共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途的制作方法与工艺

本文报告了包括helicar基序氨基酸序列和抗helicar抗体的(共价)复合物，其中，该helicar基序氨基酸序列存在于或缀合至有效载荷，其中，包含helicar基序氨基酸序列的元件和抗helicar抗体经由单键彼此共价连接。还报告了用于产生该共价复合物的方法及其用途。发明背景多肽的治疗性应用的主要瓶颈在于它们的有限溶解度、体内稳定性，短的血清半寿期和从血流中快速清除。已报告了用于解决这些缺点的不同方法。然而，这些技术中没有一个提供了允许药物代谢动力学(PK)调节而不会遇到免疫原性风险或生物活性的潜在损失的的健壮和通用的平台。改善治疗性多肽的PK/稳定性和生物物理特性的一种方法是将它们融合至稳定该多肽的实体、将其保存在溶液中并延长其半寿期。这类实体的例子是人血清白蛋白或人免疫球蛋白Fc区。该方法适用于由天然存在的氨基酸残基所组成并且容许在其C-末端或N-末端进行修饰而不丧失其生物学活性的许多线性多肽。那些环状的、装订的、包含非天然氨基酸残基或额外修饰的多肽不能作为融合多肽重组产生。然而，这类多肽对于治疗性应用来说可能是期望的选择，因为它们在蛋白酶稳定性、活性和特异性方面经常优于“普通的”线性肽。改善治疗性多肽的PK/稳定性和生物物理特性的一种方法(其也可以应用于那些环状的、装订的或包含非天然结构的治疗性多肽)是化学或酶促缀合至聚合物，例如，通过PEG化或HES化。然而，这类修饰经常导致多肽的生物学活性显著降低，并且在某些情况下，可能成为安全或毒性问题的原因。用于治疗性多肽的稳定化或PK调节的大多数现有化学偶联技术的主要缺点在于它们的复杂性。除化学偶联步骤之外，在许多情况下，这些方法产生多肽衍生物的混合物，这些多肽衍生物以不确定的化学计量和/或在不明确的位置连接至PK调节实体。此外，目前使用的多肽修饰技术常常导致治疗性多肽的生物学活性大大降低或甚至完全丧失。此外，难以预测化学缀合物的药理特性和/或可能的降解途径。Helicar元件由形成α螺旋的12聚体(mer)氨基酸肽构成。该肽的结构元件由Nygaard等人描述，还报告了抗helicar抗体，以及与12聚体肽的复合物结构，其是被称为GCN4的酵母亮氨酸拉链蛋白的一部分。抗体部分Fv已用噬菌体展示技术亲和力成熟至25pM的亲和力(Zahnd,C.等人,J.Biol.Chem.279(2004)18870-18877)。Metz,S.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)8194-8424)报告了双特异性的结合洋地黄毒苷的抗体，用于靶向递送有效载荷。Hoffmann,E.等人报告了经由非共价抗体复合进行半抗原化肽的PK调节(J.Contr.Rel.171(2013)48-56)。在WO2012/093068中，报告了抗dig抗体和缀合至肽的洋地黄毒苷的复合物的药物组合物。Zahnd,C.等人报告了具有低皮摩尔亲和力的结合肽的单链抗体片段(scFv)的体外定向进化和晶体分析(J.Biol.Chem.279(2004)18870-18877)。Hanes,J.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)14130-14135)报告了核糖体展示在体外从免疫文库中高效选择和进化高亲和力抗体。US5,804,371报告了半抗原标记的肽和它们在免疫学检测方法中的用途。DecarieA.等人(Peptides15(1994)511-518)报告了洋地黄毒苷标记的肽(缓激肽)及其在发炎组织中缓激肽的化学发光酶免疫测定中的应用。在WO2004/065569中报告了多功能抗体。在WO2014/006124中报告了共价半抗原-抗半抗原抗体复合物。发明概述已发现helicar介导的复合物形成可用于共价缀合这样的多肽，所述多肽在多肽序列的一个末端或在多肽序列内包含helicar基序氨基酸序列。在插入的情况下，12聚体helicar基序氨基酸序列被插入到多肽序列内，或者，现有的螺旋基序被修改以包括涉及抗helicar抗体识别的必需氨基酸。已发现通过将含有helicar基序氨基酸序列的化合物共价缀合至抗helicar抗体，可以实现该化合物的稳定化、PK性能的改善，或者，在双特异性抗体的情况下，可以实现附加额外的靶向。如本文所报告的一个方面是缀合物，其包括，含有helicar基序氨基酸序列的化合物，以及，与helicar基序氨基酸序列特异性结合的抗体，其特征在于所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物和抗helicar抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。已发现用helicar基序氨基酸序列衍生化时，任何化合物可以用于如本文所报告的缀合物和方法中，所述helicar基序氨基酸序列包含这样的功能性残基，所述功能性残基用于形成含有helicar基序氨基酸序列的化合物和抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键。官能团的位置在helicar基序氨基酸序列中具有下述优点：当改变helicar基序衍生化的化合物时，不必对抗体的CDR2中的官能团的合成及其位置进行再工程化。如本文所报告的一个方面是一种缀合物，其包括，含有helicar基序氨基酸序列的化合物，以及，与所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的helicar基序氨基酸序列特异性结合的抗体(抗helicar基序氨基酸序列抗体)，其特征在于所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物和所述抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。在一个实施方案中，所述CDR2是轻链CDR2。