在不同弹性模量聚氨酯静电纺丝纤维支架上 孵育的细胞形态观察。
[0026] 图5为实施例中纤维环来源干细胞在不同弹性模量聚氨酯静电纺丝纤维支架上 培养7天后的生化分析。图5A :DNA含量检测；图5B :ELISA定量检测GAG含量；图5C :ELISA 定量检测Collagen-I含量；图? :ELISA定量检测Collagen-II含量。
[0027] 图6为实施例中纤维环来源干细胞在不同弹性模量聚氨酯静电纺丝纤维支架上 培养7天后的基因表达分析。图6A :RT_qPCR检测Collagen I ;图6B :RT_qPCR检测Collagen II ;图 6C :RT_qPCR 检测 Aggrecan。
[0028] 图7为实施例中纤维环来源干细胞在不同弹性模量聚氨酯静电纺丝纤维支架上 培养后的细胞牵引力显微术测试。图7A :实施例中PECUU1、PECUU2、PECUU3、PECUU4四组 CTFM测试，其中（a-d)为四个组培养后的细胞；（e-h)为四个组细胞的位移域图；（i-1)为 四个组细胞的细胞牵引力图；图7B-图7C :分别为各组细胞的牵引力和细胞面积。
[0029] 图8为生物可降解聚氨酯PECUU的制备流程图。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合附图描述本发明【具体实施方式】。
[0031] 一、材料及设备
[0032] 1.实验动物或材料来源及处理
[0033] 纤维环来源干细胞是从6周龄新西兰大白兔（苏州大学实验动物中心提供）的纤 维环中提取，具有干细胞集落形成的特性，并具有多向分化能力，按最佳接种密度进行培养 的纤维环源集落形成细胞用于实验。具体提取方法如下：从5?7月龄的新西兰大白兔中 取新鲜的纤维环组织，放入含l〇〇U/ml青霉素和100 μ g/mL链霉素的DMEM低糖培养基中。 在超净台中，将纤维环组织剔除干净，剪碎，以l〇〇U/ml的I型胶原酶消化5小时。lOOOrpm 离心，PBS洗3遍后离心，以含20 %胎牛血清和100U/ml青霉素、100 μ g/mL链霉素的DMEM 低糖培养基重悬细胞沉淀，接种在培养皿中，在37°C、5% C02的条件下培养，每2天换一次 液。细胞在原代和传代培养后贴壁生长，未贴壁的细胞则在换液时被移除。
[0034] 聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（llOODa)、三亚甲基碳酸酯、1，6_二异氰酸酯、 1，4- 丁二胺等为普通市售产品，需进行干燥处理。
[0035] 二、实施例
[0036] 生物可降解聚氨酯PECUU的制备方法：首先，通过开环聚合的方法制备上述A-B-A 型聚碳酸酯二醇，以分子量为ll〇〇Da的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0为引发剂，开环三亚甲基碳酸酯单体 制备得到；然后，以此PTMC-PE0-PP0-PE0-PTMC为软段，以1，6-二异氰酸酯和丁二胺为硬 段，两步反应得到生物可降解聚氨酯PECUU。其合成路线如图8所示。
[0037] 实施例一，弹性模量为13. 4MPa的PECUU1的合成
[0038] 氩气保护下，将干燥后的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0 (1100Da) 10g溶于甲苯（质量分数为 15% )，然后在搅拌条件下加入1，6_二异氰酸酯的甲苯溶液（3.05gHDI，质量分数为 15% )，加入催化剂辛酸亚锡40mg后在75°C油浴中反应4小时。然后，冰浴冷却，滴加入含 有1.60g 丁二胺的DMF溶液（质量分数为1%)，不断搅拌，保持溶液澄清。反应过夜后，沉 淀于乙醇/水（v/v，30/70)的混合溶剂中两次，真空干燥。通过FT-IR表征表明其结构为 聚醚型聚氨酯，通过浇铸成膜后进行力学拉伸测试，其弹性模量为13. 4MPa。
[0039] 实施例二，弹性模量为6. 4MPa的PE⑶U2的合成
