一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法和应用。纳米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜碱(PCB)或聚乙二醇(PEG)的亲水层，内部是至少含有pH敏感的聚合物单元的疏水核，亲水层与疏水核之间是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(PDS)单元间经交联反应形成的二硫键(S‐S)交联层。在pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒的表面亲水层上可修饰上肿瘤靶向基团，通过纳米粒对肿瘤细胞的特异性靶向作用，促进纳米粒在肿瘤组织的富集和肿瘤细胞的内吞。本发明提供的双敏感层交联纳米粒，其生物相容性好，毒性低。在肿瘤细胞内谷胱甘肽作用下交联结构解离，促进药物释放。制备方法简便、稳定性良好、便于操作推广。
【专利说明】一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法 和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高分子化学和生物医学工程领域，特别是涉及一种pH与氧化还原双 敏感聚合物层交联纳米粒，及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前，癌症（即恶性肿瘤）是世界上发病率和死亡率都比较高的疾病之一。在众 多治疗癌症的手段中，化疗是最重要的治疗方法之一，但由于体循环的清除作用、肿瘤组织 低渗透性、肿瘤细胞耐药性等问题，严重阻碍了抗肿瘤药物向肿瘤细胞的递送效率，导致疗 效差。此外，现有抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织也产生严重的毒副作用，导 致临床治疗往往因毒副作用大而失败，或因毒副作用的限制无法提高剂量而达不到理想治 疗效果。可见，要提高化疗效果、降低毒副作用，必须提高抗肿瘤药物的靶向递送效率，降低 药物在正常组织内的聚集。纳米载体与各种促进肿瘤靶向递送手段的结合，为抗肿瘤药物 的革巴向递送带来了希望。
[0003] 此外，肿瘤组织具有有别于正常组织的特异微环境，首先表现为肿瘤组织与正常 组织之间存在pH梯度：血液和正常组织的pH约为7. 4,而肿瘤组织的pH在6. 8左右，肿瘤 细胞内的内涵体及溶酶体的pH为4. 0?6. 5。其次，肿瘤细胞质内的谷胱甘肽（GSH)的浓 度（?lOmmol)远高于血液和正常组织内的谷胱甘肽浓度（2?20 μ mol)。因此，为提高抗 肿瘤药物的靶向递送效率，人们设计了多种pH、氧化还原敏感的纳米载体，旨在促进药物在 肿瘤组织及肿瘤细胞内的释放。但是，非交联结构的pH或GSH敏感的纳米载体，不仅体循 环稳定性较差，而且在正常生理环境里24h内有高于20%的药物被释放出来。为提高纳米 粒的稳定性，人们采用pH或GSH敏感的化学键进行核或壳交联。虽然单一敏感的交联结构 能够有效降低药物在体循环过程中的释放，但难以实现肿瘤细胞内的药物快速释放。
[0004] 本发明目的在于提供一种肿瘤靶向并响应肿瘤细胞内环境药物释放的纳米粒，特 点是：在人体循环中结构稳定并有效抑制药物释放，能够靶向肿瘤组织并在肿瘤细胞内协 同响应低pH和GSH刺激，快速释放药物的纳米粒，解决抗肿瘤药物肿瘤靶向递送问题。
【发明内容】
[0005] 本发明中，以活性可逆加成链转移（RAFT)聚合方法，制备结构和组成可控的两亲 性两性离子聚合物，键合对恶性肿瘤具有特定靶向作用的配体，即靶向基团，构建抗肿瘤药 物靶向递送的纳米载体。旨在通过靶向基团，亲水段，二硫键可逆交联壳层、pH敏感疏水内 核的协同作用，提高纳米载体的靶向递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的定位可控释放，以 解决现有技术中纳米药物载体的体循环清除速率快、靶向性差、控释效果差等诸多问题。
[0006] 首先，本发明提供了一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于，所 述的纳米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜碱（PCB)或聚乙二醇（PEG)的亲水层，内部是至少 含有pH敏感的聚合物单元的疏水核，亲水层与疏水核之间是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶 二硫醚（ros)单元间经交联反应形成的二硫键（s-s)交联层。
[0007] 优选的，所述的pH敏感的聚合物为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PDPA)。PDPA 在pH = 7. 4环境下疏水，即保持纳米粒内核的疏水性，用于药物负载和体循环稳定性；在 pH6. 5以下能质子化变为亲水。因此，在体循环（pH7. 4)下，Η)ΡΑ为内核的纳米粒保持稳 定；但被肿瘤细胞摄取后，在内涵体/溶酶体PH4. 0?6. 5条件下，PDPA链上的二异丙氨基 发生质子化而使内核由疏水变为亲水，协同交联层二硫键（S-S)的GSH响应性断裂，促进纳 米粒在肿瘤细胞内崩解并快速释放药物。
[0008] 优选的，pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒的表面亲水段为两性离子聚合物聚 羧酸甜菜碱（PCB)，其能够通过静电作用形成稳定的水化层，降低RES对纳米粒的体循环清 除。
[0009] 优选的，在pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒的表面亲水层上可修饰上肿瘤靶 向基团，通过纳米粒对肿瘤细胞的特异性靶向作用，促进纳米粒在肿瘤组织的富集和肿瘤 细胞的内吞。
[0010] 优选的，靶向基团与聚合物的摩尔比为〇. 01?1。
[0011] 优选的，肿瘤靶向基团选自多肽 RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、 CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白细胞介素 IL-13p、叶酸等；其中的R、G、D、C、K等大写字母是各 种氨基酸的单字符缩写符号，如R代表精氨酸，G代表甘氨酸。
