一种基于基因修饰的复合多孔骨支架及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于基因修饰的复合多孔骨支架及其制备方法和应用，所述基于基因修饰的复合多孔骨支架包括复合多孔骨支架以及分散在所述复合多孔骨支架中的重组慢病毒颗粒，其中，所述重组慢病毒颗粒含有编码骨生长因子的基因，本发明提供了的基因修饰的复合多孔骨支架具有优异的生物相容性和可降解性，可在原位较长时间表达骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影响，从而有效促进细胞向骨缺损部位迁移，达到骨修复的目的。
【专利说明】
一种基于基因修饰的复合多孔骨支架及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学组织工程【技术领域】，尤其涉及一种基于基因修饰的复合多孔骨支架及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]疾病、创伤、感染、骨坏死、先天性畸形、骨肿瘤等原因造成的骨缺损尤其是临界性骨缺损的修复和功能重建一直是骨科临床的难题之一。骨缺损治疗传统的生物治疗方法包括自体骨移植和异体骨移植。自体骨移植通常被看做是治疗骨缺损的“黄金法则”，但是其应用因供体有限，取材困难及易引起感染、出血、神经损伤、功能缺失等问题而受到很大的限制；异体骨移植虽然不受数量来源限制，但异体骨容易引起排斥反应，通过加工处理可降低异体骨的排斥反应，但其自身成骨诱导和骨生成作用已遭到破坏，存在新骨替代缓慢，生物力学性能较差等问题，进而影响治疗效果。骨组织工程技术克服了传统骨缺损移植技术的缺点，是目前再生医学领域的一个研究热点。
[0003]目前，传统方法所构建骨组织工程支架由于缺乏骨诱导和骨传导等特性，不能很好地起到修复骨组织的目的。为了提高骨的再生能力，通常将许多生长因子、细胞因子、趋化因子等具有生物活性的蛋白被加入到支架中，利用骨组织工程技术构建含有促进骨再生的活性蛋白成分的复合支架，来达到骨组织再生的目的。但是，在支架的制备过程中，把生长因子、细胞因子等具有生物活性的蛋白成分直接加入到制备骨支架所需要采用的有机溶剂中，会造成蛋白活性功能降低或丧失；其次，活性蛋白在支架中的半衰期较短，移植体内环境会快速的被降解失活。
[0004]因此，有必要提供一种能有效提高骨的再生能力的骨组织工程支架。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种基于基因修饰的复合多孔骨支架及其制备方法和应用，该基因修饰的复合多孔骨支架具有优异的生物相容性和可降解性，可在原位较长时间表达骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影响，从而有效促进细胞向骨缺损部位迁移，达到骨修复的目的。
[0006]第一方面，本发明提供了一种基于基因修饰的复合多孔骨支架，所述基于基因修饰的复合多孔骨支架包括复合多孔骨支架以及分散在所述复合多孔骨支架中的重组慢病毒颗粒，其中，所述重组慢病毒颗粒含有编码骨生长因子的基因。
[0007]在本发明一实施例中，所述骨生长因子为转化生长因子家族(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)中的至少一种。
[0008]在本发明一优选实施例中，所述骨生长因子为BMP、TGF-13, bFGF、PDGF-BB, VEGF或 IGF。
[0009]在本发明一实施例中，所述重组慢病毒颗粒分散的方式为所述重组慢病毒颗粒通过物理吸附作用吸附在所述复合多孔骨支架的孔壁上。
[0010]在本发明一实施例中，所述重组慢病毒颗粒分散的方式为所述重组慢病毒颗粒通过多孔性骨支架的孔洞或微孔空间限制作用分布在孔洞或微孔中。
[0011]在本发明一实施例中，所述重组慢病毒颗粒均匀分散在所述复合多孔骨支架中。
[0012]在本发明一实施例中，所述重组慢病毒颗粒采用第三代慢病毒表达质粒载体制备，所述第三代慢病毒表达质粒载体包括但不限于pLenti6/5V-DEST。
[0013]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架为可降解聚合物与含有钙磷的工程材料的复合多孔骨支架，其中，所述含有钙磷的工程材料包括但不限于磷酸三钙或磷酸钙。
[0014]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架为可降解聚合物与羟基磷灰石的复合多孔骨支架。
[0015]在本发明一优选实施例中，所述可降解聚合物选自聚3-羟基丁酸酯(PHB)、3-羟基丁酸-3羟基戊酸共聚酯(PHBV)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)和聚乙醇酸(PGA)中的至少一种。
[0016]在本发明一优选实施例中，所述可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比为1.5 ?8:1。
