组合物及其制备方法

组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了包含丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(E2)的组合物，其中所述HCV E2为基本上单体耗尽的HCV E2。本发明还提供了诱导HCV免疫应答的方法。
【专利说明】组合物及其制备方法
[0001] 本申请为2013年7月25日提交的名称为"组合物及其制备方法"的中国专利申 请No. 201180066040. 0的分案申请。本申请要求2010年11月26日提交的美国专利申请 No. 61/417, 317 的优先权。

【技术领域】
[0002] 本发明总体涉及丙型肝炎病毒（HCV)疫苗和诊断组合物。更具体而言，本发明提 供了含有HCV包膜糖蛋白2(E2)的组合物。所述组合物尤其适用于HCV感染的治疗、预防、 诊断和预后。

【背景技术】
[0003] 本说明书中所引用文献的详细情况列于本说明书的末尾。
[0004] 本发明中所参考的任何现有技术不是，且不应被视为承认或以任何形式暗示该现 有技术在任何一个国家构成一部分公知常识。
[0005] 根据世界卫生组织统计，丙型肝炎病毒（HCV)感染全球约1. 7-2. 0亿人。虽然政 府试图提高人们对HCV如何通过感染的针头和体液传播的认识，并已实施了预防方案，然 而HCV感染的发病率不断提高。约80% HCV感染者为该病毒的携带者。在澳大利亚，每年 报道的HCV感染新病例大约为16, 000个，新感染者在注射吸毒人群之间最为普遍。HCV是 最常见的血源性病毒感染，引起的死亡或发病率占相当大的人口比例。
[0006] 已知HCV感染肝脏和某些免疫细胞。其结果是，HCV导致严重的肝脏疾病，如肝纤 维化、肝硬化、脂肪变性和肝细胞癌（肝癌）的频率高于其他形式的肝炎。HCV是导致肝移 植接受者癌症的主要原因。通常认为由于该感染的亚临床特征，使得感染的急性期往往被 忽视，从而80 %的个体发展成为慢性疾病。慢性感染是由于免疫系统未能产生针对抗病毒 的清除性免疫应答。有6个主要的HCV基因型（1-6)和各种亚型（a、b、c等）。目前，还没 有HCV疫苗，并且唯一可用于HCV感染的治疗是抗病毒药物。抗病毒的药物设计背后的总 体思路是要找出关键的能被失活或抑制的病毒蛋白，或蛋白的一部分。中度或重度纤维化 患者的标准治疗选择包括α-干扰素和利巴韦林的联合给药。α-干扰素和利巴韦林联合 给药的抗病毒效果会导致血液中HCV水平的迅速下降，甚至是在施用单剂量之后。然而，常 规的α-干扰素治疗HCV存在几个缺点。例如，（i)当α-干扰素治疗在经过数周或数月 的治疗停止后，病毒载量迅速重新建立；（ii)用α-干扰素/利巴韦林治疗伴随有严重的 副作用，包括流感样症状，红细胞或白细胞计数下降，抑制骨髓细胞，神经精神效应，特别是 抑郁和贫血；（iii)由于α-干扰素在体内迅速吸收和排除，因此有效的治疗需要患者坚持 频繁的剂量给药方案；及（iv)这种治疗的成本高。治疗效果随基因型的不同而异，仅有大 约一半的基因型1或4的患者获得病毒清除。
[0007] 上述的一些缺点，特别是上述（iii)，可通过使α-干扰素发生"聚乙二醇化"，使 聚乙二醇分子连接到α-干扰素上而克服。聚乙二醇化的干扰素与利巴韦林联合给药延长 了 α-干扰素的半衰期，有利于减少剂量给药频率，从而提高患者的依从性。然而，已证明 这种治疗在不到50%接受治疗的患者中是有效的。鉴于慢性HCV患者的数量越来越多，有 必要开发一种用于预防和治疗目的的疫苗。
[0008] 病毒中和抗体的诱导是所有疫苗的重要组成部分。对于HCV而言，HCV糖蛋白 E2是该病毒中和抗体应答的主要靶标。已证明中和抗体对于感染HCV的动物模型和人 体内 HCV 的清除是重要的（Angus and Patel, 2011，Vanwolleghem et al·，2008, Law et al.，2008, Pestka et al.，2007)。由于HCV是一种高度易变的病毒，因此人们希望用以预 防HCV感染的疫苗产生能够识别各种HCV基因型和亚型的中和抗体。
[0009] HCV的主要细胞受体是CD81(Pileri et al·，1998)。CD81对于所有HCV毒株 进入肝细胞是必须的（Koutsoudakis et al·，2007, Zhang et al·，2004, McKeating et al.，2004, Bartosch et al.，2003, Pileri et al.，1998)。能阻止病毒颗粒与 CD81 发生 相互作用的抗体可以是中和抗体（Mancini et al.，2009, Law et al.，2008)。在疫苗研 究中，高滴度的E2-CD81抑制抗体与抗HCV保护有关（Youn et al.，2005) (Stamataki et al.，2008)。
[0010] 然而，尽管E2-CD81抑制抗体与黑猩猩体内更好的抗HCV保护作用有关，但它们 并不是中和作用的唯一潜在机制。在其他病毒系统中，中和作用可由作用于融合环的抗 体（Sultana et al.，2009, Stiasny et al.，2006)和共同受体相互作用来实现（Blish et al.，2008, Lusso et al.，2005)。此外，黄病毒颗粒表面上表位之间的交联被认为是中和作 用的主要形式（Kaufmann et al·，2010)。
[0011] HCV糖蛋白E2含有一个由第384-661位氨基酸残基所跨越的离散的受体结合域 (RBD)。所述RBD可从第661位残基延伸至E2的胞外结构域的C-末端边界。E2RBD的异源表 达导致保留了结合⑶81能力的可溶性蛋白的分泌。RBD内有三个可变区，称为高变区1、高 变区2(HVR2)和基因型间（intergenotypic)可变区（igVR)。这三个可变区残基位于糖蛋白 核心结构域的外侧，不直接参与E2的CD81结合位点的形成（McCaffrey et al.，2007) oRBD 中三个可变区的缺失导致可溶形式糖蛋白的表达，所述糖蛋白可被构象依赖性的抗体识别 并保留了野生型（WT)⑶81的结合水平。这种最小化形式的E2核心结构域称为Λ123Ε 2661。
[0012] 鉴于用于治疗或预防HCV感染的现有疗法和实验疗法的缺点，亟需提供能够在 HCV感染的治疗或预防中引起有效免疫应答的组合物，且该组合物能够形成诊断试剂以检 测HCV感染并用于监测抗HCV治疗。
[0013] 发明概述
[0014] 在本发明中，除非上下文另有所指，措辞"包含（comprise)"，或变化形式如"包含 (comprises) "或"包含（comprising) "，应理解为隐含包括所述成分或整体，或成分或整体 的组，但不排除任何其他成分或整体，或成分或整体的组。
[0015] 本文中使用的单数形式"一个/种"（a和an)和"该/所述（the)"包括复数，除 非上下文另有明确说明。因此,例如，"一种组合物（a composition)"包括单独的组合物， 以及两种或两种以上的组合物；"一种试剂（an agent)"包括一种试剂，以及两种或两种以 上的试剂；"该发明（the invention)"包括该发明的一个或多个方面等。
[0016] 本发明提供了一种包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2(E2)的组合物，其中所 述HCV糖蛋白E2(HCV E2)基本上耗尽了 HCV E2单体。本文中使用的短语"基本上耗尽了 E2单体"或"基本上单体耗尽的HCV E2"是指组合物包含不到30 %、29 %、28 %、27 %、26 %、 25%,24%,23%,22%,21 %,20%U9%U8%U7%U6%U5%U4%U3%U2%U1 %> 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或低于1%的E2单体（按重量计）。
[0017] 在一些实施方案中，单体形式的HCV E2的比例按重量计低于15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%或 0· 1%。
[0018] 基本上单体耗尽的HCV E2糖蛋白可来源于重组或合成的方法制备的糖蛋白。 [0019] 在一个具体实施方案中，组合物基本不含单体HCV E2,其含有低于1 %或低于 0. 1% 的单体 HCV E2。
[0020] 在一个相关的方面，基本上单体耗尽的HCV E2组合物富含三聚HCV E2,且该组 合物所包括的组合物制剂具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %, 94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量计）的三聚!10^2糖蛋白。
[0021] 在另一个方面，基本上单体耗尽的HCV E2组合物富含二聚HCV E2,且该组合物 所包括的组合物制剂具有大于 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99%(按重量计）的二聚HCVE2糖蛋白。
[0022] 在另一个方面，单体耗尽的组合物富含三聚HCV E2或HCV E2的更高级复合体， 且该组合物所包括的组合物制剂具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %, 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量计）的三聚或更高级形式的HCVE2糖蛋 白。
[0023] 在一些实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2三聚体。在一个相关的实施方案 中，E2糖蛋白基本上为HCV E2三聚体和更高级的形式。在另一个实施方案中，E2糖蛋白基 本上为更高级形式的HCV E2。
[0024] 基本上包含三聚HCV E2的组合物所包括的组合物制剂具有大于80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量计）的E2三聚体。
[0025] 基本上包含的三聚和更高级形式的HCV E2的组合物所包括的组合物制剂具有大 于 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99% (按重量计）的E2三聚体和更高级的形式。
[0026] 基本上包含更高级形式的HCV E2的组合物所包括的组合物制剂具有大于80%、 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%或99% (按重量计）的更高级形式的E2。
[0027] 在一些实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2二聚体。
[0028] 基本上包含二聚HCV E2的组合物所包括的组合物制剂具有大于80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量计）的E2二聚体。
[0029] 在一些实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2二聚体和E2三聚体。
[0030] 在一些实施方案中，本发明所描述的包含基本上单体耗尽的HCVE2的组合物用于 治疗和/或预防HCV感染。
[0031] 本发明还提供了用于在个体或患者体引起内免疫应答的方法，该方法包括向所述 个体或患者施用有效量的包含基本上单体耗尽的HCV E2的组合物。
[0032] 本发明还提供了用于免疫个体抗丙型肝炎病毒感染的方法，该方法包括向所述个 体施用包含基本上单体耗尽的HCV E2的组合物。
[0033] 本发明还提供了一种组合物，特别是一种用于免疫个体抗丙型肝炎病毒感染的包 含基本上单体耗尽的HCV E2的疫苗组合物。
[0034] 在一个相关的实施方案中，本发明还提供一种用于治疗个体的丙型肝炎病毒感染 的方法，该方法包括向所述个体施用包含基本上单体耗尽的HCV E2的组合物。
[0035] 根据这些实施方案，通常是在足以引起免疫应答的条件下，包括E2特异性抗体的 产生，施用该组合物一段时间。本发明的组合物可以是单剂量或应用（applications)给 药。或者，该组合物可包括重复剂量或应用，例如，该组合物可以给药2、3、4、5、6、7、8、9、10 次或更多次。
[0036] 在另一个实施方案中，本发明提供了 一种用于制备纯化的抗基本上单体耗尽的 HCV E2的抗体的方法，包括向个体注射免疫有效量基本上单体耗尽的HCV E2,并分离和纯 化产生的抗体。