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列具有氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)或者是一个氨基酸残基被改变为半胱氨酸的其变体。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列具有氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)，其中3个C-末端氨基酸残基中的一个氨基酸残基被改变为半胱氨酸。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列具有氨基酸序列AHLENEVARCKK(SEQIDNO:02)或AHLENEVARLCK(SEQIDNO:03)。在一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物包括helicar基序氨基酸序列、任选地接头和有效载荷。在一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物是包含helicar基序氨基酸序列的多肽，所述helicar基序氨基酸序列融合至多肽的一个末端或在多肽序列内。在该实施方案中，所述有效载荷是多肽。如本文所报告的一个方面是一种缀合物，其包括i)包含helicar基序氨基酸序列的化合物，所述helicar基序氨基酸序列选自包括SEQIDNO:01、其中一个氨基酸残基已被改变为半胱氨酸的SEQIDNO:01的变体、SEQIDNO:02和SEQIDNO:03的组，和ii)与helicar基序氨基酸序列特异性结合的抗体，其中所述缀合物包含helicar基序氨基酸序列和抗helicar抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。在一个实施方案中，所述CDR2是轻链CDR2。在一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物包括helicar基序氨基酸序列、任选地接头和有效载荷。在所有方面的一个实施方案中，共价键在含有helicar基序氨基酸序列的化合物和抗体的CDR2中的氨基酸残基之间。在一个实施方案中，共价键在含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的官能团和抗体的CDR2中的氨基酸残基之间。在一个实施方案中，官能团在helicar基序氨基酸序列中。在一个实施方案中，共价键在抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基和含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的官能团之间。在一个实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置或第51位置处。在一个实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置处。在所有方面的一个实施方案中，共价键是二硫键。在所有方面的一个实施方案中，共价键是helicar基序氨基酸序列中的半胱氨酸残基和抗helicar抗体的轻链的CDR2中的半胱氨酸残基之间的二硫键。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列具有SEQIDNO:02的氨基酸序列。在所有方面的一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包括针对非helicar抗原的第一结合特异性和针对helicar基序氨基酸序列的第二结合特异性。在一个实施方案中，(非helicar)抗原是细胞表面抗原。在一个实施方案中，细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链包含孔穴突变(holemutation)并且相应的另一条链包含隆突突变(knobmutation)。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链包含突变T366S、L368A和Y407V并且相应的另一条链包含突变T366W。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链进一步包含突变S354C并且相应的另一条链包含突变Y349C。在一个实施方案中，双特异性抗体是这样的全长抗体，在其一个或两个重链C-末端已直接或经由肽接头融合有scFv或dsscFv或scFab或dsscFab或它们的组合。在一个实施方案中，双特异性抗体是全长抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链包含孔穴突变并且相应的另一条链包含隆突突变。在一个实施方案中，有效载荷选自结合部分、标记部分和生物活性部分。在一个实施方案中，该抗体是全长抗体。在一个实施方案中，该抗体是人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，该抗体的恒定区是IgG1亚类或IgG4亚类。在一个实施方案中，抗体具有IgG1亚类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，所述恒定区在第234和235位置处具有丙氨酸并且在第329位置处具有甘氨酸。在一个实施方案中，抗体具有IgG4类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，所述恒定区具有在第228位置处的脯氨酸、在第235位置处的谷氨酸和在第329位置处的甘氨酸。在一个实施方案中，该抗体是抗体片段。在一个实施方案中，该片段是Fab或(Fab)2。在所有方面的一个实施方案中，缀合物的每条轻链CDR2确切地包含一个共价键。