[0017]更优选地，在本发明一实施例中，所述可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比为2?3:1。
[0018]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架为聚羟基丁酸羟基己酸酯/羟基磷灰石(PHBHHx/HAp)复合多孔骨支架。
[0019]如本发明所述的，“/”仅表示“与、和”的意思，为行业内常用表达方式，并不限定本发明复合多孔骨支架的组分或结构。
[0020]在本发明一优选实施例中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和所述羟基磷灰石的质量比为1.5?8:1。
[0021]更优选地，在本发明一实施例中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和所述羟基磷灰石的质量比为2?3:1。
[0022]在本发明一优选实施例中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯的平均质量Mn为5万?80万，聚合度为300?40000。
[0023]本发明采用的可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比优选为2?3:1，可降解聚合物占比过高，羟基磷灰石的占比变低，制备出来的支架强度不够高；反之，可降解聚合物占比过低，羟基磷灰石的占比变高，制备出来的支架降解太快；比如，发明人发现，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和羟基磷灰石的质量比为1:1的时候，制备出来的支架强度不够。
[0024]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，孔洞的连通率大于97%。
[0025]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，所述孔洞的孔径为100?500微米。
[0026]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，所述孔洞的孔壁上形成有多个微孔，所述微孔的孔径为5?100微米，孔深I?50微米，
[0027]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，所述多孔性骨支架的孔隙率为80?95%。
[0028]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架为长方体、圆柱体、正方体或横截面为菱形的柱体，但不限于此。
[0029]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架的大小为O?2.5)mm,但不限于此，本领域技术人员可根据具体细胞培养条件选择并制备合适的相应大小的复合多孔骨支架。
[0030]本发明提供的基于基因修饰的复合多孔骨支架具有优异的生物相容性和可降解性，可在原位较长时间表达骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影响，从而有效促进细胞向骨缺损部位迁移，达到骨修复的目的。
[0031]第二方面，本发明提供了一种基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，包括如下步骤:
[0032]I)提供或制备复合多孔骨支架、重组慢病毒颗粒；
[0033]2)按照如下操作的任意一种将所述重组慢病毒颗粒均匀负载在所述复合多孔骨支架中，得到基于基因修饰的复合多孔骨支架:
[0034]a)将所述含有重组慢病毒颗粒的溶液滴加到所述复合多孔骨支架上，将所述滴加了液体的复合多孔骨支架置于-50?-20°C下孵育15?30min，得到所述基于基因修饰的复合多孔骨支架；
[0035]b)使用电喷图设备，在电场力作用下将含有重组慢病毒颗粒的溶液沉积在所述复合多孔骨支架的表面及内部孔洞中，得到所述基于基因修饰的复合多孔骨支架；
[0036]其中，所述基于基因修饰的复合多孔骨支架包括复合多孔骨支架以及分散在所述复合多孔骨支架中的重组慢病毒颗粒，其中，所述重组慢病毒颗粒含有编码骨生长因子的基因。
[0037]在本发明一实施例中，所述步骤(2a)中，将所述含有重组慢病毒颗粒的溶液滴加到所述复合多孔骨支架上后，再渗透30?60分钟，然后再置于-50?-20°C下孵育15?30mino
[0038]在本发明一优选实施例中，所述步骤(2a)中，所述渗透30?60分钟后的方法包括:真空条件下，将所述滴加了液体的复合多孔骨支架静置30?60分钟，或真空条件下，将所述滴加了液体的复合多孔骨支架置于器皿中翻转使得含有重组慢病毒颗粒的溶液充分流入、渗入支架孔洞中。
