一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用，该自组装短肽命名为GFS-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。实验表明，本发明所述自组装短肽能够自组装形成纳米纤维支架，支撑多种细胞生长，可以在纳米生物医学领域，作为细胞三维培养的基质材料。
【专利说明】一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米生物医学领域，具体是一种自组装短肽。
【背景技术】
[0002]分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下，能够进行自我组织，自我聚集形成一种规则的结构，即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。在最近的十几年里，分子自组装系统(如氨基酸)已经成为分子生物学、化学以及材料学等学科的交汇点，尤其是手性自组装短肽，已经发展成为了一类新兴的纳米生物材料。由它们构成的纳米纤维，作为细胞三维培养的基质材料，能模拟生物体内的三维基质微环境，具有高纯度、可降解及无免疫反应的突出优点，已被成功应用于细胞工程、组织工程及生物医学工程等领域。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种新型的自组装短肽，增加自组装短肽的种类，使之可在细胞三维培养中使用。
[0004]在手性自组装短肽的设计原则下，本发明采用全新理念设计新型自组装短肽，记为GFS-2，研究了浓度和离子对GFS-2自组装过程的影响、低浓度自组装短肽GFS-2对细胞膜的裂解作用、高浓度自组装短肽GFS-2形成的纳米纤维对细胞的活性的影响及细胞在该水凝胶中的生长、增殖情况等。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种自组装短肽，其氨基酸序列为SEQ ID N0.1，命名为GFS-2。其分子量为1783.06。其自组装原理是通过分子之间非共价键相互作用，形成结构明确且稳定，并具有某些理化性质的超分子结构或分子聚集体。
[0006]进一步，本发明还提供了自组装短肽在细胞三维培养中的应用。
[0007]更具体地，所述自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用。
[0008]实验表明，本发明所述短肽在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纳米纤维。
[0009]实验表明，本发明所述自组装短肽形成的纳米纤维，细胞能在其上进行三维黏附、生长，所以，此自组装短肽可应用到动、植物细胞三维培养中。
[0010]本发明具有以下有益效果:
1、提供了一种新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。
[0011]2、提供了一种新型的自组装纳米生物医学材料，这种新型生物医学材料能够广泛的应用到纳米生物医学工程、细胞工程及生物工程及等领域，并具有明显的经济及其社会效益。
[0012]3、提供了一种细胞三维培养纳米支架材料，可广泛应用于生物医学领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明所述L型氨基酸构成的自组装短肽GFS-2的分子结构示意图。
[0014]图2是本发明所述自组装短肽GFS-2高效液相(HPLC)色谱图。
[0015]图3是本发明所述自组装短肽GFS-2质谱(MS)图。
[0016]图4是本发明所述自组装短肽GFS-2的圆二色谱图，新型短肽GFS-2常温下的二级结构特征是在216nm处有一强负峰，在194nm处有一强正峰，峰形完好。
[0017]图5是本发明所述自组装短肽GFS-2的原子力显微图(AFM)，图中:A表示4h时短肽GFS-2自组装形成细而短的纳米纤维丝；B表示8h后纳米纤维的长度增加，数量增多，并开始聚集；C表示48h后的AFM照片表明，纳米纤维能完成自组装过程，形成三维的纳米纤维网络支架。
[0018]图6是本发明所述自组装短肽GFS-2形成水凝胶光学图片，刚果红染色，5mg/mL的短肽GFS-2盐离子溶液自组装24h(图6中A)后形成肉眼可见的透明胶状物质，形成松散的片层状薄膜；36h(图6中B)薄膜的厚度及大小都有所增加，但还是处于松散的状态；48h (图6中C)薄膜片层连接在一起，形成整个一层较为致密的膜片；72h(图6中D)该膜片没有明显的变化。
[0019]图7是本发明所述自组装短肽GFS-2的红细胞裂解实验数据图。
[0020]图8是用本发明所述自组装短肽GFS-2三维培养细胞，细胞ECA109 (图8中A为20倍镜；图8中B为40倍镜)和MDA-231 (图8中C为20倍镜；图8中D为40倍镜)都可以该三维体系中可以生长，细胞圆球形，边界清楚，调节显微镜能看到模糊的细胞核界限，连续培养7d,细胞仍可以在本发明所述自组装短肽GFS-2形成的三维支架材料中生长。
