一种熟附子多糖的提取方法及其新用途
【专利摘要】本发明公开了一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：（1）预处理，得到滤液与滤渣；（2）滤渣加入超纯水继续煎煮小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并；（3）将合并后溶液于蒸发至溶液剩余10%～20%，转移至烧杯，冷却至室温；（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌；（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在烘干，得到熟附子多糖粉末；所述熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，用于制备抗肿瘤药物；本发明的熟附子多糖的提取方法，该提取方法的预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，大大提高提取效率。
【专利说明】一种熟附子多糖的提取方法及其新用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多糖的提取方法及其新用途，尤其涉及一种熟附子多糖的提取方 法及其用于制备抗肿瘤药物的新用途，属于天然药物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 以四川江油为道地基点县，除四川江油县(现为市）等为附子的传统产区外，全国 共有四川、陕西、贵州、湖南、湖北、甘肃、云南、广西、江西、安徽等10个省区的336个县市为 附子适宜产区，适宜产区面积总和为294057. 69km2。运用《中药材产地适宜性分析地理信 息系统》（TCMGIS-I)，分析了附子的全国适宜产地。结果表明按附子药材生长所需要的气 候、土壤条件分析。四川凉山州布拖县由于地处高原，气候较为寒冷，植株生产周期更长，有 效成分的含量更高。现布拖附子的产量已占全国65%以上，2008年，布拖附子也被增加为道 地药材。
[0003] 近年来，肿瘤已经成为威胁人类健康的第一大疾病，对于肿瘤的治疗仍然以传统 的细胞毒类药物为主，中药具备毒副反应低的特点已被逐步重视。近年来，国家日益重视中 药现代化的投入，在传统的重要煎熬等治疗手段的背景下，结合现代分离提取工艺，获得有 效成分。药用多糖的研究始于20世纪50年代末对微生物多糖抗癌效果的发现。科学家 们从大量的药理和临床研究发现从天然产物中分离出来的多糖往往是一种免疫调节剂，它 能激活免疫细胞而对正常细胞没有毒副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视， 这已成为新药研究的热点之一。
[0004] 本发明通过优化的熟附子多糖提取方法，将获得的熟附子多糖产物进行一系列鉴 定，并通过药理实验对熟附子多糖的毒性作用和抗肿瘤作用进行研究，证明其可以用于制 备抗肿瘤药物。
【发明内容】
[0005] 针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种提取效率高的熟附子多 糖的提取方法及其用于制备抗肿瘤药物的新用途。
[0006] 本发明的技术解决方案是这样实现的：一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步 骤： (1)将熟附子原料l〇〇g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯 水1800mL?2200mL进行高温超声处理25?35分钟，收集滤液。
[0007] (2)滤渣加入超纯水1800mL?2200mL继续煎煮1. 5?2. 5小时后，与步骤（1) 中收集的滤液合并。
[0008](3)将合并后溶液于75°C?85°C蒸发至溶液剩余10%?20%，转移至烧杯，冷却至 室温。
[0009] (4)加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%?90%。
[0010] (5)将步骤（4)的溶液静置沉淀22?24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣 再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60°C?70°C烘干，得到熟附子多糖粉末。
[0011] 一种熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，所述熟附子多糖具备良好的抗肿 瘤作用，并且低毒，用于制备抗肿瘤药物。
[0012] 优选的，通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在同一时间点体重与正 常对照组无差异（P>〇. 05)。
[0013] 优选的，通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在解剖后的动物肝脏系 数和脾脏系数与正常对照组无差异（P>〇. 05)。
[0014] 优选的，通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的平均瘤重较模型组有显著降低 (P〈0. 001)。
[0015] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点： 本发明的熟附子多糖的提取方法，该提取方法的预处理方法在传统的水浸沸煮的基础 上进行了优化，将原料进行高速粉碎得到粉末后，再结合高温超声处理，有助于药材中的有 效成分分离，大大提高提取效率。熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，因此可以 用于制备抗肿瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明： 附图1为熟附子多糖的红外光谱鉴定图； 附图2为熟附子多糖对正常小鼠体重的影响的实验统计图； 附图3为熟附子多糖对正常小鼠脏器系数的影响的实验统计图； 附图4为熟附子多糖对荷瘤小鼠体重的影响的实验统计图； 附图5为熟附子多糖抗肿瘤作用效果的实验统计图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0018] 1、熟附子多糖的提取方法 实施例1: 一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤： (1)将熟附子原料l〇〇g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯 水1800mL进行高温超声处理25分钟，收集滤液。
[0019] (2)滤渣加入超纯水1800mL继续煎煮1. 5小时后，与步骤（1)中收集的滤液合并。
[0020] (3)将合并后溶液于75°C蒸发至溶液剩余10%，转移至烧杯，冷却至室温。
[0021] (4)加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%。