[0040] 氩气保护下，将干燥后的PE0-PP0-PE0(1100Da)6.5g溶于85mL甲苯，然后加入三 亚甲基碳酸酯单体9. 65g，加入辛酸亚锡催化剂0. 48g，与110°C条件下聚合反应24小时。 然后将至室温后，在搅拌条件下加入1，6-二异氰酸酯的甲苯溶液（1.98g HDI，质量分数为 15% )，再升温至75°C反应4小时。冰浴冷却后，滴加入含有1. 04g 丁二胺的DMF溶液（质 量分数为1 % )，不断搅拌，保持溶液澄清。反应过夜后，沉淀于乙醇/水（v/v，30/70)的混 合溶剂中两次，真空干燥。通过FT-IR表征表明其结构为聚碳酸酯型聚氨酯PECUU，通过浇 铸成膜后进行力学拉伸测试，其弹性模量为6. 4MPa。
[0041] 实施例三，弹性模量为5. IMPa的PE⑶U3的合成
[0042] 氩气保护下，将干燥后的PE0-PP0-PE0(1100Da)5. 0g溶于100mL甲苯，然后加入三 亚甲基碳酸酯单体14. 84g，加入辛酸亚锡催化剂0. 37g，与110°C条件下聚合反应24小时。 然后将至室温后，在搅拌条件下加入1，6-二异氰酸酯的甲苯溶液（1.53g HDI，质量分数为 15% )，再升温至75°C反应4小时。冰浴冷却后，滴加入含有0. 8g 丁二胺的DMF溶液（质 量分数为1 % )，不断搅拌，保持溶液澄清。反应过夜后，沉淀于乙醇/水（v/v，30/70)的混 合溶剂中两次，真空干燥。通过FT-IR表征表明其结构为聚碳酸酯型聚氨酯PECUU，通过浇 铸成膜后进行力学拉伸测试，其弹性模量为5. IMPa。
[0043] 实施例四，弹性模量为2. 5MPa的PE⑶U4的合成
[0044] 氩气保护下，将干燥后的PEO-PPO-PEO(llOODa) 10. 0g溶于100mL甲苯，然后加入 三亚甲基碳酸酯单体14.84g，加入辛酸亚锡催化剂0.73g，与110°C条件下聚合反应24小 时。然后将至室温后，在搅拌条件下加入1，6-二异氰酸酯的甲苯溶液（1.53g HDI，质量分 数为15% )，再升温至75°C反应4小时。冰浴冷却后，滴加入含有1. 20g 丁二胺的DMF溶液 (质量分数为1% )，不断搅拌，保持溶液澄清。反应过夜后，沉淀于乙醇/水（v/v，30/70) 的混合溶剂中两次，真空干燥。通过FT-IR表征表明其结构为聚碳酸酯型聚氨酯PECUU，通 过浇铸成膜后进行力学拉伸测试，其弹性模量为2. 5MPa。
[0045] 实施例五，弹性模量为13. 4MPa的聚氨酯组织工程纤维支架的制备
[0046] 将实施例一制备得到的PECUU1聚合物3g溶解于8mL六氟异丙醇，然后通过静电 纺丝成型设备制成纤维支架，静电纺丝过程是在工作电压8?25KV，接收板距离15cm，进样 速率3. 0mL/h的工作条件下进行，然后将所得的纤维支架在40°C下真空干燥2?5天。
[0047] 实施例六，弹性模量为6. 4MPa的聚氨酯组织工程纤维支架的制备
[0048] 将实施例一制备得到的PECUU2聚合物3g溶解于8mL六氟异丙醇，然后通过静电 纺丝成型设备制成纤维支架，静电纺丝过程是在工作电压8?25KV，接收板距离15cm，进样 速率3. 0mL/h的工作条件下进行，然后将所得的纤维支架在40°C下真空干燥3天。
[0049] 实施例七，弹性模量为5. IMPa的聚氨酯组织工程纤维支架的制备
[0050] 将实施例一制备得到的PECUU3聚合物3g溶解于8mL六氟异丙醇，然后通过静电 纺丝成型设备制成纤维支架，静电纺丝过程是在工作电压8?25KV，接收板距离15cm，进样 速率3. 0mL/h的工作条件下进行，然后将所得的纤维支架在40°C下真空干燥3天。
[0051 ] 实施例八，弹性模量为2. 5MPa的聚氨酯组织工程纤维支架的制备
[0052] 将实施例一制备得到的PECUU4聚合物3g溶解于8mL六氟异丙醇，然后通过静电 纺丝成型设备制成纤维支架，静电纺丝过程是在工作电压8?25KV，接收板距离15cm，进样 速率3. 0mL/h的工作条件下进行，然后将所得的纤维支架在40°C下真空干燥3天。
[0053] 实施例九，纤维环原干细胞在组织工程支架上的细胞增殖
[0054] 将实施例五至实施例八制备的组织工程纤维支架置于96孔板中，经钴60辐照后， 加入培养基过夜。然后，接种纤维环原干细胞，密度为每孔2*10 3个细胞，37°C和5%二氧化 碳条件下孵化1天、3天、5天和7天，通过MTS测定细胞的增殖情况，结果表明纤维环原干 细胞能在实施例五至实施例八制备的组织工程纤维支架上很好的增殖，并且速度要快于在 培养板上的细胞。并且，通过细胞骨架染色也表明细胞在支架上能够粘附和增殖。