[0039]在本发明一实施例中，所述步骤(2a)中，采用真空低温冷冻设备对所述滴加了液体的复合多孔骨支架进行孵育。
[0040]本发明采用真空低温冷冻设备中对滴加了液体的复合多孔骨支架进行共孵育，便于含有骨生长因子的慢病毒与PHBHHx/HAp支架进行充分的吸附结合。
[0041]本发明在步骤(2b)中采用电喷图设备，利用液体在电场力作用下形成大颈缩比的稳定射流和纳米级雾化沉积滴，从而将慢病毒颗粒可控沉积在复合多孔骨支架的表面及内部孔洞中。
[0042]在本发明一实施例中，所述步骤(2b)中，所述电喷图设备沉积的功率为2.4X 16 ?1.76X 107kw
[0043]在本发明一实施例中，所述步骤(2b)中，所述电喷图设备沉积的速度为0.1?100 μ L/min。
[0044]在本发明一实施例中，所述步骤(2b)中，所述电喷图设备沉积的流量为2.0X10—11 ?3.810_nm3/s。
[0045]在本发明一优选实施例中，所述含有重组慢病毒颗粒的溶液中，病毒滴度为1.0X106?1.85X 108TU/ml，但不限于此，本领域技术人员当然可以使用更高滴度的病毒液，以达到更好的效果。
[0046]在本发明一实施例中，若无特殊说明，所述步骤(2a)或(2b)的操作为在低温进行。
[0047]在本发明一优选实施例中，若无特殊说明，所述步骤(2a)或(2b)的操作为在4?10°c下进行。在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述骨生长因子为转化生长因子家族(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)中的至少一种。
[0048]在本发明一优选实施例中，所述步骤⑵中，所述骨生长因子为BMP、TGF-13、bFGF、PDGF-BB、VEGF 和 IGF 中的至少一种。
[0049]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述重组慢病毒颗粒分散的方式为所述重组慢病毒颗粒通过物理吸附作用吸附在所述复合多孔骨支架的孔壁上。
[0050]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述重组慢病毒颗粒分散的方式为所述重组慢病毒颗粒通过多孔性骨支架的孔洞或微孔空间限制作用分布在孔洞或微孔中。
[0051]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述重组慢病毒颗粒均匀分散在所述复合多孔骨支架中。
[0052]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述重组慢病毒颗粒采用第三代慢病毒表达质粒载体制备，所述第三代慢病毒表达质粒载体包括但不限于pLenti6/5V-DEST。
[0053]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架为可降解聚合物与含有钙磷的工程材料的复合多孔骨支架，其中，所述含有钙磷的工程材料包括但不限于磷酸三钙或磷酸钙。
[0054]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架为可降解聚合物与羟基磷灰石的复合多孔骨支架。
[0055]在本发明一优选实施例中，所述步骤(2)中，所述可降解聚合物选自聚3-羟基丁酸酯(PHB)、3_羟基丁酸-3羟基戊酸共聚酯(PHBV)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)和聚乙醇酸(PGA)中的至少一种。
[0056]在本发明一优选实施例中，所述可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比为1.5 ?8:1。
[0057]更优选地，在本发明一实施例中，所述可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比为2?3:1。
[0058]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架为聚羟基丁酸羟基己酸酯/羟基磷灰石(PHBHHx/HAp)复合多孔骨支架。
[0059]在本发明一优选实施例中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和所述羟基磷灰石的质量比为1.5?8:1。
[0060]更优选地，在本发明一实施例中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和所述羟基磷灰石的质量比为2?3:1。[0061 ] 在本发明一优选实施例中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯的平均质量Mn为5万?80万，聚合度为300?40000。
[0062]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，孔洞的连通率大于97%。