[0037] 在另一个实施方案中，所述基本上单体耗尽的HCV E2组合物还包含药学上或生理 上可接受的载体或稀释剂。
[0038] 在另一个实施方案中，所述基本上单体耗尽的组合物还包含佐剂。在一个示例性 实施方案中，所述佐剂为基于皂苷的佐剂。在一个相关的方面，基于皂苷的佐剂还包括胆固 醇和留醇，其示例性实例是ISC0MATRIX?佐剂。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明提供抗基本上单体耗尽的HCV E2的纯化抗体，或与 基本上单体耗尽的HCV E2发生反应的纯化抗体。
[0040] 在一些实施方案中,所产生的抗体包括至少部分中和HCV生命周期的某个重要部 分如侵入宿主细胞或病毒出芽的那些抗体。
[0041] 本发明还涉及基本上单体耗尽的HCV E2在治疗或预防HCV感染中的或在制备用 于治疗或预防HCV感染的药物中的应用。
[0042] 本发明还涉及基本上单体耗尽的HCV E2在诊断或监测HCV感染或者监测抗HCV 治疗中，或在制备用于诊断或监测HCV感染或者监测抗HCV治疗的诊断试剂（如抗体）中 的应用。
[0043] 在其他方面，本发明还提供了筛选方法，其使用基本上单体耗尽的HCV E2鉴定结 合分子如抗体、抗原结合片段、配体、肽、有机或无机分子。
[0044] 在另一个方面，本发明提供了包含基本上单体耗尽的HCV E2糖蛋白的试剂盒或者 固体或半固体基底。考虑了本发明的试剂盒或基底用于诊断、预后、治疗或预防应用，以及 用于设计和/或筛选HCV E2结合分子或HCV受体结合分子。所述试剂盒和基底还用于监 测抗HCV感染的治疗方法的疗效。
[0045] 以上概述不是并且不应被视为本发明所有实施方案的详尽描述。
[0046] 附图及表格说明
[0047] 图1提供的图表显示出H77c WT和AHVRl+2+3E 2661_his的制备型尺寸排阻层析 (prepative size-exclusion chromatography)。浓缩的 WT和 AHVRl+2+3E2661_his 蛋白的 制备级TSKG3000SW尺寸排阻曲线分别位于图的上方和下方。样品在IXPBS中以2mL/min 的流速运行100分钟。在大量运行后，在60-160分钟之间收集2mL级分，并混合相应的级 分，供进一步分析。显示WT和AHVRl+2+3E 2661-his的解析的单体和二聚体峰。0. Syg/mL 纯化的牛血清白蛋白和卵清蛋白提供了所标记的尺寸标准。
[0048] 图2提供的图表显示了不同形式的H77c WT和AHVRl+2+3E2661_his分离的数据。 混合级分的分析型TSKG3000SW尺寸排阻曲线，表示制备型尺寸排阻层析曲线的单体和二 聚体峰以及独立的高级分子量形式（推定的三聚体）。所有样品以〇. 25mL/min在IXPBS 中整齐运行60分钟，解析出单体、二聚体和三聚体峰。0. 5μ g/mL牛血清白蛋白和卵清蛋白 提供了所标记的尺寸标准。
[0049] 图3提供的图表显示了不同形式的ConlWT和AHVRl+2+3E 2661_his分离的数 据。混合级分的分析型TSKG3000SW尺寸排阻曲线，表示制备型尺寸排阻层析曲线的单 体和二聚体峰以及独立的高级分子量形式（推定的三聚体）。A.WT E2661-his寡聚体和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his寡聚体。所有样品以0. 25mL/min在I XPBS中整齐运行60分钟，解 析出单体、二聚体和三聚体峰。
[0050] 图4提供的图表显示了不同形式的JFHlWT和ΛHVRl+2+3E 2661_his分离的数 据。混合级分的分析型TSKG3000SW尺寸排阻曲线，表示制备型尺寸排阻层析曲线的单 体和二聚体峰以及独立的高级分子量形式（推定的三聚体）。A.WT E2661-his寡聚体和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his寡聚体。所有样品以0. 25mL/min在I XPBS中整齐运行60分钟，解 析出单体、二聚体和三聚体峰。
[0051] 图5为缺失单个或多个可变区序列的纯化E2661蛋白的表达曲线。显示出利用 TSKG3000SWXL柱和HPLC系统进行的来自H77c基因型Ia的各E2661-his可变区缺失突变体 的分析型尺寸排阻曲线。不同形式的纯化的牛血清白蛋白（BSA)和卵清蛋白提供了所示的 尺寸标准标记。
[0052] 图6显示出不同形式的H77c WT和AHVRl+2+3E 2661-his的表征。在非还原和还 原（+β -巯基乙醇）条件下，对于 A. WT E2661-his 级分 13-31 和 B. AHVRl+2+3E2661-his 级 分15-33,使用25-200kDa之间的尺寸标准物，对来自制备型尺寸排阻层析的混合级分进行 定量SDS-PAGE分析。根据分析型尺寸排阻层析曲线，星号（*)所示的级分代表单体和二聚 体峰以及一个独立的高分子量种类（推定的三聚体）。图下面的表格显示了根据SDS-PAGE 分析所估算的单体、二聚体和三聚体的计算分子量。
[0053] 图7显示出不同形式的ConlWT和AHVRl+2+3E2661_his的表征。在非还原和还原 (+ β -巯基乙醇）的条件下，对于 A. WT E2661-his 级分 13-31 和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his 级 分16-34,使用25-200kDa之间的尺寸标准物，对制备型尺寸排阻层析的混合级分进行定量 SDS-PAGE分析。根据分析型尺寸排阻层析曲线，星号（*)所示的级分代表单体和二聚体峰 以及一个独立的高分子量形式（推定的三聚体）。在各SDS-PAGE结果下绘制成表格的是 级分的计算分子量，所述级分对应于还原和非还原SDS-PAGE中的单体、二聚体和高分子量 (HMr)种类（推定的三聚体）。
[0054] 图8显示出不同寡聚形式的JFHlWT和AHVRl+2+3E2661_his的表征。在非还原和 还原（+ β -巯基乙醇）条件下，对于 A. WT E2661-his 级分 15-32 和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his 级分18-36,使用25-200kDa之间的尺寸标准物，对制备型尺寸排阻层析的混合级分进行定 量SDS-PAGE分析。根据分析型尺寸排阻层析曲线，星号（*)所示的级分代表单体和二聚体 峰以及一个独立的高分子量形式（推定的三聚体）。在各SDS-PAGE结果下绘制成表格的是 级分的计算分子量，所述级分对应于还原和非还原SDS-PAGE中的单体、二聚体和高分子量 (HMr)种类（推定的三聚体）。
[0055] 图9提供的图表显示出来自H77c分离株（isolate)的不同形式的WT和 AHVRl+2+3E 2661-his的生物传感器曲线。从0. lyg/mL开始进行连续两倍稀释的不同蛋白 的生物传感器曲线。上方图为WT E2661-his级分，下方图为AHVRl+2+3E2661-his级分，分别 表示通过分析型尺寸排阻层析测定的三聚体、二聚体和单体峰。垂直条带表示注射"起始" 和"结束"的位置。图中显示了用于1:1化学计算的R max值，而用于2:1结合化学计算的Rmax 值不于括号内。
[0056] 图10提供的图表显示了 H77c(基因型la)、Conl (基因型Ib)和JFHl (基因型 2a)WT和AHVRl+2+3E 2661-his三聚体、二聚体和单体蛋白结合CDSIMBP-LEL113-201的胞外 大环的比较亲和性。对于二聚体和三聚体蛋白采用" I: ILangmuir"结合模型，对于单体 蛋白采用"两阶段（two-state)"（构象变化）模型，得到以摩尔（M)为单位的平均KD值。 除了 Conl和JFHl之外，显示了三个独立实验的平均值和标准误差，其中η = 1。WT和 AHVRl+2+3E 2661-his蛋白各自KD值的显著差异（ρ〈0. 05)，用星号（*)表示。
[0057] 图11提供的图表数据显示豚鼠免疫血清的滴度曲线，其是针对30μ g或100μ g 剂量的抗同源 H77cA123E2661-his 抗原的单体[A(gpl-1 至 gpl-4)和 B(gp 2-1 至 2-4)]、 二聚体[C (gp 3-1 至 3-4)和 D (gp4-l 至 4-4)]或混合的[E (gp5-l 至 5-4)和 F (gp6-l 至 6-4) ]E2-his组合物产生的。由佐剂ISC0MATRIX?单独（无抗原）诱发的豚鼠血清的反应 性示于各图中的gp 7-1至7-4。
[0058] 图12提供的图表为抗同源免疫H77cA123E2661-his抗原的豚鼠血清的抗体平均 滴度。100 μ g混合组中的抗体平均滴度比30 μ g混合组高约0. 51og，比二聚体组高Ilog, 比单体组高21og。
[0059] 图13以图形表示来自直接结合酶免疫测定的数据，其显示出免疫血清对WT和 E2661-his的Λ 123形式的混合物的反应性。抗体滴度是剂量依赖性的，看起来100 μ g优于 30 μ g。与用单体蛋白免疫的动物相比，接受混合和二聚体形式的E2661的动物引发更高的 抗体平均滴度。
[0060] 图14提供的图表中的数据表示在固相酶试验中，免疫血清抑制H77c(基因型la) 和JFHl (基因型2a)WT E2661-his蛋白与重组形式的CD81 (MBP-LEL113-201)的胞外大环的结 合能力。单体E2661-his免疫的动物引发的E2-CD81抑制抗体的平均滴度最低。用二聚体 形式免疫的动物引发的H77c E2-CD81抑制抗体的平均滴度高于单体形式。从用含三聚体 混合物免疫的动物获得的免疫血清引发的H77c E2-CD81抑制抗体的平均滴度最高。此外， 即使在较低的30 μ g疫苗剂量下，在所有动物中均观察到应答，这表明含有E2661-his三聚 体的制剂优于单独的二聚E2 661-his。只有从接受30 μ g或100 μ g E2661-his的二聚体或混 合物的动物中获得的血清实现了对JFH1E2-⑶81与100 μ g混合物组中获得80%抑制的所 有动物相互作用的80 %抑制。
[0061] 图15提供的图表中的数据表示豚鼠血清介导H77c HCVpp的同源中和作用的能 力。介导HCVpp中和作用的能力也为剂量和抗原依赖性的；见单体（A和B)、二聚体（C和D) 和混合型（E和F)。接受30 μ g单体的个体显示出较差的中和HCVpp的能力，其曲线与对照 无抗原组（G)相似。使用直接针对E2的中和单克隆抗体的阳性对照也示于G中（mab24)。
[0062] 图16提供的图表表示豚鼠血清对H77c HCVpp的50%中和平均滴度。接受100μ g 混合抗原的个体引发的中和平均滴度比那些观察到的接受100 μ g单体、30 μ g二聚体或 100 μ g二聚体的个体更高约10倍。显示了 25%和75% (盒）、平均值（线）和平均值的 标准误差。
[0063] 图17提供的图表表示免疫血清介导J6-JFHlHCVcc对单体（A和B)、二聚体（C和 D)、混合制剂（E和F)的交叉中和作用的能力。还运行了无抗原对照和针对E2的中和单克 隆抗体（G和H)。接受100 μ g混合抗原的个体显示出很强的介导交叉中和作用的能力，在 1/40血清稀释下，实现90%的进入抑制。
[0064] 图18提供的图表表示抗J6-JFHlHCVcc的疫苗组的50%中和平均滴度。观察到对 100 μ g混合组的平均50%中和滴度比30 μ g和100 μ g单体组高出近21og，比二聚体组和 30 μ g混合组高I log。
[0065] 图19提供了 E2661_his蛋白的代表性凝胶过滤层析谱。在在Superdex 200pg 26/60制备型凝胶过滤柱上运行蛋白，收集到如图所示的峰1-4。分子量标准物的洗脱时间 示于层析谱的上方。
[0066] 图20提供了典型的Δ 123E 2661_his蛋白的凝胶过滤层析谱。在在Superdex 200pg 26/60制备型凝胶过滤柱上运行蛋白，收集到如图所示的峰1-4。分子量标准物的洗脱时间 示于层析谱的上方。
[0067] 图21提供了表示WT E2661_his峰1-4的混合级分的凝胶过滤分析曲线。在 Superdex 200PC 3. 2/30柱中运行的各凝胶过滤为叠合状态，以显示出它们的相对洗脱。显 示了分子大小标记物（size marker)。
