一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法，所述抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒由同时表达的流感病毒基质蛋白M1和融合蛋白HA-24构成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白与鱼类传染性脾肾坏死病毒ORF24构建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ?ID?NO:3、5、7、9或11所示。所述抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：制备融合基因HA-24；制备重组杆状病毒穿梭载体rBacmid；制备重组昆虫杆状病毒；获得同时表达流感病毒基质蛋白M1和融合蛋白HA-24的病毒样颗粒。所述疫苗包含上述任一项所述的病毒样颗粒。本发明混合病毒样颗粒疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，能预防鱼类传染性脾肾坏死病毒病，而且非常安全。
【专利说明】一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒样颗粒领域，尤其涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒 和疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 传染性脾肾坏死病毒（Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus, ISKNV) 属于虹彩病毒科，可以使多种鱼类得传染性脾肾坏死病，造成鳜鱼、石斑、卵形鲳鰺等大量 死亡，感染后10天内死亡可达90%以上，给养殖鱼类带来很大的经济损失。
[0003] 目前控制该病的最好方法为疫苗免疫，但国内外尚无有效药物。全病毒灭活疫苗 的效果不理想，保护率一般不超过50%。日本、韩国有报道采用DNA疫苗控制与ISKNV相似 的其它虹彩病毒，并取得一定的成效。但DNA疫苗的使用具有危险性，不能直接进入人类的 食物链。有学者采用大肠杆菌表达ISKNV的结构蛋白，制备亚单位疫苗，取得一定的效果， 但也达不到产业生产对疫苗的要求。因此，提高ISKNV基因工程疫苗的免疫效力，开发新的 疫苗具有紧迫性。
[0004] 科学研究证明病毒样颗粒（VLPs)具有很好的免疫效力和应用前景。VLPs是含有 某种病毒的一个或多个主要结构蛋白，在体外表达系统中自动组装成的不包含病毒核酸的 空心颗粒。流感病毒的表面膜蛋白HA是引起机体产生免疫应答的主要诱发物，而基质蛋白 Ml是形成病毒外壳的主体，亦可作为组织型免疫应答的诱发物。有关的研究证明，基质蛋白 Ml的正确表达，是保证病毒外壳形成的重要环节。Ml蛋白和HA这2个主要结构蛋白同时 表达就可以自动组装成空心的没有病毒基因组的病毒样颗粒。VLPs的形态和大小与真实的 病毒粒子相同或相似，所以能有效的诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，作为一种新型 疫苗显示出了良好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，有必要针对上述疫苗效力差等问题，提供一种传染性脾肾坏死病毒的 病毒样颗粒和疫苗及其制备方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒，由同时表达的流感病毒基质蛋白Ml 和融合蛋白HA-24构成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白与鱼类传染性脾肾坏死病 毒0RF24构建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所示。
[0008] -种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0009] ①将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白0RF24基因替换流感病毒HA基因的一部 分，二者构成融合基因 HA-24,融合基因 HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所 示；
[0010] ②将流感病毒的基质蛋白Ml基因和融合蛋白HA-24基因插入昆虫杆状病毒 pFastBac-Dual载体上，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，并转化含有杆状病毒穿 梭载体的DHlOBac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid ;
[0011] ③利用脂质体转染试剂，将含外源基因的重组杆状病毒穿梭载体rBacmid转染入 宿主昆虫细胞株sf-9中，获得重组昆虫杆状病毒；