[0055] 实施例十，纤维环来源干细胞在不同弹性模量的组织工程纤维支架上的分化
[0056] 将实施例五至实施例八制备的组织工程纤维支架置于24孔板中，经钴60辐照后， 加入培养基过夜。然后，接种纤维环来源干细胞，密度为每孔5*10 4个细胞，37°C和5%二氧 化碳条件下孵化7天。
[0057] 通过DNA测定和ELISA方法测定特定蛋白的表达包括I型胶原蛋白、II型胶原蛋 白和糖胺聚糖，以及利用RT-PCR技术测定细胞内的基因表达包括胶原蛋白I型、胶原蛋白 II型和糖胺聚糖，并通过CTFM技术测定细胞牵引力。结果表明在具有较高弹性模量的纤维 支架上，I型胶原蛋白和其基因的表达量都比较高；而在较低弹性模量的纤维支架上，II型 胶原蛋白和糖胺聚糖及其基因的表达量比较高。细胞牵引力测定结果表明在较高弹性模量 纤维支架上的细胞牵引力比较小，在较低弹性模量纤维支架上的细胞牵引力比较大，这与 实际纤维环的径向区域差异保持一致。
[0058] DNA测定：Hoechst33258荧光染料DNA定量检测试剂盒；糖胺多糖（GAG)测定： (GAG的ELISA定量检测试剂盒）；1型胶原（Collagen-I)和II型胶原（Collagen-II)测 定：兔I型胶原和II型胶原ELISA定量检测试剂盒。
[0059] RT-qPCR检测：RT-qPCR基因检测使用 SsoFast?EvaGreen Supermix 定量 PCR检测 试剂盒，每个样品5个复孔，具体的反应条件为：①95°C，10min ;②95°C，20sec ;③最佳退 火温度20sec ;④72°C 20sec ;⑤40次循环；⑥溶解曲线65?95°C，按0. 5°C递增，递增一 次反应5sec。引物序列见下表：
[0060]
【权利要求】
1. 一种具有梯度弹性模量的生物可降解聚氨酯，其特征在于，其软段为a-b-a型聚 碳酸酯二醇，其中A为聚三亚甲基碳酸酯（PTMC)，B段为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯 (PEO-PPO-PEO);硬段为1，6_二异氰酸酯（HDI)和丁二胺（BDA)，聚氨酯的硬段与软段比例 为L 5 :1?2. 0 :1，弹性模量为L 5?15MPa。
2. 根据权利要求1所述的生物可降解聚氨酯，其特征在于，所述聚氧乙烯-聚氧丙 烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO)的分子量为llOODa;聚三亚甲基碳酸酯（PTMC)的分子量为 0 ?2000Da。
3. -种组织工程纤维支架的制备方法，包括以下步骤： (1) 将权利要求1或2所述的具有梯度弹性模量的生物可降解聚氨酯溶解于六氟异丙 醇中，得到聚氨酯静电纺丝溶液，质量浓度为20?25% ; (2) 将聚氨酯静电纺丝液经静电纺丝制成纤维支架，静电纺丝过程的工作电压8? 20KV，接收板距离2?15cm，进样速率1. 0?3. OmL/h的工作条件下进行； (3) 将纤维支架在40°C下真空干燥2?5天，得到组织工程纤维支架。
4. 由权利要求3所述的方法制备得到的一种组织工程纤维支架。
5. 根据权利要求4所述的组织工程纤维支架，其特征在于，所述组织工程支架的厚度 为0· 10mm-0· 15mm,纳米纤维无规则排列，纤维直径为200?400nm。
6. -种仿生纤维环区域力学差异性结构的纤维环组织工程支架的制备方法，包括如下 步骤：将灭菌后的组织工程纤维支架置于细胞培养板内，用培养基浸泡8-12小时，在所述 细胞培养板内种植纤维环来源干细胞，37°C、5%二氧化碳条件下孵育7-8天后得到。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为DMEM培养基。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养板为96孔或24孔板， 所述孔内孔接种2*103-5*10 4个细胞。
【文档编号】A61L27/58GK104208748SQ201410357194
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】李斌, 朱彩虹, 杨惠林 申请人:苏州大学