[0068] 图22提供了表示A123E2661_his峰1-4的混合级分的凝胶过滤分析曲线。在 Superdex 200PC 3. 2/30柱中运行的各凝胶过滤为叠合状态，以显示出它们的相对洗脱。显 示了分子大小标记物。
[0069] 图23提供了峰1-4的还原SDS-PAGE。将3μ g各E2661-his蛋白加入到10μ 1 4Χ还原样品缓冲液中。将样品在70°C加热3分钟，并加载至4-12% Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE凝胶中。向凝胶罐（tank)的中央部位加入500 μ 1抗氧化剂NuPAGE，然后在200V 下运行。BioRad Precision Plus标准物的迁移示于左侧。
[0070] 图24提供了峰1-4的非还原SDS-PAGE。将3 μ g各E2661-his蛋白加入到10 μ 1 4Χ非还原样品缓冲液中。将样品在70°C加热3分钟，并加载至4-12%Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE凝胶中。BioRad Precision Plus标准物的迁移示于左侧。
[0071] 图25提供了峰1-4的蛋白质印迹分析结果。将0. 5μ g峰1-4的E2661-his加入 到4X还原样品缓冲液中。还原SDS-PAGE分析按照图23中的描述进行。然后通过湿转移 (1小时）将E2 661-his变体转移到PVDF膜上。将膜用含2%脱脂乳的PBS封闭过夜。加入 用含1 %脱脂乳的0.05 % TBS按1:1000稀释的一级抗Penta-His抗体。洗涤3次后，加入 用含1 %脱脂乳的〇. 05% TBS进行1:2000稀释的绵羊抗小鼠 IgG HRP (MiIlipore公司）。 洗涤3次后，根据制造商的说明，采用ECL Plus免疫印迹检测试剂使印迹显影并在520nm 处扫描。BioRad Precision Plus标准物的迁移示于左侧。
[0072] 图26提供了峰1-4的蛋白质印迹分析结果。将0. 5 μ g峰1-4的E2661_his加入到 4X还原样品缓冲液中。还原SDS-PAGE分析按照图23中的描述进行。然后通过湿转移（1 小时）将E2 661-his变体转移到PVDF膜上。将膜用含2%脱脂乳的PBS封闭过夜。加入用 含1 %脱脂乳的0.05% TBS按1:1000稀释的一级抗HCV E2抗体。洗涤3次后，加入用含 1%脱脂乳的〇. 05% TBS按1:2000稀释的绵羊抗小鼠 IgG HRP(Millipore公司）。洗涤3 次后，根据制造商的说明，采用ECL Plus免疫印迹检测试剂使印迹显影并在520nm处扫描。 BioRad Precision Plus标准物的迁移示于左侧。
[0073] 图27提供的图表表示从用峰1-4WT E2661_his中的一种或未分级的混合物免疫的 豚鼠获得的免疫血清对同源免疫抗原的反应性。用GNA凝集素（0.5 μ g/ml)包被微量滴定 板，然后用2 μ g/ml的峰1-4中的一种或未分级的混合物进行包被。空白位置用BSA封闭， 然后加入经连续稀释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检测结合 的免疫球蛋白，并用TMB底物进行显色。
[0074] 图28提供的图表表示从用峰1-4Λ 123E2661_his蛋白中的一种或未分级的混合物 免疫豚鼠的获得的免疫血清对同源免疫抗原的反应性。用GNA凝集素（0.5 μ g/ml)包被微 量滴定板，然后用2 μ g/ml的峰1-4中的一种或未分级的混合物进行包被。空白位置用BSA 封闭，然后加入经连续稀释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检 测结合的免疫球蛋白，并用TMB底物进行显色。
[0075] 图29提供的图表表示从用峰1-4Λ 123E2661_his蛋白中的一种或未分级的混合物 免疫的豚鼠获得的免疫血清对未分级的基因型la H77c WT和A123E 2661-his抗原的反应 性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板，然后用2 μ g/ml未分级的H77c WT㈧或 Λ 123 (B)E2661-his抗原进行包被。空白位置用BSA封闭，然后加入经连续稀释的免疫血清。 用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检测结合的免疫球蛋白，并用TMB底物进行 显色。
[0076] 图30提供的图表表示从用峰1-4WT E2661_his蛋白中的一种或未分级的混合物免 疫的豚鼠获得的免疫血清抑制同源（H77c，A)和异源（JFH1，B)E2 661之间与⑶81结合的能 力。向IOOng未分级的H77c或JFH1E2661蛋白中加入连续稀释的免疫血清，然后添加于包被 有MBP-LEL 113^1的酶免疫分析板。用抗His抗体检测结合的E2661-his，然后用偶联有辣根过 氧化物酶的抗兔免疫球蛋白及TMB底物检测。计算每只动物用于抑制E2 661和MBP-LEL113 之间50%结合所需的抗体稀释度。
[0077] 图31提供的图表表示从用峰1-4Λ 123E2661_his蛋白中的一种或未分级的混合物 免疫的豚鼠获得的免疫血清抑制同源（H77c，A)和异源（JFH1，B)E2 661之间与⑶81结合的能 力。向IOOng未分级的H77c或JFH1E2661蛋白中加入连续稀释的免疫血清，然后添加于包被 有MBP-LEL 113^1的酶免疫分析板。用抗His抗体检测结合的E2661-his，然后用偶联有辣根过 氧化物酶的抗兔免疫球蛋白及TMB底物检测。计算每只动物用于抑制E2 661和MBP-LEL113 之间50%结合所需的抗体稀释度。
[0078] 图32提供的图表表示Λ 123E 2661_his豚鼠血清防止肝细胞培养物感染同源HCV 的能力。检测用峰1-4Λ 123E 2661-his蛋白中的一种或未分级的混合物免疫的豚鼠所引发 的免疫血清中和含有同源H77c E1E2糖蛋白（H77c HCVpp)的假型逆转录病毒颗粒的能力。 将热灭活的免疫血清用DMFlO进行连续稀释，并与等体积的H77c HCVpp在37°C下孵育1小 时，然后加入到前一天以3X IO4细胞/孔接种的Huh 7. 5细胞中。4小时后，去掉病毒血清 混合物，并用培养基更换。3天后，用光度计测定细胞裂解液中荧光素酶活性。IC50滴度计 算为抑制50 %病毒感染所需的免疫血清稀释度（A)，而IC80滴度为抑制80 %病毒感染所需 的免疫血清稀释度（B)。
[0079] 图33提供的图表表示Λ 123E 2661_his豚鼠血清防止肝细胞培养物感染异源HCV毒 株的能力。检测用峰l-4A123E2 661-his蛋白中的一种或未分级的混合物免疫的豚鼠所引发 的免疫血清中和J6/JFH1嵌合细胞培养物（HCVcc)基因型2a的能力。将热灭活的免疫血 清用DMF10+NEAA进行连续稀释，并与等体积的3. 16TCID5(l/ml HCVcc于37°C混合20分钟。 将血清/病毒混合物施加到前一天以8X IO3细胞/孔接种的Huh 7. 5细胞中，并于37°C孵 育5小时。去掉血清/病毒混合物，并用PBS洗涤4次，然后加入DMF10+NEAA并孵育44小 时。使用海肾荧光素酶底物和光度计测定组织培养液中的荧光素酶活性。IC50滴度计算为 抑制50%病毒复制所需的免疫血清稀释度（A)，而IC80滴度为抑制80%病毒复制所需的免 疫血清稀释度（B)。
[0080] 图34提供的图表表示在酶免疫测定中WT E2661-his免疫血清对未分级的H77c WT 和Λ 123E 2661抗原的反应性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板，然后用2 μ g/ml 未分级的H77c WT(A)或Λ123(Β)Ε2661抗原进行包被。空白位置用BSA封闭，然后加入经 连续稀释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检测结合的免疫球蛋 白，用TMB底物进行显色。
[0081] 图35提供的图表表示在酶免疫测定中从用峰1-4H77C WTE2661-his蛋白中的一种 或未分级的E2661-his混合物免疫的豚鼠获得的免疫血清对异源JFHlWT和Λ 123E 2661-his 抗原的反应性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板，然后用2 μ g/ml未分级的 JFHlWT(A)或Λ 123⑶E2661-his抗原进行包被。空白位置用BSA封闭，然后加入经连续稀 释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检测结合的免疫球蛋白，用 TMB底物进行显色。
[0082] 图36提供的图表表示野生型E2661_his豚鼠血清防止肝细胞培养物感染同源HCV 的能力。检测由用峰1-4WT E2661-his蛋白中的一种或未分级的混合物免疫的豚鼠引发的免 疫血清中和含有同源H77c E1E2糖蛋白（H77c HCVpp)的假型逆转录病毒颗粒的能力。将 热灭活的免疫血清在DMFlO中进行连续稀释，并与等体积的H77c HCVpp在37°C下孵育1小 时，然后加入到前一天以3X104个细胞/孔接种的Huh 7.5细胞中。4小时后，去掉病毒血 清混合液，并用培养基更换。3天后，用光度计测定细胞裂解液中荧光素酶的活性。IC50滴 度计算为抑制50 %病毒感染所需的免疫血清稀释度（A)，而IC80滴度则为抑制80 %病毒感 染所需的免疫血清稀释度（B)。
[0083] 图37提供的图表表示WT E2661_his免疫血清防止肝细胞培养物感染异源HCV毒 株的能力。检测由用峰1-4WT E2661-his蛋白中的一种或未分级的混合物免疫的豚鼠引发 的免疫血清中和J6/JFH1嵌合细胞培养物（HCVcc)基因型2a病毒的能力。将热灭活的免 疫血清在DMF10+NEAA中进行连续稀释，并与等体积的3. 16TCID5(l/ml HCVcc于37°C混合20 分钟。将血清/病毒混合物加入到前一天以8X IO3个细胞/孔接种的Huh 7. 5细胞中，于 37°C孵育5小时。移出血清/病毒混合液，并用PBS洗涤4次，然后加入DMF10+NEAA并孵 育40小时。使用海肾荧光素酶底物和光度计测定组织培养液中荧光素酶的活性。IC50滴 度计算为抑制50%病毒复制所需的免疫血清稀释度（A)，而IC80滴度则为抑制80%病毒复 制所需的免疫血清稀释度（B)。
[0084] 图38提供的图表表示在酶免疫测定中，WT E2661_his免疫血清对异源Conl (基因 型Ib)野生型和Λ 123E 2661-his抗原的反应性。用GNA凝集素（0. 5μ g/ml)包被微量滴定 板，然后用2 μ g/ml未分级的ConlWT(A)或Λ 123 (B) E2661-his混合物进行包被。空白位置 用BSA封闭，然后加入连续稀释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋 白检测结合的免疫球蛋白，用TMB底物进行显色。
[0085] 图39提供的图表表示在酶免疫测定中，Λ 123E 2661_his免疫血清对异源Conl (基 因型lb)WT和Λ 123E2661-his抗原的反应性。用GNA凝集素（0. 5μ g/ml)包被微量滴定板， 然后用2μ g/ml未分级的ConlWT(A)或Λ 123⑶E2661-his混合物进行包被。空白位置用 BSA封闭，然后加入连续稀释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检 测结合的免疫球蛋白，用TMB底物进行显色。
[0086] 图40提供的图表表示在酶免疫测定中，Λ 123E 2661_his免疫血清对异源JFHl (基 因型2a) WT和Λ 123E2661-his抗原的反应性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板， 然后用2μ g/ml未分级的JFHlWT(A)或Λ 123⑶E2661-his混合物进行包被。空白位置用 BSA封闭，然后加入连续稀释的免疫血清。用偶联有辣根过氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白检 测结合的免疫球蛋白，用TMB底物进行显色。
[0087] 表1列出了豚鼠疫苗受试组（1至7)和抗原类型、抗原量、佐剂及各组中以与实施 例3所述相同方式接受免疫的个体数量。

【具体实施方式】