[0012] ④培养受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞，使其得以高效地表达流感病毒 的结构蛋白Ml和融合蛋白HA-24,并自动组装成同时表达流感病毒基质蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的病毒样颗粒。
[0013] 优选地，步骤①中的HA-24基因是由传染性脾肾坏死病毒0RF24与流感病毒HA基 因先合成融合基因，然后用PCR扩增而成。
[0014] 优选地，步骤③中Sf-9细胞在27°C培养4-5天，收集细胞培养上清液，再侵染新的 sf-9细胞，获得放大后高滴度的重组昆虫杆状病毒。
[0015] 优选地，步骤④中受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞在27°C培养3天，表 达的流感病毒Ml蛋白和融合蛋白HA-24,自动组装成VLPs。
[0016] 一种包含上述任一项所述的病毒样颗粒的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫 苗。
[0017] 本发明提供的抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法具有明 显的优点和效果：
[0018] (l)VLPs疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，能预防 鱼类传染性脾肾坏死病毒病。
[0019] (2)病毒样颗粒不含病毒基因组，这种空壳结构的VLPs在免疫动物体内就不会发 生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程不接触活的有感染力的病毒，因此 非常安全。
[0020] (3)和一般的基因工程亚单位疫苗比较，在这种新型的病毒样颗粒中，大量的传染 性脾肾坏死病毒结构蛋白位于颗粒表面，能刺激机体产生更好的免疫反应，免疫效果更好。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中PCR扩增产物电泳图。其中，泳道1为marker，泳道2为 HA-24,泳道3为Ml，泳道4为空白对照。
[0022] 图2为本发明实施例1中Ml和HA-24基因在悬浮培养的昆虫细胞sf-9中表达的 Western blots图。其中，泳道1为marker,泳道2为阴性对照，泳道3为实验组样品。
[0023] 图3为本发明实施例1中纯化后的病毒样颗粒的Western blots图。其中，泳道 1为marker，泳道2为阴性对照，泳道3为实验组样品。
【具体实施方式】
[0024] 本发明借助流感病毒VLPs平台，将鱼类传染性脾肾坏死病毒的主要结构蛋白 0RF24与流感病毒HA的一部分融合形成一个新的融合蛋白HA-24,然后在昆虫细胞中同时 表达HA-24和Ml蛋白，自动组装成VLPs。以表达融合蛋白HA-24的VLPs作为抗原，制备一 种预防鱼类传染性脾肾坏死病毒的新型基因工程疫苗。本发明新型的鱼类传染性脾肾坏死 病毒基因工程疫苗还可以包括佐剂。
[0025] 本发明以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统为基础，将流感病毒HA蛋白与鱼类 传染性脾肾坏死病毒0RF24构建成融合蛋白HA-24,同时表达流感病毒基质蛋白Ml和融合 蛋白HA-24,二者共同自动组装构建出类似流感病毒的VLP空壳粒子。
[0026] 首先，将鱼类传染性脾肾坏死病毒0RF24基因替换流感病毒HA基因的一部分，二 者构成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替换相等长度的HA基 因的5'端序列，以保障融合基因 Η A-24的长度与HA基因长度大致相等。
[0027] 然后，按照形成流感病毒样颗粒的方法，将流感病毒的基质蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的DNA片断，构建于昆虫杆状病毒的载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传 物质DNA内，利用宿主昆虫细胞表达这些外源蛋白，自动组装成不含流感病毒遗传物质的 病毒样颗粒，病毒样颗粒形成后将释放入细胞培养液中。这样形成的VLPs具有传染性脾肾 坏死病毒0RF24蛋白。
[0028] 实施例1抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒
[0029] 1、Ml基因和HA-24的扩增
[0030] 1. 1融合基因 HA-24的合成