[0063]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，所述孔洞的孔径为100?500微米。
[0064]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，所述孔洞的孔壁上形成有多个微孔，所述微孔的孔径为5?100微米，孔深I?50微米，
[0065]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架具有多个孔洞，所述多孔性骨支架的孔隙率为80?95%。
[0066]在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述复合多孔骨支架为长方体、圆柱体、正方体或横截面为菱形的柱体，但不限于此。
[0067]在本发明一实施例中，所述复合多孔骨支架的大小为O?2.5)mm,但不限于此，本领域技术人员可根据具体细胞培养条件选择并制备合适的相应大小的复合多孔骨支架。
[0068]在本发明一优选实施例中，所述步骤(I)中，所述复合多孔骨支架为聚羟基丁酸羟基己酸酯/羟基磷灰石(PHBHHx/HAp)复合多孔骨支架，所述PHBHHx/HAp复合多孔骨支架由如下方法制得:
[0069](01)将聚羟基丁酸羟基己酸酯溶解在第一有机溶剂中，得到聚羟基丁酸羟基己酸酯溶液，其中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和第一有机溶剂的质量体积比为1:10?15 ；
[0070](02)将直径为200?400nm的羟基磷灰石加入到步骤(01)的聚羟基丁酸羟基己酸酯溶液中，得到混合溶液，所述混合溶液中，所述聚羟基丁酸羟基己酸酯和羟基磷灰石的质量比为1.5?8:1 ；
[0071](03)将步骤(02)所得的混合溶液加入3D打印设备中打印成型，得到复合骨支架，将所得复合骨支架放入-20?-40°C下6?10小时后，转移到真空低温冷冻干燥装置中，在-20?50°C下干燥3?5天，得到所述PHBHHx/HAp复合多孔骨支架。
[0072]在本发明上述优选实施例中，所述步骤(01)中，所述第一有机溶剂优选为三氯甲烷，但不限于此。
[0073]本发明提供的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，从基因水平出发，采用重组慢病毒颗粒修饰复合多孔骨支架，并可根据骨再生需要可较长时间原位表达骨再生生长因子，促进成骨前体细胞或干细胞等细胞定向成骨分化，从而实现骨再生的目的，进而有效地解决了传统支架制备方法制备的骨支架的活性蛋白功能降低和半衰期较短的问题；此外，本发明提供的制备方法采用的复合多孔骨支架具有优异的生物相容性和可降解性。
[0074]本发明提供的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法成本低廉，在患者承受范围之内，可以在临床中广泛使用。
[0075]第三方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架或如第二方面所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法在制备骨修复材料中的应用。
[0076]本发明的有益.效果
[0077]本发明提供的基于基因修饰的复合多孔骨支架具有优异的生物相容性和可降解性，可在原位较长时间表达骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影响，从而有效促进细胞向骨缺损部位迁移，达到骨修复的目的。本发明提供的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法成本低廉，可以在临床中广泛使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0078]图1是本发明实施例1提供的制备PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的流程图。
[0079]图2为本发明实施例3提供的制备基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的流程图。
[0080]图3为本发明实施例3提供的荧光显微镜观察结果。
[0081]图4为细胞迁移数结果。
[0082]图5为病毒从支架上的释放效率结果。
【具体实施方式】