在一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物包含这样的反应基团，所述反应基团可以与抗体的CDR2中的半胱氨酸残基的巯基形成共价键。在一个实施方案中，反应基团是巯基、或马来酰亚胺、或卤代乙酰基。在所有方面的一个实施方案中，共价键是二硫键。在一个实施方案中，该二硫键在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。在一个实施方案中，缀合物包含治疗部分或可检测部分。在一个实施方案中，将治疗部分或可检测部分共价缀合至helicar基序氨基酸序列或者将helicar基序氨基酸序列并入所述治疗部分或可检测部分。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列缀合至由5至500个氨基酸残基组成的多肽。在一个实施方案中，该多肽包含10至450个氨基酸残基。在一个实施方案中，该多肽包含12至450个氨基酸残基。在一个实施方案中，该多肽包含15至400个氨基酸残基。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列缀合至可检测标记物。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列经由接头缀合至多肽，或缀合至可检测标记物，或缀合至有效载荷。在一个实施方案中，接头是非肽接头。在一个实施方案中，接头是肽接头。如本文所报告的一个方面是抗helicar抗体，其在轻链中具有CDR2中的半胱氨酸残基，其中CDR根据Kabat来确定。在一个实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置或第51位置处。在一个实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置处。在一个实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体确切地在一个轻链可变结构域中第55位置处或第51位置处具有半胱氨酸残基。在所有方面的一个实施方案中，该抗体是人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗体是全长抗体、或Fab、或scFv、或与Fc区缀合的scFv。在一个实施方案中，半胱氨酸与孤立的半胱氨酸残基或孤立的同型半胱氨酸残基形成二硫键。如本文所报告的一个方面是一种免疫缀合物，其包含如本文所报告的缀合物，以及细胞毒性剂。如本文所报告的一个方面是一种药物制剂，其包含如本文所报告的缀合物，以及可药用载体。如本文所报告的缀合物，其用作药物。如本文所报告的缀合物，用于治疗癌症。如本文所报告的缀合物，其用于治疗糖尿病。如本文所报告的缀合物，其用于治疗肥胖症。如本文所报告的缀合物，其用于治疗炎性疾病。如本文所报告的缀合物，其用于治疗代谢性疾病。如本文所报告的缀合物，其用于治疗病毒性疾病。如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物在制造药物中的用途。如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物作为诊断剂的用途。如本文所报告的一个方面是包含治疗性多肽的如本文所报告的缀合物增加所述治疗性多肽的稳定性的用途。如本文所报告的一个方面是包含治疗性多肽的如本文所报告的缀合物增加所述治疗性多肽的活性的用途。如本文所报告的一个方面是包含治疗性多肽的如本文所报告的缀合物增加所述治疗性多肽的体内半寿期的用途。如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物在治疗疾病中的用途。如本文所报告的一个方面是一种治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文所报告的缀合物。如本文所报告的一个方面是一种治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文所报告的缀合物。在一个实施方案中，该疾病是癌症。在一个实施方案中，该疾病是糖尿病。在一个实施方案中，该疾病是肥胖症。如本文所报告的一个方面是一种产生如本文所报告的缀合物的方法，所述方法包括组合包含第一反应基团的抗helicar抗体和包含第二反应基团的含有helicar基序氨基酸序列的化合物，其中携带第一反应基团的氨基酸残基的α碳原子与含有helicar基序氨基酸序列的化合物的原子相距约10至11埃。如本文所报告的一个方面是一种产生如本文所报告的缀合物的方法，所述方法包括以下步骤-在溶液中将特异性结合至helicar基序氨基酸序列并且在CDR2中的一个氨基酸残基处包含第一反应基团的抗helicar抗体与包含第二反应基团的含有helicar基序氨基酸序列的化合物组合，其中含有helicar基序氨基酸序列的化合物包含有效载荷，如由5至500个氨基酸组成的肽或可检测标记物，和-从溶液中回收缀合物。如本文所报告的一个方面是一种用于产生抗helicar抗体的方法，所述抗helicar抗体用于形成如本文所报告的缀合物，所述方法包括以下步骤-培养包含编码抗helicar抗体的核酸的细胞，和-从细胞或培养基中回收抗helicar抗体，其中在抗helicar抗体中，将轻链CDR2中的残基突变成半胱氨酸，所述半胱氨酸在抗helicar抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物的非共价复合物的X射线结构中，在抗体CDR2中的氨基酸残基的α-碳原子和含有helicar基序氨基酸序列的化合物原子的原子之间(将要在这两者之间形成共价键)具有10至11埃的距离。