【具体实施方式】
[0021 ] 实施例1:由L-氨基酸构成的自组装短肽GFS-2的制备
1、材料
Fmoc-L-Ala-OH (9-荷甲氧羰酰基-L-丙氨酸)、Fmoc-L-Leu-OH (9-荷甲氧羰酰基-L-亮氨酸)、Fmoc-L-Val-OH (9-荷甲氧羰酰基-L-纟颜氨酸)>Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH (荷甲氧羰酰基L-天冬氨酸-ε -叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Glu (OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸- ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Lys (Boc) -OH (9_荷甲氧羰酰基-L-赖氨酸-ε -叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Arg (pbf) -OH (9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-Y -叔丁氧羰酰基)、HBTU (O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1_羟基苯并三氮唑);哌啶，乙酸酐，溶剂:DMF (N、N-二甲基甲酰胺)、TFA (三氟乙酸)、DCM (二氯甲烷)、NMM (N-甲基吗啉)。
[0022]2、合成方法
称取0.5mmol/g树脂20g于肽合成器中，用DCM浸泡树脂5_10分钟后，再用400mlDMF清洗树脂5次，每次清洗时间为3min，抽滤干洗涤液。经过10-20分钟用20%的六氢吡啶脱保护后，400mlDMF清洗树脂5次，每次清洗3min，抽滤干洗涤液。然后向反应器中加入原料(氨基酸，缩合剂等)缩合反应30分钟，用DMF清洗5次，每次清洗3min，抽滤出洗涤液。按上述方式再进行保护一清洗一缩合一清洗一保护一清洗一抽干，TFA切割，乙醚沉淀切割液，清洗2-3次后，抽干，得到粗肽。HPLC纯化后，冷冻干燥，即得本发明所述的自组装短肽GFS-2，其氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0023]3、纯化步骤
(O首先将上述得到的粗肽进行样品的10-100%分析，在确定出主峰的保留时间后，线性梯度分析样品；
(2)去离子水和乙腈(4:1)能够较充分的溶解试样品多肽；
(3)200mg多肽置于1ml的溶解瓶中，加入去离子水,经过超声溶解后,用0.45 μ m的有机相滤头过滤，取上清液；
(4)收峰由线性梯度制备，并确定MS是否正确；
(5)为了符合纯度要求的液体量，要对所收的液体进行纯度的跟踪反馈；
(6)在40°C下，把所收集合格的溶液浓缩至40-50ml；
(7)浓缩好的溶液置于10ml烧杯中，放置于冰柜中冷冻；
(8)干燥;
(9)称量；
(10)反打；
(11)包装。
[0024]实施例2:短肽GFS-2的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制
对实施例1制备的短肽GFS-2采用普通画图软件(Hyperchem 7.5, www.hyper, com)绘制得到分子结构示意图，见图1，由图可看出氨基酸的空间分布。
[0025]将实施例1制备的短肽GFS-2利用高效液相色谱(HPLC)检测，参见图2，由图2中的谱峰面积可计算其纯度已达到95%。将实施例1制备的短肽GFS-2采用质谱(MS)检测，参见图3，说明其分子量为1783.06是正确的。
[0026]实施例3:自组装短肽GFS-2的圆二色性检测和原子力显微镜(AFM)检测
用去离子水配制100 μ M短肽GFS-2溶液，圆二色谱仪(AVIV 400⑶spectrometer)对短肽GFS-2进行⑶检测，参数设置:扫描波长为190-260nm，光径为2mm。本发明短肽GFS-2常温下的二级结构特征是在216nm处有一强负峰，在194nm处有一强正峰，峰形完好(见图4)。这一结果表明，新型短肽GFS-2具有稳定的β-sheet 二级结构，在特定的条件下发生自组装，形成纳米纤维。
[0027]用生理盐水配制500 μ M的短肽GFS-2溶液，在室温下让短肽自组装48小时，分别在4、8和48h时制作样本。在新撕开的云母片上滴加10 μ I短肽溶液，静置60s，再用Iml去离子水冲洗3次，吸干云母片上的水分，将含有检测样品的云母片置于超净的工作台上，自然晾干后，用原子力显微镜观察，扫描模式为敲打模式。4h时短肽GFS-2自组装形成细而短的纳米纤维丝；8h后纳米纤维的长度增加，数量增多，并开始聚集；48h后的AFM照片表明，纳米纤维能完成自组装过程，形成三维的纳米纤维网络支架(见图5)。
[0028]实施例4:用短肽GFS-2的刚果红染色实验及自组装形态和效果