[0012] 进一步优选的，由式1所示的l)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或2) RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA与PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物共组装形成纳米粒，再经PDS的交联反 应形成层交联纳米粒。其特征在于（如附图1所示），该纳米粒最外层为能够与肿瘤血管内 皮细胞和肿瘤细胞表面过表达的整合素受体结合的RGD和两性离子PCB ;内部为高度pH敏 感的Η)ΡΑ疏水核；亲水层与疏水核之间为二硫键交联层。该纳米粒，通过亲水段两性离子 的静电作用形成稳定的水化层，使得纳米粒在血液循环中能够稳定存在，减少RES系统的 清除，延长体循环时间；RGD靶向配体，提高纳米载体在肿瘤组织的富集和滞留，增强肿瘤 细胞对纳米药物载体的摄取；二硫键壳层交联，抑制药物在正常生理条件下的释放以降低 毒副作用，而被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内谷胱甘肽（GSH?10mM)作用下，二硫键断裂 使交联结构快速解离；酸敏感的疏水内核在内涵体/溶酶体微酸环境中（pH4. 0?6. 5)，发 生疏水-亲水转变而使纳米粒解体，促进药物快速释放，提高药效。
[0013]
【权利要求】
1. 一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒表面是至少 含有聚羧酸甜菜碱（PCB)或聚乙二醇（PEG)的亲水层，内部是至少含有pH敏感的聚合物单 元的疏水核，亲水层与疏水核之间是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚（ros)单元经二硫 键（S-S)形成的交联层。
2. 权利要求1所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于所述的pH敏 感的聚合物为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PDPA)。
3. 权利要求2所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于表面亲水层带 有肿瘤靶向基团。
4. 权利要求3所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于肿瘤靶向基团 选自多肽 RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白细胞 介素 IL-13p或叶酸。
5. 权利要求4所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于是由式1所 示的 l)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 或 2)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 与 PCB-b-PDS-b-PDPA 聚合 物共组装形成纳米粒，再经ros的交联反应形成二硫键（S-S)层交联；所述的嵌段聚合物 RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 或 PCB-b-PDS-b-PDPA 中，PCB 聚合度 X 为 25 ?70 的整数，PDS 聚 合度y为1?15的整数，PDPA聚合度Z为25?70的整数；
6. 权利要求5所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒的制备方法，是采用活性可 逆加成链转移（RAFT)聚合方法制备，特征是步骤如下： 1) 采用三硫代十二烷基-2-异丙酸酯（CTAm)为RAFT链转移剂，偶氮二异丁腈（AIBN) 为引发剂，逐步引发羧酸甜菜碱叔丁酯甲基丙烯酸甲酯（CB-tBU)、甲基丙烯酰胺乙基吡啶 二硫醚（DS)和甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（DPA)聚合，得到PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌 段聚合物； 2) 二甲基亚砜（DMSO)中，PCB (tBU) -b-PDS-b-PDPA与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS) 和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC.HC1)于室温下反应2-4h后， 加入巯基乙醇淬灭未反应的EDC. HCl，之后加入RGD，于室温下继续反应12-36h，得到 RGD-PCB (tBU) -b-PDS-b-PDPA 三嵌段聚合物； 3) 将 RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA 或 PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA 三嵌段聚合物在室 温下用三氟乙酸（TFA)水解PCB (tBU)嵌段上的叔丁酯，得到RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或 PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。
7. 权利要求1?5任意一项所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒载药应用，其 特征是纳米粒核内包载疏水药物，其中药物含量为纳米粒质量的〇. 5-15% ;所述的纳米粒 的平均粒径优选为50-300nm。
8. 权利要求7所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒应用，其特征是所述疏水性 药物选自阿霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱、长春花碱、地塞米松、姜黄素或博 来霉素中的一种或多种的任意组合。
9. 权利要求7或8所述的纳米粒应用方法，特征是：将疏水性药物与嵌段共聚物如 RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或（和）PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亚砜中，加入二硫苏糖 醇（DTT)，在氮气保护下至少反应15min ;然后将有机相溶液置于薄膜透析袋中，在1000? 2000倍体积的脱氧的pH = 7. 4的0. OlM的磷酸盐缓冲溶液中透析提纯；透析结束后，透析 袋中形成的载药纳米粒溶液，在超声作用下至少反应，完成二硫键层交联，得到PH与氧化 还原双敏感的层交联纳米粒水分散液，冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉。
10. 权利要求1所述的PH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒的应用，其特征在于可用 于药物、核酸、蛋白、多肽、多糖类大分子的体内递送，或用于诊断试剂、荧光探针的递送；所 述载药双敏感层交联纳米粒剂型为冻干粉或者为生理盐水分散液针剂。
【文档编号】A61K47/34GK104231193SQ201410366575
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】董岸杰, 黄平升, 邓联东 申请人:天津大学