[0088] 本发明不限定特定的试剂筛选方法，因此试剂的具体配方和各种医疗方法，因为 它们可以变化。
[0089] 除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的 普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。任何与本发明中所述的那些相类似或 相同的材料和方法，都可用于实施或验证本发明。对于本领域的定义和术语以及本 领域技术人员已知的其他方法，特别是从业人员可参考Sambrook et al. ,1989(同 上),Coligan et al. , Current Protocols In Protein Science, John Wiley & Sons, Inc. , 1995-1997,特别是第 1、5 和 6 章，和 Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 47,John Wi ley & Sons,New York, 1999 ； Colowick and Kaplan,eds. , Methods In Enzymologyj Academic Press,Inc. ；Weir and Blackwell,eds. , Handbook of Experimental Immunology，Vols. I-IV，Blackwell Scientific Publications，1986 ;Joklik ed. , Virology, 3rd Edition, 1988 ；Fields and Knipe，eds，Fundamental Virology, 2nd Edition,1991 ；Fields et al. , eds, Virology, 3rd Edition，Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa, 1996。
[0090] 本发明提供了一种包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2(E2)的组合物，其中基 本上耗尽了所述HCV E2糖蛋白的HCV E2单体。本发明中使用的短语"基本上耗尽E2单 体"或"基本上单体耗尽的HCVE2"是指组合物包含低于30%、29%、28%、27%、26%、25%、 24%,23%,22%,21 %,20%U9%U8%U7%U6%U5%U4%U3%U2%U1 %>!0%> 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或低于1%的E2单体（按重量计）。
[0091] 术语"HCV E2糖蛋白"、"E2糖蛋白"、"E2二聚体"、"E2三聚体"或"E2"、"E2单体"、 "HCV E2"等，包括来自HCV任何基因型或分离株（isolate)的E2糖蛋白。该术语还包括非 天然存在的变体，包括全长E2糖蛋白的某些部分，包括例如介导受体结合或介导一个或多 个识别构象和/或其他表位的抗体的中和抗体结合的部分，或调解E1E2二聚体形成的那些 部分。
[0092] 在一些实施方案中，单体形式的HCV E2比例按重量计低于15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%或 0· 1%。
[0093] 基本上单体耗尽的HCV E2糖蛋白可以是通过重组或合成方法制备的糖蛋白。
[0094] 在一个具体实施方案中，组合物基本不含单体HCV E2,其含有低于1 %或低于 0. 1% 的单体 HCV E2。
[0095] 在另一个方面，基本上单体耗尽的HCV E2组合物富含HCV E2的三聚和更高级的 形式，且该组合物所包括的组合物制剂具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量计）的三聚和高级形式的HCVE2 糖蛋白。
[0096] 本发明中使用的短语HCV E2糖蛋白的"高级形式"是指E2蛋白具有4个或4个 以上的E2蛋白亚单位的形式。已知这种形式为四聚体（4)、五聚体（5)、六聚体￠)、七聚体 (7)、八聚体（8)、九聚体（9)、十聚体（10)聚体（11)、十二聚体（12)、十三聚体（13)、 十四聚体（14)、十五聚体（15)、十六聚体（16)、十七聚体（17)、十八聚体（18)、十九聚体 (19)、二十聚体（20)、21_聚体（mer)、22-聚体、23-聚体等。
[0097] 在一个相关的方面，基本上单体耗尽的HCV E2组合物富含三聚HCV E2,且该组 合物所包括的组合物制剂具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %, 94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量计）的三聚!10^2糖蛋白。
[0098] 在另一个方面，基本上单体耗尽的HCV E2组合物富含二聚HCVE2,且该组合物所 包括的组合物制剂具有大于 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99%(按重量计）的二聚HCVE2糖蛋白。
[0099] 在另一个方面，所述组合物基本上包含HCV E2三聚体。在另一个方面，所述组合 物基本上包含HCV E2三聚体和更高级的形式。在另一个方面，所述组合物基本上包含HCV E2的更高级形式。
[0100] 基本上包含三聚HCV E2的组合物所包括的组合物制剂具有大于80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量计）的E2三聚体。
[0101] 基本上包含HCV E2的三聚体和更高级形式的组合物所包括的组合物制剂具有大 于 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99% (按重量计）的E2三聚体和更高级形式。
[0102] 基本上包含HCV E2的更高级形式的组合物所包括的组合物制剂具有大于80%、 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%或99% (按重量计）的E2的更高级形式。
[0103] 测定制剂中各E2单体、二聚体和三聚体及高级形式的重量百分比或比例的方法 如所描述的或为本领域技术人员所已知的。
[0104] 在一个实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2三聚体或更高级的形式。
[0105] 包含HCV E2三聚体或更高级形式的组合物所包括的组合物制剂具有大于约 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99% (按重量计）的E2三聚体和更高级的形式。
[0106] 在一些实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2三聚体。
[0107] 基本上包含HCV E2三聚体的组合物所包括的组合物制剂具有大于约80%、81 %、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量计）的E2三聚体。
[0108] 在一些实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2二聚体。
[0109] 基本上包含HCV E2二聚体的组合物所包括的组合物制剂具有大于约80%、81 %、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量计）的E2二聚体。
[0110] 在一些实施方案中，E2糖蛋白基本上为HCV E2二聚体和E2三聚体。包含基本上 HCV E2二聚体和三聚体形式组合物所包括的制剂具有大于70%、75%、80%、85%、90%、 95%、97%或99% (按重量计）的E2二聚体和三聚体，和/或所包括的制剂具有低于30%、 29%,28%,27%,26%,25%,24%,23%,22%,21 %,20%U9%U8%U7%U6%U5%, 14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或低于1%的E2单 体（按重量计）。
[0111] 在一些实施方案中，本发明的组合物可通过消耗HCV E2糖蛋白混合物中的单体或 通过富集二聚和/或三聚E2和/或更高级的形式而获得。在一些实施方案中，消耗单体和 /或富集二聚体和/或三聚体E2和/或更高级形式。
[0112] 在另一个实施方案中，基本上单体耗尽的HCV E2组合物还包含药学上或生理上可 接受的载体或稀释剂。
[0113] 在另一个实施方案中，所述基本上单体耗尽的组合物还包含佐剂。如果作为与一 种或多种佐剂的混合物给药，可增强个体对免疫原的应答。免疫佐剂通常以下述方式中的 一种或多种发挥作用：（1)免疫调节（2)增强呈递（3)产生CTL(4)靶向；和/或（5)产生 C：库（depot generation)。示例性佐剂包括：粒状或非粒状佐剂、完全弗氏佐剂（CFA)、 铝盐、乳剂、ISCOMS、LPS衍生物如MPL以及其衍生物如3D，来自于分枝杆菌的蛋白如胞 壁酰二肽或三肽，特别是来自皂树（Quillaja saponaria)的皂苷，如QS21和ISC0PREP? 皂苷，ISC0MATRIX?佐剂，以及肽如胸腺素 α?。有关佐剂的详细说明可参见Cox and Coulter，''Advances in Adjuvant Technology and Application"，in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology，Chapter 4, Ed. Young, W. K. , CRC Press 1992, and in Cox and CoulterjVaccine 15 (3):248-256,1997〇
[0114] 可按照常规药物配置技术来方便地制备药物组合物。参见例如， Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学），18th Ed.，Mack Publishing, Company, Easton, PA, U. S. A.，1990。除了一种活性物质之外，这些组合物还可 包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域中公知的其他材料。这样的材 料应该是无毒的，且不应该干扰活性成分的功效。所述载体可以采用各种各样的形式，这取 决于给药如静脉内、口服或非肠道给药所需的制剂形式。
[0115] HCV E2糖蛋白的一个示例性形式是包含基因型H771a(E2661)的第384-661位氨 基酸的E2糖蛋白的受体结合部分或来自其他另一 HCV基因型的相应部分。
[0116] 在一些实施方案中，HCV E2糖蛋白所包含的氨基酸序列或结构基本上与天然存在 的HCV变体相似。例如，E2蛋白可基本上与本领域中已知的一种或多种分离株，如JFH-1、 C0Nl、H77c或ED43分离株的氨基酸序列相似，或它们可基本上与由基因型1-6中的一种或 其片段所表达的E2糖蛋白中的一种或多种相似。
[0117] 在其他实施方案中，HCV E2糖蛋白是天然存在的HCV E2糖蛋白的变体，其结合宿 主细胞受体和/或包含通过中和表位或构象表位而识别的一个或多个表位。变体的一种形 式为天然存在的毒株（strain)或其非培养变体的截短形式或片段。示例性片段包括受体 结合结构域。其他修饰的HCV E2糖蛋白包括它们的突变体、类似物或衍生物。
[0118] 可选地或另外，在一些实施方案中，HCV E2糖蛋白在一个或多个可变区中包含突 变，如缺失突变。示例性突变公开于国际公开W02008/022401，其通过引用全文并入于此。 如本发明中所确定的，包含或缺少三个可变区的E2糖蛋白能够形成功能性受体结合二聚 体和/或三聚体，并抑制病毒进入受纳的宿主细胞。
[0119] 在一个实施方案中，E2蛋白为E2661 A123(AHVR123,在本发明中又称Λ123、 D123、AHVRl+2+3、D123E2661-his、D123E 2661、Λ 123E 2661 和 Λ 123E2661-his)。在一些实施方 案中，Ε2661 Λ123Ε2包含HCV H77c的第384-661位氨基酸，其中可变区1和2及igVR(3) 被短连接体基序（ΛHVR123)替代。本发明的其他实施方案所包括的HCV E2蛋白具有缺失 或被短连接体取代的HVRUHVR2或igVR的任何组合。可将它们简称为Λ 1、Λ 1，2 ( Λ 12)、 Λ 2、Λ 2, 3 ( Λ 23)、Λ 3 和 Λ 1，3 ( Λ 13)。