[0022] (5)将步骤（4)的溶液静置沉淀22小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分 别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60°C烘干，得到熟附子多糖粉末。
[0023] 实施例2 :-种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤： (1)将熟附子原料l〇〇g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯 水2000mL进行高温超声处理30分钟，收集滤液。
[0024] (2)滤渣加入超纯水2000mL继续煎煮2小时后，与步骤（1)中收集的滤液合并。
[0025] (3)将合并后溶液于80°C蒸发至溶液剩余15%，转移至烧杯，冷却至室温。
[0026] (4)加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为85%。
[0027] (5)将步骤（4)的溶液静置沉淀23小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分 别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在65°C烘干，得到熟附子多糖粉末。
[0028] 实施例3:-种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤： (1)将熟附子原料l〇〇g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯 水2200mL进行高温超声处理35分钟，收集滤液。
[0029] (2)滤渣加入超纯水2200mL继续煎煮2. 5小时后，与步骤（1)中收集的滤液合 并。
[0030] (3)将合并后溶液于85°C蒸发至溶液剩余20%，转移至烧杯，冷却至室温。
[0031] (4)加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为90%。
[0032] (5)将步骤（4)的溶液静置沉淀24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分 别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在70°C烘干，得到熟附子多糖粉末。
[0033] 上述提取方法的实施例，预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，将 原料进行高速粉碎得到粉末后，再结合高温超声处理，有助于药材中的有效成分分离，大大 提_提取效率。
[0034] 2、熟附子多糖总含量的测定 首先进行5%苯酚的配制，方法为称取12. 5g苯酚用超纯水定容至250mL。然后进行 标准溶液的配制，方法为准确称取100mg葡萄糖，定容至100mL，得到葡萄糖浓度为1000 mg/L的储备液。分别精密吸取储备液0. 10、0. 20、0. 40、0. 60、0. 80、1. 00mL于10mL容量 瓶中，得到浓度为 10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的系列标准溶 液。准备样品，方法为准确称取提取的熟附子多糖粉末10mg，用超纯水定容至100mL，80°C 水浴溶解。进行样品含量测定，分别取系列标准溶液、样品溶液及空白（以超纯水作空白）1 mL，于具塞比色管中，加入1mL5%的苯酚，摇匀，垂直迅速加入3mL浓硫酸，摇匀，沸水浴 15分钟。取出后迅速冷却。在490nm波长下进行测定。以吸光度A对浓度C回归得方程： A= 0.00794C+ 0.01559,r= 0.99。测得提取粉末总糖含量为89.6%。熟附子多糖得率 为 13. 4%。
[0035] 3、熟附子多糖的鉴定 借助红外光谱和紫外光谱测定技术，对熟附子多糖成分进行鉴定。红外光谱鉴定借助ThermoNICOLETislOFTIR进行。方法为取干燥后的粉末约1mg与100mgKBr固体粉 末在玛瑙研钵中研磨均匀，压片后在400?4000cm-l区波数范围内进行红外光谱扫描。为 了判断多糖中核酸和蛋白质杂质的成分，利用紫外光谱进行多糖的鉴定，借助贝克曼DU800 紫外分光光度计对多糖样本进行检测。结果如图1和下表所示：
【权利要求】
1. 一种熟附子多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将熟附子原料l〇〇g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯 水1800mL?2200 mL进行高温超声处理25?35分钟，收集滤液； (2) 滤渣加入超纯水1800mL?2200 mL继续煎煮1. 5?2. 5小时后，与步骤（1)中收 集的滤液合并； (3) 将合并后溶液于75°C?85°C蒸发至溶液剩余10%?20%，转移至烧杯，冷却至室 温； (4) 加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%?90% ; (5) 将步骤（4)的溶液静置沉淀22?24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。
2. 滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60°C?70°C烘干，得到熟附子 多糖粉末。
3. -种熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：所述熟附子多糖具备 良好的抗肿瘤作用，并且低毒，用于制备抗肿瘤药物。
4. 根据权利要求2所述的熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于： 通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在同一时间点体重与正常对照组无差异 (P>0. 05)。
5. 据权利要求2所述的熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过 动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在解剖后的动物肝脏系数和脾脏系数与正常 对照组无差异（P>〇. 05)。
6. 据权利要求2所述的熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过 动物实验得出：熟附子多糖给药组的平均瘤重较模型组有显著降低（P〈〇. 001)。
【文档编号】A61K31/715GK104387481SQ201410566573
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】李湧健, 陈嘉璐, 高静东, 张晓迪, 吴士良, 徐岚, 刘春亮 申请人:苏州市中医院