用生理盐水配制5mg/ml短肽GFS-2溶液，在25°C下孵育24到72小时。取10 μ I水凝胶涂抹在载玻片上，用刚果红液染色30s，在光镜下观察(结果见图6)。5mg/mL的短肽GFS-2盐离子溶液自组装24小时后形成肉眼可见的透明胶状物质，形成松散的片层状薄膜；36h薄膜的厚度及大小都有所增加，但还是处于松散的状态；48h薄膜片层连接在一起，形成整个一层较为致密的膜片；72h该膜片没有明显的变化。72h后自组装短肽GFS-2形成的水凝胶含水量可高达99%，成透明状的胶体，离心管倒置后，该凝胶不会下滑。
[0029]实施例5:用自组装短肽GFS-2对细胞裂解实验
(O分别用生理盐水和去离子水配制不同浓度(1、10、100μ g/ml)的短肽溶液。
[0030](2)取Sprague Dawleg (SD)大鼠(200_250g，雌雄随机，重庆医科大学动物中心提供，手术过程遵守动物实验国家标准)新鲜冻存血液(EDTA抗凝)，1500r离心20min，将白细胞层及其血浆层全部移除，用生理盐水洗2-3次，取红细胞4滴，加入10ml生理盐水中，配制成4%红细胞溶液(RBC)。
[0031](3)取100 μ I短肽溶液和400 μ 1RBC，400 μ I生理盐水，加入离心管中，在37°C条件下孵化I小时后，5000r离心15min，取上清液。
[0032](4)用分光光度计在570nm波长下检测吸光度。
[0033](5)阳性对照组加入红细胞裂解液，阴性对照组加入生理盐水。
[0034]数据表明，3种不同浓度的短肽溶液对红细胞的裂解度相近，与阳性对照组比较相差0.340左右，与阴性对照组相差0.015左右，且裂解度都不超过0.060 (〈0.100)(见图7)。这一结果说明3种不同浓度的短肽GFS-2溶液对细胞膜都不具有裂解作用，且自组装24h以后的短肽溶液与未组装前对细胞膜的作用相似。
[0035]实施例6:用短肽GFS-2对细胞三维培养
分别配制所需浓度的自组装短肽溶液与ECA109和MDA-231细胞(重庆医科大学分子与肿瘤医学实验室赠送)悬液，取等体积的短肽溶液、细胞悬液混合均匀，按照每孔50μ I的方式滴加到96孔板中，静置lOmin，再加入培养基连续培养I周。细胞增殖实验用CCK-8检测，采用酶标仪测试。
[0036]细胞三维培养的操作如下:
(1)将实施I制备的自组装短肽GFS-2配制成各浓度溶液(2.5,3.5,4.5,5.5,6.5、7.5mg/ml)，取适量(100-300 μ I)移入离心管中备用；
(2)培养好的ECA109和MDA-231细胞分别用0.25%胰酶消化，再移入离心管中，1000rmp/min离心沉淀细胞lOmin，弃上清液，加入蔗糖溶液(质量浓度为20%)记数到细胞5X 15个/ml，分别取300 μ I备用；
(3)在离心管中快速混合(I)和(2)中的溶液，得短肽和细胞的混合液；
(4)取(3)中的混合液50μ I滴加到96孔板中；
(5)滴加RPM1-1640完全培养基20μ 1，自组装5 — 1min ；
(6)滴加RPM1-1640完全培养基150μ I，放在细胞培养箱培养30 — 60min ；
(7)取出一半的细胞培养孔板液体，加入等体积的新鲜的RPM1-1640的完全培养基，换液完毕后，置于细胞培养箱继续培养2-5天。
[0037]经典二维细胞培养作为阴性对照，倒置显微镜显示ECA109和MDA-231细胞呈不规则形态，边界清晰，外观近似梭形。运用GFS-2自组装形成的纳米纤维作为三维支架材料培养细胞，发现细胞ECA109和MDA-231都可以在该三维体系中生长，细胞圆球形，边界清楚，调节显微镜能看到模糊的细胞核界限(见图8)。当短肽GFS-2浓度为5.5mg/mL时，ECA109和MDA-231细胞24-72h时生长较缓慢，72h后细胞增长加快；在GFS-2三维支架中，两种细胞初期的生长速度不及正常二维细胞培养组(阴性对照)。连续培养7d，仍可见细胞在GFS-2形成的三维支架材料中生长，且形态良好(见图8)。该结果表明ECA109和MDA-231细胞可在GFS-2形成的三维支架中生长，且生长形态良好。
【权利要求】
1.一种自组装短肽，其特征在于:其氨基酸序列为SEQ ID N0.1。
2.根据权利要求1所述一种自组装短肽，其特征在于:所述自组装短肽的分子量为1783.06。
3.权利要求1或2所述自组装短肽在细胞三维培养中的应用。
4.权利要求1或2所述自组装短肽在细胞三维培养中的应用，其特征在于:所述自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用。
5.根据权利要求3或4所述自组装短肽在细胞三维培养中的应用，其特征在于:所述细胞为动物细胞或植物细胞。
【文档编号】A61L27/38GK104497107SQ201410739523
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】罗忠礼, 岳媛媛, 陈振银, 李萌萌, 徐晓帆, 孙悦霖, 赵天鑫 申请人:重庆医科大学