[0083]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当指出，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0084]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0085]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (Sambrook, J., Russell, David W.，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edit1n, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0086]若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品。
[0087]实施例1
[0088]图1为种制备PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的方法的流程图，结合图1，本发明实施例提供了一种制备PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的方法，包括如下步骤:
[0089]步骤(I):以聚羟基丁酸羟基己酸酯为原料即PHBHHx (平均质量Mn = 30万，平均聚合度为15000)，用三氯甲烷做溶剂，制备聚羟基丁酸羟基己酸酯溶液，其中聚羟基丁酸羟基己酸酯与三氯甲烷的质量体积(w/v)比为1:10，在50°C条件下磁力搅拌回流2h，使聚羟基丁酸羟基己酸酯材料完全溶解在三氯甲烷中，形成均匀的溶液；
[0090]步骤(2):将直径为200nm的羟基磷灰石颗粒即HAp，加入到(I)所形成的溶液中，其中聚羟基丁酸羟基己酸酯溶液与羟基磷灰石颗的质量比(w/w)为1:4，37°C条件下磁力搅拌2h形成均匀的溶液；
[0091]步骤(3):将步骤(2)中的混合溶液加入3D打印设备中，在预先设定的成型支架的参数下进行三维支架的构建，得到PHBHHx/HAp复合多孔骨支架；
[0092]步骤(4):将3D打印的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架放入_40°C低温冰箱8h，然后迅速转移支架到真空低温冷冻干燥装置中，进行一周的真空干燥，以便三维支架中的三氯甲烷充分挥发；然后进行无菌消毒处理(即采用75%酒精浸泡30min，紫外照射2.5h)，得到所述PHBHHx/HAp复合多孔骨支架(即图1中的PHBHHx/HAp复合多孔支架)，所述PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的孔隙率为80?95%，孔洞的孔径为100?500微米。
[0093]实施例2
[0094]本发明实施例提供了一种克隆重组慢病毒颗粒的制备方法，包括如下步骤:
[0095]步骤(I):按照分子生物学的方法和步骤，将血小板衍性生长因子BB(PDGF-BB)基因序列，克隆到含有绿色荧光蛋白(在本发明其他实施例中，可以采用红色荧光蛋白)作为报告基因的第三代慢病毒表达载体上，随后进行克隆子的测序筛选，得到含有正确PDGF-BB基因序列的表达载体，其中，所述第三代慢病毒表达载体为pLenti6/5V-DEST，所述TOGF-BB基因序列的Genebank登录号为NM_011057.3，所述TOGF-BB基因插入病毒载体的Spe I和Sal I位点；
[0096]步骤(2):按照标准的磷酸钙转染法包装所述含有TOGF-BB的表达载体，得到所述重组慢病毒颗粒，方法如下:
[0097]1.在转染的前一天，在1cm的细胞培养皿中接种293FT细胞，其密度为8 X 15
[0098]2.在转染的前三个小时，所有的细胞培养皿换成新鲜的培养基
[0099]3.37°C条件下，溶解所有的转染试剂，并混合转染试剂和质粒DNA，准备转染复合物，室温静置30分钟(辅助质粒:pLPl，pLP2, pVSV-G)
[0100]4.每一个1cm培养皿中加入Iml转染复合物，在37°C，5%C02条件下培养48-72h
[0101]5.收集上清，25000rpm离心2h，获得慢病毒颗粒。
[0102]步骤(3):对所述重组慢病毒颗粒进行效价滴度测定，滴度为1.85 X 108TU/ml。
[0103]实施例3
[0104]结合图2，本发明实施例提供了一种基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的制备方法，包括如下步骤:
[0105]步骤(I):在4°C条件下，将实施例2制备的重组慢病毒颗粒按体积比为1:5?10的比例溶解在磷酸盐缓冲液，得到重组慢病毒颗粒溶液(在本发明其他实施例中，可以采用H-DMEM培养基，或其它不影响慢病毒颗粒活性的溶液)；
[0106]在4°C条件下，将所述重组慢病毒颗粒溶液滴加在实施例1制备的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架上，等支架表面上的液滴充分被吸收后(约放30分钟?60分钟)，置于真空低温冷冻设备中共孵育30min，利用羟基磷灰石本身特性使重组慢病毒颗粒与PHBHHx/HAp复合多孔骨支架进行充分的吸附结合；