[0031] 将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白基因0RF24替换H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者构成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替换相当 长度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的长度与HA基因长度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的长度可做相应的调整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:3所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。SEQ ID N0:3的第1-936位碱基为0RF24的基因， 第937-1701位碱基为HA的基因 ；SEQ ID N0:4的第1-312位氨基酸为0RF24的氨基酸，第 313-566位碱基为HA的氨基酸。融合基因根据其核酸序列人工合成。
[0032] 1. 2流感病毒RNA抽提和RT-PCR
[0033] 流感病毒RNA的提取按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用 说明书（方法）进行。分别取250yL流感病毒H1N1亚型毒株感染尿囊液和750yL TRIzol LS，加入1. 5 mL微量离心管内，用吸管吹打充分混匀，室温放置10min ;加入200 μ L氯仿，剧 烈振荡15s，室温静置5分钟后，4°C下12000rpm离心15min ;取上清于一新的灭菌1. 5mL离 心管内，加入500 μ L异丙醇，充分混勻，室温放置10min，在4°C下12000r/m离心10min ;倾 去上清，沉淀中加入70 %的乙醇750 μ L，轻轻混匀，洗涤一次，4°C下12000r/m离心15min， 弃去上清，风干；加入10yL用DEPC水处理的无 RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉淀），直 接用于RT-PCR或-80°C保存备用。
[0034] RT-PCR参照TaKaRa的AMV反转录酶的使用说明进行，在20 μ L反应体系中分别 加入以下组分：RNA :3μ L ;5XRT buffer :4μ L ;dNTPs :4μ L ;RNA 酶抑制剂：0· 5μ L ;引物 UP :1μ L ;引物DN:ly L ;AMV :2μ L ;DEPCtK :补至 20μ L。混匀后，室温放置 10min，42°C保 温lh，冰浴2min，RT产物直接用于PCR扩增或-20°C保存。
[0035] 1. 3HA-24 和 Ml 基因的 PCR 扩增
[0036] 根据Ml基因序列（SEQ ID N0:1，其蛋白序列为SEQ ID N0:2)设计的1对引物， 用于扩增Ml基因，其两端分别加上了 Sal I和Hind III的酶切位点位于PPH启动子下，这2 个引物序列（SEQ ID N0:13-14)分别是：
[0037] MISal I :5, -GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3'
[0038] MIHind III : 5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，
[0039] 根据融合基因 HA-24的序列（SEQ ID NO:3)设计的1对引物，用于扩增融合基因 HA-24,其两端分别加上了 Xho I和Sph I酶切位点，位于P10启动子下，引物序列（SEQ ID NO: 15-16)如下：
[0040] H Xhol I:5'-GG CTCGATATGGATAAGTATGTGCTCAG-3'
[0041] H Sph I:5,-ACAT GCATGCTTAAATACATATTCTGCACT-3'
[0042] 采用Ml和HA-24各自特异性引物，将反转录产物或合成的DNA片断直接用作PCR 扩增Ml和HA-24基因的模板。PCR反应条件为94°C预变性3min，94°C变性40S，56°C退火 908,721：延伸908，循环30次，最后延伸101^11，？〇?产物用1.5%琼脂糖凝胶（含0.5即/ mL溴化乙锭，EB)电泳检测。电泳结果如图1所示，PCR扩增的Ml基因的长度约0. 75Kb，融 合基因 HA-24的长度约为1. 7Kb。
[0043] 所有的PCR产物样品经电泳凝胶抽提后，获得纯化的Ml和HA-24基因 DNA片段， 经限制性内切酶3&11/把11(1111(消化組片段）、乂11〇1和5?111(消化撤-24片断）371： 分别消化后，再进一步纯化，以备构建重组质粒用。具体操作如下：制备1%琼脂糖凝胶含 0. 5ug/mL溴化乙锭，将所有PCR样品加入凝胶的样品槽内，设置电压100V，电泳时间40min 在长波紫外灯下，切下含有样品带的凝胶条，装入小塑料离心管中。参照胶回收试剂盒 (Qiagen公司产品）说明书，抽提纯化Ml和HA-24基因 DNA片段。经限制性内切酶37°C过 夜消化后，用胶回收试剂盒（Qiagen公司产品），按照说明书指导，离心过柱，纯化回收酶切 消化后的Ml和HA-24片段。
[0044] 2、构建表达Ml和HA-24基因的昆虫杆状病毒表达质粒及在昆虫细胞中合成重组 的昆虫杆状病毒
[0045] 2. 1构建表达Ml的重组质粒