[0120] 本发明还提供了用于在个体或患者体内引起免疫应答的方法，该方法包括向所述 个体或患者施用有效量的包含基本上单体耗尽的HCV Ε2的组合物。本发明还考虑了一种 组合物，特别是一种用于免疫个体抗丙型肝炎病毒感染的包含基本上单体耗尽的HCV Ε2的 疫苗组合物。
[0121] 本发明中使用的术语"疫苗"是指包含至少一种可在个体内诱导免疫应答的免疫 活性成分以及可能但非必需的一种或多种增强所述活性成分免疫活性的附加组分（例如 佐剂）的药物组合物。疫苗还可包含对药物组合物而言典型的其他成分。疫苗的免疫活性 成分包含基本上单体耗尽的HCV Ε2组合物。在本发明中，术语"疫苗"和"疫苗组合物"可 以互换使用。
[0122] 本发明中述及的"个体"是指人或动物，包括实验室或本领域接受的试验或载体动 物（vehicle aminal)。"患者"包括需要接受治疗或预防的人类个体。
[0123] 在一些实施方案中，提供了用于免疫个体抗HCV感染的组合物，特别是疫苗组合 物，包含基本上二聚或基本上三聚HCV E2,或二聚和三聚HCV E2糖蛋白的混合物，或HCV E2 的三聚和更高级形式的混合物，或HCV E2的二聚、三聚和更高级形式的混合物或HCVE2的 更高级形式。
[0124] 在另一个方面，本发明提供了包含基本上二聚或三聚和/或更高级形式的HCV E2 糖蛋白的组合物，用于在人或动物中引发抗体和/或细胞免疫应答。
[0125] 由真核细胞表达的重组HCV E2糖蛋白通常以单体、二聚体、三聚体和更高级形式 的混合物形式存在。HCV E2可在真核或原核细胞中表达。真核细胞包括本领域已知的哺乳 动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。将宿主细胞培养一段时间其足以使宿主细胞表 达重组蛋白，更优选地，将蛋白分泌至宿主细胞生长的培养基中，从而制备所述蛋白。
[0126] "重组宿主细胞"、"宿主细胞"、"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"，和其他表示作为 单细胞培养的原核微生物或真核细胞系的类似术语，可以互换使用，并指可以或已经用作 重组载体或其他转移DNA的受体且包括已被转染的原始细胞的后代的细胞。
[0127] 合适的哺乳动物细胞系包括但不限于：BHK、VERO、HT1080、293、293T、293F、RD、 COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、M0LT4/ 克隆 8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓瘤细 胞（如SB20细胞）和CEMX174,可以从例如ATCC获得。其他宿主细胞包括但不限于酵母， 例如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)，或昆虫细胞，如Sf9细胞。
[0128] 通过分子克隆到含有适当的启动子和其他适当的转录调控元件的表达载体中， 并转入原核或真核宿主细胞中从而产生重组蛋白，可以重组表达合成的DNA。此类操作技 术描述于 Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed.)(分子 克隆：实验室手册）· Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988。
[0129] 例如，用于在酵母中表达的构建体优选含有合成的基因，同时与相关的转录和翻 译调控序列可操作地连接，如启动子（如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK)，和终止序列（如 酿酒酵母（S. cerevisiae) ADHl终止子）。酵母可以选自下组：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、汉逊酵母（Hansenula polymorpha)、巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris)、脆 壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces Iactis)和 粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe)。参见 Yeast Genetics:Rose et al·，A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1990。本领域已知可以对在酵母中表达的核酸分子进行密码子优化（见Sharp and Cowe，Yeast, 7:657-678, 1991)。对于任何给定的细胞类型，本领域的普通技术人员可以按 照有关表达载体的本说明书的教导和本领域已知的信息来选择合适的载体和调控元件。
[0130] 可用于在宿主细胞系中克隆和表达的载体是本领域公知的，并且包括但不限于： 用于在哺乳动物细胞系或酵母（真菌）细胞中克隆和表达的载体，用于在细菌细胞系中克 隆和表达的载体，用于在噬菌体中克隆和表达的载体，以及用于在昆虫细胞系中克隆和表 达的载体。可使用标准的蛋白纯化方法回收所表达的蛋白。
[0131] 翻译调控兀件参见 M. Kozak (e. g.，Kozak, Mamm Genome, 7 (8) : 563-74, 1996 ;Kozak ，Biochimie. ,76(9):815-21, 1994 ;Kozak，J Cell Biol, 108(2):229-241, 1989 ;Kozak and Shatkin，Methods Enzymol，60:360-375, 1979)。
[0132] 可以使用以下文献所述的标准方法方便地制备重组糖蛋白，例如，Sambrook, et al.，1989 (同上），特别是第 13、16 和 17 章 ；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons Inc, 1994,特别是第 10 和 16 章；以及 Coligan et al. ,1995-1997(同上），特别是第1、5和6章。多肽或多核苷酸可以通过化学合成 来合成，例如，使用溶液合成或固相合成，其描述于Atherton and Shephard, Peptide Synthesis. In Nicholson ed. , Synthetic Vaccines, published by Blackwell Scientific Publications, and in Roberge et al·，Science, 269 (5221) :202-204, 1995 第 9 章中。
[0133] 本发明还提供了一种用于免疫个体抗丙型肝炎病毒感染的方法，该方法包括向所 述个体施用包含基本上单体耗尽的HCV E2的组合物。
[0134] 在一个相关的实施方案中，本发明还提供了一种用于治疗个体的丙型肝炎病毒感 染的方法，该方法包括向所述个体施用包含基本上单体耗尽的HCV E2的组合物。
[0135] 本发明还提供了一种在个体或患者体中引发体液或细胞介导的免疫应答的方法， 该方法包括向所述个体或患者施用有效量的包含基本上单体耗尽的HCV E2的组合物。
[0136] 根据这些实施方案，通常是在足以引发免疫应答的条件下，包括产生E2特异性抗 体，施用一段时间的所述组合物。本发明的组合物可以作为单剂量或应用（applications) 施用。或者，该组合物可包括重复剂量或应用，例如，该组合物可以施用2、3、4、5、6、7、8、9、 10次或更多次。
[0137] 本发明所考虑的接种治疗方案的实例如下：初次接种后，个体一般在2至4周的间 隔，例如3周间隔后接受加强免疫（boost)，随后任选地重复加强免疫。在本发明的一个具 体实施方案中，提供单剂量的接种计划，由此单剂量的该组合物足以提供抗丙型肝炎的保 护，从而在初次接种后无需任何加强免疫。
[0138] 在一些实施方案中，所产生的抗基本上单体耗尽的HCV E2抗体，包括那些至少部 分中和HCV生命周期的某个重要部分，如宿主细胞入侵或病毒出芽的那些抗体。本发明还 涉及基本上单体耗尽的HCV E2在用于治疗或预防HCV感染或在制备用于治疗或预防HCV 感染的药物中的应用。本发明还包括人源化和去免疫抗体。术语"制备"包括生产或筛选。
[0139] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种在个体或患者中引发体液或细胞介导的 免疫应答的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的包含基本上二聚和/或三聚和/或 更高级形式的HCV E2的组合物。
[0140] 在一个相关的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗个体的丙型肝炎感染或免 疫个体抗丙型肝炎感染的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的包含基本上二聚和/ 或三聚和/或更高级形式的HCVE2的组合物。
[0141] 在一些实施方案中，本发明提供了一种筛选治疗抗体或其他治疗结合剂的方法， 包括筛选这样的抗体或试剂，其（i)能够结合一种或多种二聚或三聚或更高级形式的HCV E2,和/或（ii)不结合单体HCV E2。
[0142] 本发明中使用的术语"有效量"包括"治疗有效量"和"预防有效量"，表示在一些 个体中提供所需治疗、预防或生理效应的本发明的组合物足够量，无论是以单剂量或是作 为连续或缓释系统的一部分。不良影响，例如副作用，有时会随着治疗效果出现；因此，从业 人员在确定一个适当的"有效量"时平衡潜在的益处及潜在的风险。所需的组合物的确切 量可由不同个体而异，取决于个体的种类、年龄和总体条件、给药方案等。因此，不可能指定 确切的"有效量"。然而，在任何个别情况下，合适的"有效量"可以由本领域普通技术人员 采用常规的技能或实验来确定。本领域的普通技术人员将能够根据如事先施用的组合物或 其他试剂、个体的体重、个体症状的严重程度或感染群体症状的严重程度、病毒负载以及具 体的组合物或选择的给药途径等因素来确定所需的用量。
[0143] 术语"治疗"是指对于至少一些个体的一种或多种HCV症状或发展成为HCV晚期 症状的风险或发生HCV传播风险的可测量的或统计学上显著的改善。
[0144] 术语"预防（prevention) "和"预防（prophylaxis) "等可互换使用，包括向未知 将感染HCV的个体施用本发明的组合物，以预防或减轻后续感染或降低感染的风险或降低 HCV感染相关病症或病症的病征的严重性或发作。
[0145] 疫苗组合物给药一般是出于预防目的。该组合物的预防给药是为了预防或减轻任 何后续感染。"药学上可接受"的组合物是能够被受试患者耐受的组合物。考虑了施用有效 量的疫苗。"有效量"是指实现所需生物效应的足够的量，如诱导足够的体液或细胞免疫。 这可能取决于疫苗的种类、受体的年龄、性别、健康和体重。所需生物效应的实例包括但不 限于：没有症状产生，症状减轻，组织或鼻腔分泌物中的病毒滴度下降，抗丙型肝炎病毒感 染的完全保护，抗丙型肝炎病毒感染的部分保护。
[0146] 在一些实施方案中，如果本发明的疫苗或组合物的存在导致受试患者生理机能的 可检测的变化，所述变化增强抗至少一种感染性丙型肝炎病毒株的至少一个初次或再次体 液或细胞免疫应答或显示出所述应答的增强，则本发明的疫苗或组合物是生理学上显着 的。施用疫苗组合物以防止病毒感染。"保护"不一定是绝对的，即，如果与对照群体或患者 组相比，统计学上有显着改善，则丙型肝炎感染不必完全预防或根除。保护可能是限于降低 丙型肝炎病毒感染的严重性或症状的迅速发作。
[0147] 在一个实施方案中，在感染发生之前（以预防或减低预期的感染）或在感染发生 之后，将本发明的疫苗组合物提供给个体，从而防止病毒感染。在一些实施方案中，在感染 前或感染发作后将本发明的疫苗组合物提供给个体，以减低病毒在个体间的传播。