[0107]步骤(2):用磷酸盐缓冲液冲洗步骤(I)中负载重组慢病毒颗粒的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架，以便除去多余的没有结合到支架上的重组慢病毒颗粒，得到所述。
[0108]图2为本发明实施例3的流程示意图，图2A?E分别表基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架示:
[0109]A:PHBHHx/HAp复合多孔骨支架；B:重组慢病毒颗粒；C:PHBHHx/HAp复合多孔骨支架负载重组慢病毒颗粒；D:低温冷冻干燥重组慢病毒颗粒-支架复合体；E:基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架。
[0110]为充分说明本发明的有效效果，验证基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架上的慢病毒转染细胞的能力，本发明实施例还提供了效果实施例，包括如下步骤:将HEK-293T和Raw264.7细胞分别接种到实施例3制备的基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架上，在48h和72h可以分别观察到绿色荧光在细胞内的表达。
[0111]图3为荧光显微镜观察结果，Raw264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)和HEK-293T(人源胚胎的肾细胞)细胞转染的结果分别如图3(A)和图3(B)所示。由图3可知，本发明提供的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架可以转染Raw264.7和HEK-293T细胞，并在较长时间内表达骨再生生长因子，且所标的的骨再生生长因子能维持在一定的浓度范围，有效延长了活性蛋白的半衰期。
[0112]细胞迁移实验证明本发明提供的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架可以促进细胞迁移，具有成骨能力；其中，所述细胞迁移实验的步骤为:
[0113]1.取细胞培养板，设置阴性对照孔、阳性对照孔和实验组，其中，阴性对照孔只添加DMEM培养基，阳性对照孔添加DMEM培养基和10% FBS,实验组添加DMEM培养基以及负载慢病毒的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架(按实施例3方法制备，体积为每孔添加1个支架)，分别接种MSCs (间充质干细胞)，密度为5X 105个/mL。
[0114]2.培养48h后，把PHBHHx/HAp复合多孔骨支架移到迁移小室下方，迁移小室上方接种MSCs，密度为5父104个/11^，在371:，5% C02条件下培养72h。
[0115]3.利用流式细胞术来计数细胞从迁移小室上方迁移到下方的数量。
[0116]结果如图4所示，纵坐标为细胞迁移数的相对值，柱-1、柱-2和柱-3分别表示DMEM对照组、DMEM-10% FBS对照组、以及LV-PHBHHx/HAp复合多孔骨支架实验组，由于FBS中有一定量的生长因子，因此，DMEM-10% FBS对照组的细胞迁移数高于DMEM对照组，而LV-PHBHHx/HAp复合多孔骨支架实验组的细胞迁移数最高，说明本发明提供的基因修饰的复合多孔骨支架能促进细胞迁移。
[0117]实施例4
[0118]本发明实施例提供了一种基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架的制备方法，包括如下步骤:
[0119]步骤(1):在4°C条件下，将实施例2制备的重组慢病毒颗粒按体积比为1:5?10比例溶解在磷酸盐缓冲液(在本发明其他实施例中，可以采用Η-DMEM培养基，或其它不影响慢病毒颗粒活性的溶液)；
[0120]步骤(2)使用电喷图设备，利用液体在电场力作用下形成大颈缩比的稳定射流和纳米级雾化沉积滴(所述电喷图设备沉积的功率为2.4X 106kw，所述电喷图设备沉积的速度为0.1 μ L/min，所述电喷图设备沉积的流量为2.0X 10-nm3/s)，从而将慢病毒颗粒可控沉积在实施例1制备的无菌PHBHHx/HAp支架表面及其内部，得到所述基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架。
[0121]步骤(3):将HEK-293T和Raw264.7细胞分别接种到步骤⑵所制备的基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架上，在48h和72h可以分别观察到绿色荧光在细胞内的表达。
[0122]由实施例3和4可知，本发明实施例提供的方法所制备的的含有生长因子基因修饰的PHBHHx/HAp支架，不仅具有良好的生物相容性和机械性能，而且可以有效缓释生长因子TOGF-BB的长期释放，诱导体内局部或全身性的成骨前体细胞或干细胞向骨组织受损部位的迁移，从而促进成骨前体细胞或干细胞在骨缺损处向成骨细胞的定向分化，从而达到修复骨缺损的目的。