[0046] 昆虫杆状病毒质粒PFastBac-dual (Invitrogen公司产品）经限制性内 切酶Sal I /Hind III 37°C酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的质粒 PFastBac-dual。在T4DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的M1DNA片段于16°C 连接过夜。反应体系如下：1〇ΧΤ4连接缓冲液lmL，Ml酶切回收的DNA片段3mL，酶切 PFastBac-dual质粒回收产物1 μ L，T4DNA连接酶1 μ L，ddH20补至10 μ L。采用热休克方 法将连接产物转导入ToplO感受态细胞中加入到于一小塑料离心管中，轻轻混合后将小管 置于冰上30min，转入42°C水浴中热休克90s，迅速放回冰上5分钟，向其中加入200 μ LLB 培养液。37°C摇床培养1小时。取100 μ L菌液涂布于LB固体培养基（含有氨苄和庆大霉 素两种抗生素）上，37°C培养16h，从平板上挑取阳性克隆菌落，进行菌液PCR，抽提质粒后 用5 &11/把11(1111进行单或双酶切鉴定。0嫩序列测定后，获得重组质粒？?&8丨8 &(3-(1皿這1。
[0047] 2. 2构建表达HA-24和Ml基因的重组质粒
[0048] 重组质粒PFastBac-dualMl经限制性内切酶Xho I /Nco I酶切后，在T4DNA连接 酶的作用下，将被同样的内切酶消化后的HA-24基因 DNA片段插入到P10启动子的下方，此 连接产物随后经热体克法转导入ToplO感受态细胞中，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重 组质粒DNA，菌液PCR和Xho I /Nco I酶切鉴定及DNA序列测序确定无误后，获得二度重组 的质粒。DNA测序后，S卩为所需的重组昆虫杆状病毒表达质粒PFastBac-dual-Ml-HA-24。
[0049] 2. 3重组昆虫杆状病毒基因组的合成及提取
[0050] 将纯化的重组PFastBac-dual-Ml-HA-24质粒转导入特殊的E. coli感受态细胞 株DHlOBac细胞中（美国Invitrogen公司产品）。DHlOBac细胞含有一特殊的大分子质粒 Bacmid，其内包含有昆虫杆状病毒AcMNPV的全部基因组。一旦重组的表达质粒整合入大 分子质粒Bacmid的特别位点后，经3种抗菌素（庆大霉素、四环素和卡那霉素）的筛选及 IPIG的诱导和X-Gal底物反应进行蓝白斑筛选，阳性克隆菌落呈白色，而非重组的野生菌 落呈兰色。实验条件均按照Invitrogen公司提供的实验手册指导而设定。挑选的阳性克 隆置于3mL的LB培养液中（含上述3种抗生素），经37°C摇床培养24小时，按照实验手册 标明的大分子质粒Bacmid小量制备法，提取纯化带有Ml基因和HA-24基因的重组大分子 质粒 Bacmid〇
[0051] 2. 4重组昆虫杆状病毒的制备
[0052] 将昆虫细胞株sf-9细胞（美国Invitrogen公司产品）培养于无血清的sf-900II 昆虫细胞培养液中（Invitrogen公司产品），温度设置为27°C，根据Invitrogen公司提 供的实验手册，细胞密度为5xl0 5个/mL，采用脂质体转染法，将纯化的重组大分子质粒 Bacmidl μ g与脂质溶液cellfectin (Invitrogen公司产品）6 μ L混合入200 μ L的无血清 无双抗的培养基中，转染sf-9细胞，27°C培养4至5天后，收集细胞培养上清液，3000r/m离 心10分钟收集上清液除去细胞碎片，获得低滴度的重组昆虫杆状病毒，再用此上清液感染 新培养的sf-9细胞（每毫升上清液感染4xl0 6个sf-9细胞）；3天后收集细胞培养上清液， 即为所需的放大培养后的高浓度重组昆虫杆状病毒，命名为Bac-Ml-HA-24。
[0053] 对获取的用于放大培养和蛋白表达的重组昆虫杆状病毒进行蚀斑实验，确定病毒 的噬斑形成单位（plaque forming units, PFU)，具体步骤为：
[0054] 1)用含10% FBS的Grace' s培养基将Sf-9细胞传代接种到六孔培养板中，细胞 密度为约IX 1〇6个cells/mL，每孔加2mL(6孔板），轻轻混匀室温使细胞贴壁1小时以上。
[0055] 2)将P3代种毒液用不含FBS的Grace' s培养基做10倍倍比稀释待用。
[0056] 3)弃去六孔板中的培养基，用不含血清的培养基清洗细胞3次，然后将上述稀释 好的重组病毒液加入孔中，每个稀释度做两个复孔，室温下感染1小时。
[0057] 4)制备覆盖液（以下为一块六孔板的量）：7mL2XGrace' s medium+140 μ 1的双 抗+7mL2%的高压灭菌agarose胶+1. 4mL FBS，轻轻地混匀，然后将瓶再放置42°C水浴，病 毒感染lh后吸尽每孔中的病毒液，并快速用上述制备的覆盖液覆盖细胞。
[0058] 5)待琼脂糖凝固后将六孔板用保鲜膜包好并置于27°C培养箱中培养3-5天。
[0059] 6)加入lmL浓度为lmg/mL的中性红，室温孵育2小时后吸去染液，观察到重组病 毒形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒空斑的形成情况（PFU)，病毒的滴度 约为 4. 5X109(PFU/mL)。