[0148] 还应当理解，本发明的组合物可作为唯一的活性药剂给药，或与一种或多种药剂 组合使用，用于治疗或预防丙型肝炎感染或与HCV感染有关的症状。与组合物联合给药的 其他试剂或本发明的组合物的组合包括，用于治疗由HCV感染引发的疾病或通过直接或间 接机制抑制HCV病毒的复制。这些药剂包括但不限于：宿主免疫调节剂（例如，α -干扰素、 聚乙二醇化的α-干扰素、复合干扰素、β-干扰素、Y-干扰素、CpG寡核苷酸等）；抑制宿 主细胞功能的抗病毒化合物，如肌苷一磷酸脱氢酶（例如，利巴韦林等）；调节免疫功能的 细胞因子（如白细胞介素2、白细胞介素6和白细胞介素12);增强1型辅助性T细胞应答 的化合物；干扰RNA ;反义RNA ;包含HCV抗原或针对HCV抗原佐剂组合的疫苗；与宿主细胞 成分发生相互作用的试剂，其通过抑制启动HCV病毒复制的翻译步骤的内部核糖体进入位 点（IRES)从而阻断病毒蛋白合成，或用靶向膜蛋白家族的病毒膜蛋白如HCV Ρ7等的试剂 来阻止病毒粒子成熟和释放；以及任何试剂或试剂组合，所述试剂通过靶向病毒基因组中 参与病毒复制的其他蛋白来抑制HCV复制，和/或干扰其他病毒靶标的功能如NS3/NS4A蛋 白酶抑制剂、NS3解旋酶抑制剂、NS5B聚合酶抑制剂、NS4A蛋白抑制剂和NS5A蛋白抑制剂。
[0149] 根据另一个实施方案，本发明的药物组合物还包含HCV生命周期中靶标的其他抑 制剂，所述革巴标包括但不限于：解旋酶、聚合酶、金属蛋白酶、NS4A蛋白、NS5A蛋白和内部核 糖体进入位点（IRES)。
[0150] 给药通常是在足以引起免疫应答的条件下，包括产生E2特异性抗体或细胞免疫 应答，持续一段时间。免疫原性组合物可采用便利的方式进行给药，例如，通过肺、口服、静 脉（其为水溶性的）、腹膜内、肌内、皮下、皮内、鞘内或栓剂途径或植入（例如，使用缓释制 剂）。给药可以是全身或局部，尽管全身给药更方便。考虑的其他给药途径为通过贴剂、细 胞转移（cellular transfer)、植入、舌下、眼内、局部、口服、直肠、阴道、鼻或透皮。
[0151] 本发明中使用的"免疫应答"是指身体作为一个整体对本发明组合物存在的反应， 包括针对该组合物产生抗体和发展免疫力。因此，对抗原的免疫应答还包括针对目标抗原 在个体中形成体液和/或细胞免疫应答。"体液免疫应答"受浆细胞所产生的抗体介导。"细 胞免疫应答"是T淋巴细胞和/或其他白细胞所介导的免疫应答。
[0152] 本发明中使用的"抗体滴度"可以被定义为对于每个个体，导致比免疫前的样品更 大的值的免疫后血清的最高稀释度。
[0153] 本发明的实施方案还提供用于评价对从基本上单体耗尽的HCVE2中分离出的组 分的免疫应答的试验。该试验可包括体内试验，如测定抗体应答和迟发型超敏反应试验。在 一个实施方案中，测定抗体应答的试验主要是测定B细胞功能以及B-细胞/T-细胞之间相 互作用。对于抗体应答试验，可比较抗原激发后血液中的抗体滴度。可根据抗体的类型进 行级别定量，例如，IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA或IgD。此外，可通过测定无抗原 刺激下血液中的抗体和淋巴细胞水平来评价免疫系统的发展。
[0154] 所述试验还可包括体外实验。体外实验可包括测定细胞分裂能力，或帮助其他细 胞分裂的能力，或释放淋巴因子和其他因子的能力，表达激活标志物的能力以及裂解靶细 胞的能力。可在体外实验中比较小鼠和人的淋巴细胞。在一个实施方案中，对类似来源的 淋巴细胞，如外周血细胞、脾细胞或淋巴结细胞进行比较。然而，比较不同来源的淋巴细胞 是可能的，如非限制性的例子是，人类的外周血细胞和小鼠的脾细胞。对于体外试验，细胞 可以是纯化的（如B细胞、T细胞和巨噬细胞），或保持它们的天然状态（例如，脾细胞或淋 巴结细胞）。纯化可以采用能够达到期望结果的任何方法。可使用有丝分裂原或特异性抗 原进行体外试验来测定细胞的增殖能力。可使用混合的淋巴细胞反应（MLR)试验来测定细 胞在特定抗原存在下的分裂能力。可检测培养细胞的上清液来定量细胞分泌特定淋巴因子 的能力。从培养物中移走细胞，并测试它们表达激活抗原的能力。这可通过如同在利用抗 体或配体以及探针的非限制性实例中一样的任何合适方法进行，所述抗体或配体结合激活 抗原，所述探针结合编码所述激活抗原的RNA。
[0155] 此外，在一个实施方案中，可进行细胞表型检测试验来确定某些类型的细胞频率。 可进行外周血白细胞计数来确定血液中淋巴细胞或巨噬细胞的数量。抗体可用于筛选外周 血淋巴细胞，以确定表达某些抗原的细胞百分比，如测定⑶4细胞计数和⑶4/⑶8的比值的 非限制性实例中一样。
[0156] 根据这些实施方案，一般在足以引起免疫应答的条件下，包括E2特异性抗体或 细胞免疫应答的产生，施用所述组合物一段时间。本发明的组合物可作为单剂量或应用 (applications)给药。另外，该组合物可包括重复剂量或应用，例如，该组合物可以施用2、 3、4、5、6、7、8、9、10 次或更多次。
[0157] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备抗基本上单体耗尽的HCV E2组 合物的抗体的方法，包括向个体注射免疫有效量的基本上单体耗尽的HCV E2组合物，并分 离和纯化所产生的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了纯化的针对基本上单体耗尽 的HCVE2而产生的抗体。
[0158] 在另一个实施方案中，本发明提供了针对基本上单体耗尽的HCVE2形式而产生的 抗体。在一些实施方案中，抗体对存在于三聚或二聚或更高级形式，或HCV E2糖蛋白的三 聚和二聚形式，或HCV E2糖蛋白的三聚和更高级形式中的表位是特异的，并能够区分HCV E2的单体、二聚、三聚和更高级形式，或者区分HCV E2的二聚/三聚形式。
[0159] 抗体可以是多克隆或单克隆的。另外，筛选的抗体可用于诊断、预后、治疗、预防和 筛选目的，通常使用的标准是相关领域的技术人员已知的。
[0160] 术语"抗体（antibody) "、"抗体（antibodies) "包括多克隆抗体和单克隆抗体和 来自于单克隆抗体的各种形式，包括但不限于：全长抗体（例如，具有完整Fc区），抗原结 合片段，包括例如Fv、Fab、Fab'和F (ab'）2片段；以及使用重组方法产生的抗体来源的多 肽，如单链抗体。本发明中使用的术语"抗体（antibody)"和"抗体（antibodies)"是指例 如在转基因动物中或通过噬菌体展示所产生的人抗体，以及抗体、人或人源化抗体、灵长类 源化抗体或去免疫抗体。还包括治疗上可接受的其他形式的抗体和它们的抗原结合片段， 例如来自于软骨海洋动物或骆驼的单结构域抗体，或基于这些抗体的库。抗体片段或其修 饰形式的筛选还要考虑到所述抗体片段或其修饰形式对所述抗体或其片段的半衰期的任 何影响。
[0161] 在一些实施方案中，提供了抗体与药学上或药理学上可接受的载体、稀释剂或赋 形剂。
[0162] 在另一些实施方案中，筛选出用于诊断或预后的抗体。在一些实施方案中，提供了 包含抗HCV E2糖蛋白三聚体或抗二聚体或抗更高级形式的抗体的试剂盒。
[0163] "药学上可接受的载体和/或稀释剂"是指由这样的材料构成的药物媒介，所述材 料不是在其他方面不良的，即所述材料自身或与活性组合物一起不会引起主要不良反应。 载体可以包括所有的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂，用于调节张力、提高或 降低吸收或清除速率的试剂，维持pH值的缓冲液，螯合剂，膜或屏障跨越剂（membrane or barrier crossing agent)。药学上可接受的盐是指不是在其他方面不良的盐。所述试剂 或包含所述试剂的组合物可以以药学上可接受的非毒性盐的形式施用，如酸加成盐或金属 配合物。
[0164] 对于口服给药，可以将组合物配制成固体或液体制剂，如胶囊剂、丸剂、片剂、锭 齐IJ、粉剂、悬浮剂或乳剂。在制备口服剂型的组合物时，可以采用任何常用的药物介质，例 如，在口服液体制剂（如悬浮剂、酏剂和溶液）的情况下，使用水、乙二醇、油、醇、调味剂、防 腐剂、着色剂、悬浮剂等，或者在口服固体制剂（如粉剂、胶囊和片剂）的情况下，使用载体 如淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于其易于给药，片剂和胶囊代表 最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下，显然使用固体药物载体。片剂可含有粘合剂如 黄蓍胶、玉米淀粉或明胶，崩解剂如藻酸，以及润滑剂如硬脂酸镁。如果需要，可采用标准技 术对片剂进行糖包衣或肠溶包衣。可将活性组合物包入胶囊中，使其稳定地通过胃肠道。例 如，参见国际专利公开WO 96/11698。
[0165] 对于非肠道给药，可将该组合物溶解于载体中，并作为溶液或悬浮剂给药。对于经 粘膜或经皮（包括贴剂）递送，使用本领域中已知的适当的渗透剂递送所述组合物。对于吸 入，递送使用任何便利的系统，如干粉气雾剂、液体递送系统、喷气喷雾器、推进剂系统。例 如，所述制剂可以以气溶胶或喷雾形式施用。所述组合物也可以是持续递送或缓释模式递 送。例如，能够持续递送的可生物降解的微球或胶囊或其他聚合物构型可包括于所述制剂 中。可以修饰制剂来改变药代动力学和生物分布。对于药代动力学的一般讨论,参见例如， Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物学），1990 (同上）。在一些实施方案 中，可将所述制剂整合至单层或双层脂质中，如脂质体或微胶粒。可以使用本领域中已知的 靶向疗法，来将所述药剂更特异地递送到特定类型的细胞或组织。
[0166] 所施用活性剂的实际用量、给药速率和时程应取决于疾病的性质和严重程度。治 疗处方，对例如剂量、时间等的决定，是在普通从业人员或专家的责任内，并考虑到个体患 者的疾病状况、递送位点、给药方法及从业人员所知的其他因素。技术和操作的实例可见于 Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物学），1990 (同上）。
[0167] 可以制备的缓释制剂对于诱导免疫应答特别方便。缓释制剂的实例包括含有所述 多肽的固体疏水性聚合物的半透性基底，所述基底是成型制品的形式，例如，膜或微胶囊。 缓释基底的实例包括：聚酯、水凝胶（例如，聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯 醇））、聚乳酸、L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的 乳酸-乙醇酸共聚物，以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳 酸-羟基乙酸，能够在100天内释放分子，然而某些水凝胶可在较短时间内释放蛋白质。可 以使用脂质体，为小（约200-800埃）单层脂质类型的脂质体，其中脂质含量比胆固醇高出 约30%，可调整所选择的比例以用于最佳治疗。
[0168] 可以通过修饰巯基残基，从酸性溶液中冷冻干燥，控制水分含量，使用适当的添加 齐IJ，以及开发具体聚合物基底组合物来稳定蛋白质。可使用本领域中已知的技术，包括，例 如，通过连接其他成分，如聚乙二醇（PEG)基团，延长蛋白质在体内的半衰期。
[0169] 考虑了本领域所公开的初免-加强免疫（Prime-boost immunization)策略。例 如，参见国际公开W0/2003/047617。因此，组合物可以是疫苗、引剂发或加强剂（boosting agent)的形式。
[0170] 在另一个方面，本发明提供了利用基本上单体耗尽的HCV E2的筛选方法。涉及基 本上单体耗尽的HCV E2的筛选方法旨在鉴定结合分子。通常使用本领域公认的方法分离 和筛选结合分子，如抗体或抗原结合片段、配体、肽、有机或无机分子。
[0171] 本发明还提供了基本上单体耗尽的HCV E2在诊断或监测HCV感染或者监测抗HCV 疗法中或者在制备用于诊断或监测HCV感染或者监测抗HCV疗法的诊断试剂中的应用。
[0172] 本发明提供了用于制备纯化的针对基本上单体耗尽的HCV E2组合物的抗体的方 法，该方法包括向个体施用基本上单体耗尽的HCVE2糖蛋白或编码所述糖蛋白的核酸，从 中筛选出能够结合基本上单体耗尽的HCV E2,尤其是阻断受体结合的抗体。在一些实施方 案中，测试抗体或抗原结合片段中和病毒活性的能力，如降低病毒的传染性、病毒出芽或病 毒载量的能力。
[0173] 本发明考虑了筛选方法，该方法包括：使假定的相互作用化合物与基本上单体耗 尽的HCV E2糖蛋白接触，并确定假定的相互作用化合物与E2组合物之间相互作用的结合 特点，或它与HCV受体如CD81或被HCV结合的宿主其他部位结合的能力。