[0123]为充分说明本发明的有益效果，本发明还提供了对比实施例，本对比实施例采用侵泡的方法2.将制备好的多孔支架浸泡在慢病毒溶液中，并检测病毒从支架上的释放效率步骤如下:
[0124]1.多孔支架的制备如前所述
[0125]2.将制备好的多孔支架浸泡在慢病毒溶液中，孵育30?60min
[0126]3.用PBS缓冲液洗涤支架三次，去除未结合的病毒
[0127]4.将支架和293T细胞共培养72h
[0128]5.利用流式细胞术检测慢病毒的释放数目。
[0129]此外，本发明还对实施例3提供的基因修饰的PHBHHx/HAp复合多孔骨支架进行检测:其病毒从支架上的释放效率如图5所示。在图5中，浸泡方法的实验组(对比实施例所制备的侵泡法所得支架)和冷冻干燥方法的实验组(实施例3所制备的复合多孔骨支架)的慢病毒释放数目差异较大，实施例3所制备的复合多孔骨支架的慢病毒释放数目大，说明本发明提供的基因修饰的复合多孔骨支架慢病毒释放效率较高。
[0130]对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种基于基因修饰的复合多孔骨支架，其特征在于，所述基于基因修饰的复合多孔骨支架包括复合多孔骨支架以及分散在所述复合多孔骨支架中的重组慢病毒颗粒，其中，所述重组慢病毒颗粒含有编码骨生长因子的基因。
2.如权利要求1所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架，其特征在于，所述骨生长因子为转化生长因子家族(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)中的至少一种。
3.如权利要求1所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架，其特征在于，所述复合多孔骨支架为可降解聚合物与含有钙磷的工程材料的复合多孔骨支架，其中，所述含有钙磷的工程材料为磷酸三钙、磷酸钙或羟基磷灰石。
4.如权利要求3所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架，其特征在于，所述可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比为1.5?8:1。
5.一种基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)提供或制备复合多孔骨支架、重组慢病毒颗粒； 2)按照如下操作的任意一种将所述重组慢病毒颗粒均匀负载在所述复合多孔骨支架中，得到所述基于基因修饰的复合多孔骨支架: a)将含有所述重组慢病毒颗粒的溶液滴加到所述复合多孔骨支架上，将所述滴加了液体的复合多孔骨支架置于-50?-20°C下孵育15?30min，得到所述基于基因修饰的复合多孔骨支架； b)使用电喷图设备，在电场力作用下将含有重组慢病毒颗粒的溶液沉积在所述复合多孔骨支架的表面及内部孔洞中，得到所述基于基因修饰的复合多孔骨支架； 其中，所述基于基因修饰的复合多孔骨支架包括复合多孔骨支架以及分散在所述复合多孔骨支架中的重组慢病毒颗粒，其中，所述重组慢病毒颗粒含有编码骨生长因子的基因。
6.如权利要求5所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，所述骨生长因子为转化生长因子家族(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)中的至少一种。
7.如权利要求5所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，其特征在于，所述复合多孔骨支架为可降解聚合物与含有钙磷的工程材料的复合多孔骨支架，其中，所述含有钙磷的工程材料为磷酸三钙、磷酸钙或羟基磷灰石。
8.如权利要求7所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，其特征在于，所述可降解聚合物和所述羟基磷灰石的质量比为1.5?8:1。
9.如权利要求5所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法，其特征在于，所述电喷图设备进行沉积的速度为0.1?lOOyL/min，沉积的流量为2.0X10_n?3.8Xl(TV/s。
10.一种如权利要求1所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架或如权利要求5所述的基于基因修饰的复合多孔骨支架的制备方法在制备骨修复材料中的应用。
【文档编号】A61L27/54GK104383603SQ201410647550
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】任培根, 李健, 滕斌 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院