[0060] 3、Ml和HA-24基因在悬浮培养的昆虫细胞sf-9中的表达
[0061] 将200mL sf-9细胞混合液悬浮培养于1升体积的三角摇瓶中，细胞培养液为无血 清的 sf_900II(或 Invitrigen 公司的 Grace insect medium),摇床摇速为 100r/m，温度 恒定于27°C。当细胞浓度达到2X1细胞/mL时，用Bac-Ml-HA-24昆虫杆状病毒DNA转染 sf-9细胞，病毒的Μ0Ι = 1。转染的细胞经恒温摇动培养3天后，收集所有样品，4°C离心30 分钟，离心速度为3000r/m，收集细胞培养上清液。离心下来的细胞沉淀物用细胞裂解液处 理后，4°C离心10分钟，离心速度为10, 000r/m，保留离心后的细胞裂解抽提上清液。实验进 行的同时构建合成的野生型昆虫杆状病毒用于转染悬浮培养的sf-9细胞，MOI = 1，作为设 置的阴性对照，转染后的细胞培养、样品的收集及细胞裂解的条件与步骤与上述实验一样。
[0062] 收集的所有样品用于Western blots分析。其实验操作如下：
[0063] 1)每个样品（包括阴性对照）分别取10 μ L的细胞裂解抽提上清液，再各自加入 10 μ L的2ΧSDS上样缓冲液。100°C处理5min后，将所有20 μ L的混合样品加入4% -12% SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。设置恒定电压120V，温度为4°C，时间3小时，当蓝色指示 剂溴酚兰完全靠入凝胶底端时，停止电泳，取出凝胶。
[0064] 2)剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜（PVDF膜）及两张滤纸，PVDF膜用甲醇 浸泡5分钟后与凝胶、滤纸一起浸入预冷2小时以上的转移缓冲液中，按滤纸--凝胶-- 硝酸纤维素膜--滤纸的顺序安装入转印夹。将夹中靠近凝胶的一侧接负极，恒压25V转 移电泳lh.用镊子夹取出硝酸纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗涤，而后转移至5%的脱脂奶粉 /PBS溶液中，摇荡封闭1小时。
[0065] 3)用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次3分钟；然后将硝酸纤维素膜转入一塑料袋中， 加入3mL以1:500稀释于5%脱脂奶粉/PBS中抗H1N1流感病毒鸡源多克隆抗体（一抗）， 置于4°C平缓摇动过夜。翌日，取出纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次10分钟，将此 硝酸纤维素膜再装入另一新的塑料袋中，加入5mL以1:10000稀释于5%脱脂奶粉/PBS中 的辣根过氧化物酶标记的驴抗鸡IgG(二抗），室温下摇动温育lh。弃二抗，PBS-T漂洗纤 维素膜3次，每次10分钟，将漂洗后的硝酸纤维素膜移至一平皿中，加入DAB第五显色液。
[0066] 如图2所示，在相对应的分子量位置上有Ml (约25KDa)和HA-24 (约70KDa)的特 异性条带。说明Ml和HA-24在转染的悬浮培养的SF-9昆虫细胞中有效地表达了。
[0067] 4、病毒样颗粒的纯化
[0068] 将上述离心收集的细胞培养上清液装入13mL的超速离心管内，称重、平衡、封管 后，放入超速离心机（Bechmem公司产品）内，4°C 100, OOOrpm离心1小时，然后取出离心管， 小心倒掉上清液，保留离心管底的深沉物。加入5mL的PBS，放入4°C冰箱内，溶解24小时。 次日，在另一个13mL的超速离心管内，先小心地加入lmL 60%的庶糖溶液，然后依次加入 lmL 30%及3mL20%的庶糖溶液，最后将5mL的溶解后的样品液置于其上。精确称重、平衡 后，封管上超速离心机。4°C 100, OOOrpm离心1小时。取出离心管，收集位于30%与60% 浓度交界处的条带，即纯化的病毒样颗粒。
[0069] Western blots分析纯化浓缩后的病毒样颗粒样品。其操作步骤与上述步骤3中 Western blots分析一样，只是将所取的样品进行了稀释，S卩lyL的病毒样颗粒样品，加入 9 4 1^的水，再加入1(^1^的2父505上样缓冲液。1001：变性51^11后，上样入4%-12%聚丙 烯酰氨凝胶样品槽内。由图3Western blots结果显示，所获得的大分子颗粒，的确是由Ml 和HA-24构成的病毒样颗粒。说明转染后，病毒样颗粒在宿主细胞中有效地自我组装，并释 放入细胞培养上清液中。
[0070] 实施例2抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒
[0071] 将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白基因0RF24替换H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者构成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替换相当 长度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的长度与HA基因长度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的长度可做相应的调整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:5所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。SEQ ID N0:5的第1-906位碱基为0RF24的基因， 第907-1701位碱基为HA的基因 ；SEQ ID NO:6的第1-302位氨基酸为ORF24的氨基酸，第 303-566位碱基为HA的氨基酸。融合基因根据其核酸序列人工合成。其他实验步骤和实验 条件与实施例1相同。
[0072] 实施例3抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒
[0073] 将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白基因0RF24替换H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者构成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替换相当 长度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的长度与HA基因长度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的长度可做相应的调整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:7所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。SEQ ID N0:7的第1-876位碱基为0RF24的基因， 第877-1701位碱基为HA的基因 ；SEQ ID N0:8的第1-292位氨基酸为0RF24的氨基酸，第 293-566位碱基为HA的氨基酸。融合基因根据其核酸序列人工合成。其他实验步骤和实验 条件与实施例1相同。
[0074] 实施例4抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒
[0075] 将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白基因0RF24替换H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者构成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替换相当 长度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的长度与HA基因长度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的长度可做相应的调整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:9所 示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。SEQ ID N0:9的第1-846位碱基为0RF24的基因， 第847-1701位碱基为HA的基因 ；SEQ ID N0:10的第1-282位氨基酸为0RF24的氨基酸， 第283-566位碱基为HA的氨基酸。融合基因根据其核酸序列人工合成。其他实验步骤和 实验条件与实施例1相同。
[0076] 实施例5抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒
[0077] 将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白基因0RF24替换H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者构成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替换相当 长度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的长度与HA基因长度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的长度可做相应的调整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:11所 示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。SEQ ID NO: 11的第1-816位碱基为0RF24的基 因，第817-1701位碱基为HA的基因 ；SEQ ID NO: 12的第1-272位氨基酸为0RF24的氨基 酸，第273-566位碱基为HA的氨基酸。融合基因根据其核酸序列人工合成。其他实验步骤 和实验条件与实施例1相同。
[0078] 实施例6疫苗免疫试验