[0174] 本发明所考虑的方法包括将来自于个体的样品与基本上单体耗尽的HCV E2糖蛋 白接触，并测定样品组分与HCV E2糖蛋白之间的相互作用。在一些实施方案中，可使用来 自于不同HCV基因型的不同二聚体和/或三聚体或单体耗尽的E2糖蛋白的组合（arrays)。 在一些实施方案中，所述样品是包含抗体的样品，如血液样品。
[0175] 在一些实施方案中，样品来自于感染的个体。对照样品包括来自于未感染的个体。 样品可以来自于个体的任何部位。方便的样品包括血液、血清、血浆、尿液、痰液等。适当的 试验是本领域技术人员已知的，包括ELISA、RIA和EIA类试验以及竞争性试验。个体试验 特别适用于血清学监测。
[0176] 在另一个方面，本发明提供包含基本上单体耗尽的HCV E2糖蛋白的试剂盒或固体 或半固体基底（substrate)。本发明所考虑试剂盒或基底用于诊断、预后、治疗或预防，以及 用于设计和/或筛选HCV E2结合分子或HCV受体结合分子。所述试剂盒和基底也可用于 监测抗HCV感染的治疗方法的效果。在一些实施方案中，所述试剂盒或基底在另一部分中 还包含基本上为单体的HCV E2。
[0177] 包含基本上为单体HCV E2的组合物所包括的制剂具有大于80%、85%、90%、 95%、97%或99%(按重量计）的单体E2。
[0178] 在一些实施方案中，包含基本上单体耗尽的HCV E2糖蛋白的试剂盒可方便地用于 (或用在）病毒感染的诊断或预后，或病原体的监测或血清学监测试剂盒，并任选地包括包 装、说明书和各种其他成分，如缓冲液、基底、抗体或配体、对照抗体或配体，以及检测试剂。
[0179] 在一些实施方案中，使用抗三聚体和抗二聚体和抗更高级形式的HCV E2特异性抗 体。
[0180] 术语"分离的"和"纯化的"是指物质基本上或实质上不含在自然状态下通常与其 伴随的组分。例如，"分离的核酸分子"是指这样的核酸或多核苷酸，其分离自在天然存在的 状态下位于其侧翼的序列，例如，从通常与其相邻的序列上移出的DNA片段。特别是，分离 的HCVE2包括从天然细胞环境中和从与细胞的其他成分结合状态下在体外分离和/或纯化 蛋白。在没有限制的情况下，分离的核酸、多核苷酸、肽或多肽可以指通过纯化分离的天然 序列，或指通过重组或合成的方法产生的序列。在一些实施方案中，纯化的基本上单体耗尽 的HCV E2的纯度为至少95 % -99 %。
[0181] 提到变体包括其部分、衍生物及化学类似物。所考虑的化学类似物包括侧链的修 饰，在合成过程中掺入非天然氨基酸和/或它们的衍生物，以及使用接头或交联接头，或其 他方法，尤其是强加构象限制的方法。
[0182] 通过以下非限制性的实施例对本发明进行进一步描述。实施例中所使用的材料和 方法提供如下。
[0183] 蛋白纯化和尺寸排阻层析：哺乳动物表达的E2蛋白
[0184] 从三个不同分离株中制备出两种形式的E2糖蛋白，使用293E细胞，在哺乳动物 表达系统中表达野生型E2 661-his构建体（WT-his，WT E2661-his)及缺少三个可变区的经修 饰的E2661-his(HVR123-his)。WT-his描述于WO 2008/022401中。或者，也可用昆虫系统 或酵母表达系统来产生E2糖蛋白。除非另有说明，提到WT和缺少三个可变区的经修饰的 E2661-his是指HCV的H77c (基因型la)毒株的E2序列。
[0185] 根据制造商的建议，用以Ni-MAC缓冲液A平衡的Ni-S印harose 6Fast_Flow树脂 (GE Healthcare)纯化组织培养上清液，并用Ni-MAC缓冲液B洗脱结合的蛋白。含蛋白的级 分按照Bradford法（BioRad公司）进行检测，并使用HiPrep26/10脱盐柱（GE Healthcare) 和AKTA Explorer快速液体蛋白层析系统（FPLC, GE Healthcare)进行缓冲液更换到磷酸 盐缓冲盐溶液（1XPBS ;10mM NaPO4, 150mM NaCl，pH 7· 3)中。
[0186] 为了分离出不同形式的E2661/5_his(JFHl株一在所述JFHl株中，有贡献额外 的4个氨基酸残基的插入，因此E2胞外区的末端实际上是位于第665位的残基），使用 AKTA Explorer FPLC 系统和用 IXPBS 平衡的 TSKG3000swXL 柱（21. 5_X60cm, TOSOH Biosciences, 200mL柱体积（CV))进行制备型尺寸排阻层析。最大注射体积为2mL,在 加样之前，根据制造商的建议，用截留分子量（MWCO)为10, 000道尔顿（Da)的过滤单元 (Amicon)将纯化的蛋白浓缩至约10mg/mL。由于在该浓度下从溶液中沉淀出蛋白，因此从 pH值7. 3-6. 8滴定缓冲液，以避开这些蛋白的预测等电点（pi) (ProtParam)。以2mL/min 的平均流量运行样品，在60-160mLs之间收集2mL级分。合并多个运行收集的级分，得到 0.1-lmg/mLo
[0187] 使用Waters高效液相色谱系统（HPLC，Alliance)和最大负荷容积为0· 2mL的小 TSKG3000swxl柱（TOSOH, 7. 8mmX30cm，15mLCV)，进行分析型尺寸排阻色谱分析。为了达到 最大分辨率，以〇. 25mL/min的流量在IXPBS中进行试验60分钟。利用这种方法，在室温 下对峰值单体和二聚体级分进行超过72小时的稳定性分析，每24小时编程运行程序，包括 在0分钟的参照样品。以0.5mg/mL纯化的牛血清白蛋白和卵清蛋白（GE Healthcare)作 为尺寸标准对照。
[0188] 使用NanoDrop(Thermo Scientific)，通过280nm处的吸光度对蛋白进行定量。使 用根据ProtParam(Expasy)由氨基酸序列测得的理论消光系数（ε)来调整浓度。
[0189] 为了分离出四种不同的WT和A123E2661_his蛋白级分，进行Ni琼脂糖高效色谱。 将蛋白溶于含20mM磷酸钠、0.5M NaCUlOmM咪唑（低UV)pH7.4的结合缓冲液中，然后装 载至 5mL HisTrap HP 柱（GE Healthcare)中。用 20mM 磷酸钠、0.5M NaCl、25mM 咪唑（低 UV)pH 7. 4进行预洗脱步骤，并用20mM磷酸钠、0. 5M NaCl、500mM咪唑（低UV)pH 7. 4进行 洗脱。然后在Superdex 200pg 26/60柱（GE Healthcare)中进行尺寸排阻层析。合并选 出的级分，用〇. 22 μ m过滤。
[0190] 使用与上述Ni琼脂糖色谱相同的方法，制备各种蛋白的未分级的混合物，但不进 行尺寸排阻。在从Ni琼脂糖洗脱后，旋即在HiPr印26/10脱盐柱（GE Healthcare)中对样 品进行脱盐。
[0191] 细菌表达的蛋白
[0192] 由麦芽糖结合蛋白（MBP)连接至第113-201位残基之间的⑶81大胞外环（LEL) (MBP-LEL 113H)构成的嵌合体的表达和纯化，先前已有描述（Drummer et al. ,Biochem Biophys Res Commun 328:251-257,2005 ;Drummer et al.，J Virol 76:11143-7,2002)。所 述⑶81-LEL的二聚体形式已被广泛用于表征E2-⑶81相互作用，并已经证明是极好的天然 CD81的模拟物，并可与Claudin-I的第一胞外环（ECl)相互作用（Harris et al·，J Biol Chem 285:21092-102,2010)。此外，它反映出在hCD81-LEL晶体结构中观察到的同型二聚 体以及细胞相关的全长CD81之间的同型相互作用。
[0193] CD81MBP-LEL113.WT 和 F186S 转化的 BL21DE3 细胞（Invitrogen)培养于添加有 盐和氨苄青霉素的"极品肉汤"（TB)培养基中。
[0194] 用0. ImM异丙基β-D-I-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)，在室温下诱导蛋白表达4 小时，收获细胞，洗涤并储存于_80°C。在S-缓冲液中通过超声处理分离可溶性蛋白，以 20, OOO Xg离心澄清，并用0· 45 μ m滤器过滤。使用直链淀粉树脂（New England Biolabs), 根据制造商的说明书，对蛋白进行亲和纯化。采用Bradford试验（BioRad)测定用IOmM麦 芽糖洗脱的蛋白阳性级分。使用AKTA FPLC和用S-缓冲液平衡的Superdex 200pg 16/20 柱（GE Healthcare),通过尺寸排阻层析分离出所述二聚体和单体蛋白。使用HR Superdex 200柱（GE Healthcare)和AKTA FPLC进行尺寸排阻层析分析证实了单一的二聚体峰的分 离。使用30, OOODa MWCO过滤单元（Amicon)浓缩蛋白，并按上述方法进行定量。
[0195] 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
[0196] 采用预制的4-12% Nu-PAGE (Novex)，使用预染色的Precision-Plus尺寸标准标 记（Bio-Rad)对纯化的E2661-his蛋白进行分析。根据需要，在非还原或还原条件下进行 操作，并用考马斯亮蓝溶液（0.1%?八考马斯亮蓝1?-250?1 〇-1^(1)，5%￥八冰醋酸，50% v/v甲醇）染色观察。用10% (v/v)甲醇和10% (v/v)醋酸对凝胶进行脱色，用Odyssey LI-COR荧光扫描仪和定量软件对考马斯亮蓝染色的蛋白的迁移进行分析。
[0197] 利用加入10μ L 4X还原/非还原样品缓冲液（Invitrogen)中的3μ g的各 HCV-His变体，对WT和Λ 123E 2661-his蛋白的四种不同的级分以及未分级的混合物进行分 析。将样品在70°C加热3分钟，并装载至4% -12%的Bis-Tris Nu-PAGE SDS-PAGE凝胶 中。对于还原凝胶而言，向凝胶罐（tank)的中央部位加入500 μ L抗氧化剂Nu-PAGE，然后 施加200V电压。
[0198] 蛋白质印迹分析
[0199] 利用加入4X还原样品缓冲液（Invitrogen)中的0· 5μ g的各HCV-His变体，对 WT和Λ 123E 2661-his蛋白的四种不同的级分以及未分级的混合物进行分析。还原SDS-PAGE 按上述操作进行。然后通过湿转移（1小时）将上述蛋白转移至PVDF膜中。将所述膜用 含2%脱脂牛奶的PBS溶液封闭过夜。加入用含1%脱脂牛奶的0.05% TBS按1:1000稀 释（Penta His&E2)的一抗。在0.05% TBS中洗涤3次，每次10分钟。加入用含1 %脱脂 牛奶的0. 05% TBS按1:2000稀释的绵羊抗小鼠 IgG HRP的二抗（Millipore)。在0. 05% TBS中洗涤3次，每次10分钟。按照制造商的说明书，向所述膜中加入ECL Plus蛋白质印 迹检测试剂（ECL Plus Western Blotting Detection Reagent, GE,产品编号 RPN2132)，并 在520nm处观察条带。
[0200] 质谱分析
[0201] 使用基质辅助激光解吸/电离（MLDI)-飞行时间（TOF)质谱分析（MS)法 MALDI-T0F-MS进行质谱分析。在进行MALDI-T0F-MS分析之前，按照制造商的说明书使用 ZipTip(Millipore)对单体和二聚 E2661-his 蛋白-WT 和 ΛHVR1+2+3 进行纯化。
[0202] 生物传感器分析与评价
[0203] 所有实验均使用Biacore 2000单元（GE Healthcare)进行。将蛋白配体进 行缓冲液更换到PH值为4. 2的IOmM醋酸钠中，然后通过胺耦合法固定到CM5芯片（GE Healthcare)上，获得约 800 个响应单元（RU)。在 IXHBS-N 缓冲液（0· Olifepes, 0.15M NaCl，3mM EDTA)中进行固定。对于所有实验，阴性对照配体被固定于前述的流动池 中，或者采用阴性对照分析物注射以减少非特异性结合。动力学实验在HBS-EP缓冲液 (0· OlH印es, 0· 15M NaCl, 3mM EDTA, 0· 05% Tween 20)中以 10μ L/min流量进行。蛋白分析 物在HBS-EP中进行4-5次连续的两倍稀释，然后注射到系统中，起始浓度为0. lmg/mL。注 射进行250秒以获得结合速率，并允许解离600秒。包括在中点浓度进行的独立加样对照， 以确保浓度的准确性。各循环之间以l〇〇uL/min的流量重复，且包括两个15 μ L的IOOmM 磷酸脉冲。
[0204] 使用BIA评估软件，基于平衡热力学，根据三理论结合模型将原始的生物传感数 据进行整体拟合（GE Healthcare)。值得注意的是，在减去背景后，在任何原始数据中均未 观察到本体折射率效应（RI)，在拟合期间将RI设定为恒值〇。在不同的反应方案中，组分 A和B分别代表配体和分析物。
[0205] " I: ILangmuir 结合"模型
[0206] A+B 〇 AB,其中"ka"为正向，"kd"为反向。
[0207] KD = kd/ka
[0208] 分析物和配体之间的结合速率（ka = Ι/Ms)表示正向反应，且为分析物摩尔浓度 (M)与以秒（s)表示的时间的函数。解离速率（kd= Ι/s)作为时间函数表示反向反应，但 与浓度无关。以摩尔单位（M)表示的平衡解离常数或KD可通过解离速率（kd)除以结合速 率（ka)计算得到。
[0209] "两种状态结合（构象变化）"模型
[0210] A+B 〇 AB,其中 "kal" 为正向，"kdl" 为反向。
[0211] AB 〇 AB*, U冲 "ka2" 为正向，"kd2" 为反向。
[0212] KD = (kdl/kal)X (kd2/ka2)
[0213] 该模型形成两个动力学方程，其中一级结合速率（kal = Ι/Ms)和解离速率（kdl =ι/s)描述上述1:1的结合互作。二级结合速率（ka2 = Ι/s)和解离速率（kd2 = 1/s) 表示发生在分析物和配体之间相互作用后构象变化的动力学。这种相互作用被描述为时间 (s)的函数，但与分析物的浓度无关。整个KD值是通过由一级方程和二级方程所产生的KD 值相乘而得到。
[0214] "二价分析物"模型
[0215] A+ B O AB,其中 kal (X2)为正向，kdl 为反向。
[0216] AB + B η AB2,其中 ka2 为正向，kd2(X2)为反向。
[0217] KD = n/a
[0218] 该模型形成两个动力学方程，其中，一级结合速率（kal = l/MsX2)和解离速率 (kdl = Ι/s)表示如上所述的1:1结合互作，然而使结合速率（ka)乘以2以反映两个可获 得的配体结合位点。将二级结合速率（ka2 = Ι/RUs)计算为响应单元（RU)与以秒（s)表 示的时间的函数。使二级解离速率（kd2 = l/MsX2)乘以2,以反映两个可获得的配体结合 位点。值得注意的是，由于不同浓度下，单价和二价结合的程度不同，二价结合模型不能生 成亲和常数或KD，因此解离速率（kd)不再与浓度无关。
[0219] 由于传感器芯片检测到的折射率变化与在响应单元（RU)中测定的芯片上吸收量 变化成比例，因此采用如下方程式计算每种配体的分析物结合能力的理论最大值（R max):
[0220] Rniax =(分析物质量（MW) / 配体质量（MW)) X RlX S，
[0221] 在此，R1是固定的配体（⑶81-LEL二聚体）（RU)的水平，S是相互作用的化学计量 t匕，因此描述了分子质量、RU与结合速率之间的关系。理论Rmax通常高于实验Rmax，这是由 于尤其是当使用非特异性的固定化方法如胺偶联时，固定配体的功能性/有效性通常会受 到影响。实验Rmax可用于直接测定相互作用系统的KD值，但由于使芯片饱和需要大量的分 析物，因而常常难以确定。相反，通过如上所述不同分析物浓度下关联传感的整体拟合预测 出实验Rmax和KD :即KD浓度的0. 1-10倍最适于动力学分析。
[0222] 直接结合酶免疫测定
[0223] 用在 PBS 中稀释的 0. 5 μ g/mL 雪滴花（Galanthus nivalis)凝集素（Sigma)将 96孔Maxisorb酶联免疫板（Nalge Nunc)涂覆4°C下过夜16小时。然后除去凝集素，并 用BSAltlPBS (含10mg/mL BSA(Sigma)的PBS液）在室温下将空白位置封闭1-2小时。然后 添加在含0. 05%吐温20的PBS (PBST)中稀释的2 μ g/mL重组E2蛋白，并在室温下温育1 小时。然后将所述板在PBST中洗涤四次。然后向结合于雪滴花凝集素包被的所述板的E2 加入用BSA 5PBST(含5mg/mL BSA的PBST)连续稀释的豚鼠血清，并在室温下孵育2小时。 使用辣根过氧化物酶缀合的兔抗豚鼠免疫球蛋白（DAKO)(用BSA 5PBST按1:1000稀释）检 测结合的抗体，并按照制造商的建议，用四甲基对二氨基联苯底物（Sigma)进行显色。在 Fluostar (BMG技术公司）上读取450nm-620nm处（背景）的吸光度值（光密度）。
[0224] CD81抑制试验
[0225] 简言之，用含 5 μ g/mL 二聚 CDSIMBP-LEL113-2。1 的 PBS 液包被 96 孔 Maxisorb 酶联免 疫板（Nalge Nunc)，并于 4°C下孵育 16 小时。除去 MBP-LEL113-2。1 后，用 BSAltlPBS (含 IOmg/ mL BSA(Sigma)的PBS液）在37°C下封闭2小时，以减少非特异的结合。然后将所述板在 PBST (含 0. 05 % 吐温 20 (Sigma)的 PBS 液）中洗涤四次。将用 BSA5PBST (含 5mg/mL BSA 的PBST)连续稀释的免疫血清与50ng的H77c或JFHlWTE2661-his蛋白混合，然后加入到用 MBP-LEL113-201包被的免疫检测板中。利用兔抗-his抗体（Rockland Immunochemicals)检 测结合的E2661-his。进一步用PBST洗涤之后，使用辣根过氧化物酶缀合的抗兔免疫球蛋白 (DAKO)(用BSA 5PBS/吐温按1:1000稀释）检测结合到MBP-LEL113-201上的残基E2复合物， 并按照制造商的建议，用四甲基对二氨基联苯底物（Sigma)进行显色。在Fluostar (BMG技 术公司）上读取450nm-620nm处（背景）的吸光度值（光密度）。计算每个血清样品抑制 80 %的滴度。
[0226] HCVpp中和试验
[0227] 用 1 μ g 的 pNL43. LUC. R-E-加上 1 μ g 的 H77c ρΕ1Ε2 载体（Drummer et al.，FEBS Lett 546:385-90, 2003)或编码非功能性E1E2(空白）的pcDNA4HisMax载体共转染HEK 293T细胞。转染72小时后，收集含有HCVpp的培养上清液，并进行过滤（0. 45 μ m)。将豚 鼠血清经连续稀释后与H77c HCVpp病毒在37°C下孵育1小时，然后一式四份加入到于前一 天以3 X IO4个细胞/孔接种于48孔组织培养板（Nunc, Nalge)中的的单层Huh7. 5细胞中。 孵育4小时（37°C，5% CO2)后，用PBS洗涤细胞并更换培养基。再经过3天孵育（37°C，5% 〇)2)后，裂解细胞，并在配备有发光光学装置的？111 〇#&1'?1^1&1^6(*11〇1呢1^)中测定荧 光素酶的活性。
[0228] HCV细胞培养物来源的病毒（HCVcc)的进入、进入抑制和中和试验
[0229] HCV RNA由质粒DNA体外转录得到，所述质粒DNA编码含有如前所述的Gaussia荧 光素酶基因的感染性J6/JFH1嵌合基因型2a基因组。包括含有赋予其感染性丢失的GND突 变的相同质粒作为阴性对照。用XbaI酶消化来线性化所述DNA质粒，并使用T7Mega Script 试剂盒进行转录。然后通过与DNA酶I孵育除去DNA模板，并用苯酚-氯仿法沉淀扩增的 RNA。对RNA进行定量，并用I %琼脂糖-甲醛凝胶成像。使用DMRIE-C试剂（Invitrogen)， 按照制造商的建议将RNA转染至Huh7. 5单层细胞中，72小时后收获含HCVcc的上清液。澄 清上清并于-8〇°C保存。
[0230] 采用有限稀释法（TCID5tl)测定 HCVcc 感染滴度（Lindenbach et al.，Science 309(5734) :623-626, 2005)。简言之，对病毒母液进行连续稀释，然后加入到以3X IO3个细 胞/孔接种于96孔板的细胞中。感染72小时后，用IXPBS洗涤细胞，并在冷的甲醇中固 定，然后用抗FLAG抗体检测感染的细胞。结合的抗体用在PBST中按1:3稀释的与辣根过 氧化物酶缀合的山羊抗小鼠多克隆抗体进行检测，并在室温下温育1小时。然后将细胞用 PBS洗两次，用PBST洗一次。感染的细胞通过添加3, 3' -二氨基联苯胺（DAB)底物显示，并 在室温下孵育5分钟。然后将细胞用PBS洗涤两次，并向细胞中加入50 μ L PBS缓冲液以 避免干燥。在显微镜下观察细胞，并计算出阳性孔。
[0231] 米用 Reed-Muench 方法（Reed and Muench, A simple method of estimating fifty percent endpoints, The American Journal of Hygiene 27:493 - 497, 1938)计算 TCID500 Reed-Muench法通过以下方程计算产生50%感染的确切稀释度：
[0232]

【权利要求】
1. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2(E2)的组合物，其中所述HCV E2为基本上单 体耗尽的HCV E2。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其包含大于70%的二聚和/或三聚和/或更高级形 式的HCV E2糖蛋白。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其包含大于80% (按重量计）的三聚或三聚和 更高级形式的HCV E2糖蛋白。
4. 根据权利要求1或2所述的组合物，其包含大于80% (按重量计）的二聚HCV E2 糖蛋白。
5. 根据权利要求1或2所述的组合物，其包含大于80% (按重量计）的更高级形式的 HCV E2糖蛋白。
6. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2 (E2)的组合物，其中所述HCV E2为大于80 % (按重量计）的三聚HCV E2糖蛋白。
7. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2 (E2)的组合物，其中所述HCV E2为大于80 % (按重量计）的更高级形式的HCV E2糖蛋白。
8. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2 (E2)的组合物，其中所述HCV E2为大于80% (按重量计）的三聚和更高级形式的HCV E2糖蛋白。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其还包含药学上或生理上可接受的载体 和/或稀释剂。
10. 根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其还包含佐剂。
11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述佐剂为ISCOMATRIX?。
12. 权利要求1-11中任一项所述的组合物在治疗或预防HCV感染或者在制备用于治疗 或预防HCV感染的药物中的应用。
13. 权利要求1-11中任一项所述的组合物在诊断或监测HCV感染或监测抗HCV治疗方 案或者在制备用于诊断或监测HCV感染或监测抗HCV治疗方案的诊断试剂中的应用。
14. 根据权利要求13所述的应用，其中所述诊断试剂为抗体或包含所述抗体的抗原结 合片段。
15. 引发个体或患者免疫应答的方法，所述方法包括在足以引发免疫应答的条件下，向 所述个体或患者施用一段时间有效量的权利要求1-11中任一项所述的组合物。
16. 免疫个体抗HCV感染的方法，包括向所述个体施用权利要求1-11中任一项所述的 组合物。
17. 用于治疗或预防个体HCV感染的方法，包括在足以治疗或预防HCV的条件下，向所 述个体施用一段时间权利要求1-11中任一项所述的组合物。
18. 用于制备纯化的抗基本上单体耗尽的HCV E2抗体的方法，包括向个体施用有效量 的基本上单体耗尽的HCV E2,并纯化产生的抗体。
19. 试剂盒或者固体或半固体基底，包含权利要求1-11中任一项所述的组合物。
【文档编号】A61P31/14GK104324373SQ201410558503
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2011年11月25日 优先权日:2010年11月26日
【发明者】海蒂·卓默尔, 凯萨琳·麦卡弗里, 潘提利斯·庞博瑞斯 申请人:麦克法兰博尼特医学健康研究公司