[0079] 将实施例1-5纯化的病毒样颗粒（VLPs)与佐剂（M0NTANIDE ISA 763A, seppic, France)等体积混合制成VLPs疫苗，4°C保存备用。
[0080] 280尾卵形鲳鰺（金鲳鱼）平均体重100g，饲养于水泥池中，随机分为7组。第 1?5组为试验组，分别免疫实施例1?实施例5制备的VLPs疫苗，每尾注射0. lmL (含抗原 50ug) VLPs疫苗；第6组注射PBS溶液与等量佐剂混合而成的阴性对照疫苗（不含抗原）； 第7组不注射疫苗。免疫方式为背部肌肉注射。免疫后28天尾静脉采血，每组5尾，常规 分离血清，以纯化的传染性脾肾坏死病毒为抗原，采用ELISA方法检测血清中抗体。
[0081] 结果表明，第6、7组抗体为阴性，第1?5组样品全部为阳性，平均ELISA滴度分 别为：第 1 组 2700±360,第 2 组 2693±425,第 3 组 2599±410,第 4 组 2812±393,第 5 组 2581±403，说明￥1^8疫苗能刺激产生高滴度抗体。免疫后30天，用111051'(：10 5(|15謂￥病毒 攻毒，观察3周。结果显示，第1组死亡8尾，存活32尾；第2组死亡8尾，存活32尾；第3 组死亡9尾，存活31尾；第4组死亡7尾，存活33尾；第5组死亡10尾，存活30尾；第6、 7组在14天内全部死亡，表明VLPs疫苗对卵形鲳鰺具有较好的保护作用，可以预防传染性 脾肾坏死病毒对卵形鲳鰺的感染。
[0082] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1. 一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由同时表 达的流感病毒基质蛋白Ml和融合蛋白HA-24构成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋 白与鱼类传染性脾肾坏死病毒0RF24构建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9 或 11 所示。
2. -种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： ① 将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白0RF24基因替换流感病毒HA基因的一部分，二 者构成融合基因 HA-24,融合基因 HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所示； ② 将流感病毒的基质蛋白Ml基因和融合蛋白HA-24基因插入昆虫杆状病毒 pFastBac-Dual载体上，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，并转化含有杆状病毒穿 梭载体的DHlOBac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid ; ③ 利用脂质体转染试剂，将含外源基因的重组杆状病毒穿梭载体rBacmid转染入宿主 昆虫细胞株sf-9中，获得重组昆虫杆状病毒； ④ 培养受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞，使其得以高效地表达流感病毒的 结构蛋白Ml和融合蛋白HA-24,并自动组装成同时表达流感病毒基质蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的病毒样颗粒。
3. 根据权利要求2所述的流感病毒和传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方法， 其特征在于，步骤①中的HA-24基因是由传染性脾肾坏死病毒0RF24与流感病毒HA基因先 合成融合基因，然后用PCR扩增而成。
4. 根据权利要求2所述的流感病毒和传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方 法，其特征在于，步骤③中sf-9细胞在27°C培养4-5天，收集细胞培养上清液，再侵染新的 sf-9细胞，获得放大后高滴度的重组昆虫杆状病毒。
5. 根据权利要求2所述的流感病毒和传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方法， 其特征在于，步骤④中受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞在27°C培养3天，表达的 流感病毒Ml蛋白和融合蛋白HA-24,自动组装成VLPs。
6. -种包含权利要求1-5任一项所述的病毒样颗粒的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因 工程疫苗。
【文档编号】A61K39/12GK104195119SQ201410381379
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月5日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】曹永长, 薛春宜, 刘大才 申请人:中山大学