如本文所报告的一个方面是一种用于鉴定抗helicar抗体CDR2中位置的方法，其中所述位置可以突变成半胱氨酸，用于在抗体CDR2中的残基和结合的含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间形成共价键，所述方法包括以下步骤-提供抗helicar抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物的非共价复合物的晶体结构，和-在抗helicar抗体的CDR2中和在含有helicar基序氨基酸序列的化合物中鉴定这样的氨基酸残基，所述氨基酸残基在抗体CDR2中的氨基酸残基的α-碳原子和含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的原子之间具有10至11埃距离其中，鉴定的位置是抗体CDR2中这样的位置，所述位置可以突变成半胱氨酸，用于在抗体CDR2中的残基和结合的含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间形成共价键。如本文所报告的一个方面是一种用于靶向递送含有helicar基序氨基酸序列的化合物至靶细胞的双特异性抗helicar抗体，其中所述双特异性抗体包含与含有helicar基序氨基酸序列的化合物特异性结合的第一结合特异性(位点)和与靶细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性。如本文所报告的一个方面是复合物的用途，所述复合物由含有helicar基序氨基酸序列的化合物和具有与helicar基序氨基酸序列特异性结合的第一结合特异性和与血脑屏障受体特异性结合的第二结合特异性的抗体所组成，用于将含有helicar基序氨基酸序列的化合物递送至脑。在一个实施方案中，血脑屏障受体选自由转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF受体)、低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和结合肝素的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)组成的组。在一个实施方案中，双特异性抗体是包含两个结合位点的全长抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是其中已融合一个或两个scFv或scFab并且包含3个或4个结合位点的全长抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段选自F(ab’)2和双抗体(diabodies)。在一个实施方案中，双特异性抗体是人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体没有效应子功能。在一个实施方案中，双特异性抗体不具有功能性Fc区。在一个实施方案中，双特异性抗体不具有Fc区。在一个实施方案中，双特异性抗体具有含突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的Fc区，其中所述位置根据Kabat(KabatEU索引)的Fc区编号法确定。在一个实施方案中，双特异性抗体具有含突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的Fc区，其中所述位置根据Kabat(KabatEU索引)的Fc区编号法确定。在一个实施方案中，双特异性抗体包含a)针对含有helicar基序氨基酸序列的化合物的一个结合位点和针对血脑屏障受体的一个结合位点，或b)针对含有helicar基序氨基酸序列的化合物的两个结合位点和针对血脑屏障受体的一个结合位点，或c)针对含有helicar基序氨基酸序列的化合物的一个结合位点和针对血脑屏障受体的两个结合位点，或d)针对含有helicar基序氨基酸序列的化合物的两个结合位点和针对血脑屏障受体的两个结合位点。在前述实施方案的情况b)和c)中，双特异性抗体中的一条重链包含孔穴突变并且相应的另一条链包含隆突突变。在一个优选的实施方案中，双特异性抗体包含针对含有helicar基序氨基酸序列的化合物的两个结合位点和针对血脑屏障受体的一个或两个结合位点。在一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物在半抗原和有效载荷之间包含接头。在一个实施方案中，接头是肽接头。在一个实施方案中，接头是化学接头(非肽接头)。已发现通过将含有helicar基序氨基酸序列的化合物共价偶联至含有抗helicar基序氨基酸序列的化合物的抗体，可以实现该化合物的稳定化、PK性能的改善。在一个实施方案中，双特异性抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物各自包含官能团，其中，当双特异性抗体结合含有helicar基序氨基酸序列的化合物时，在含有helicar基序氨基酸序列的化合物和双特异性抗体之间形成共价键。在一个实施方案中，双特异性抗体包含位于该抗体的CDR2中的氨基酸残基处的官能团，其中所述CDR2根据Kabat来确定。在一个实施方案中，抗体的CDR2中的氨基酸残基处的官能团是巯基。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗体的CDR2中的半胱氨酸氨基酸残基。在所有方面的一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物包含官能团，所述官能团在helicar基序氨基酸序列中，或者，在helicar基序氨基酸序列和化合物之间的接头(如果存在)中。在一个实施方案中，所述官能团是巯基、或马来酰亚胺、或卤代乙酰基。在一个实施方案中，helicar基序氨基酸序列中的或者接头(如果存在)中的官能团是巯基。在所有方面的一个实施方案中，共价键在抗体的CDR2中的半胱氨酸残基和含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的巯基之间。在一个实施方案中，共价键是二硫键。在一个实施方案中，共价键是二硫键并且其在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。在所有方面的一个实施方案中，CDR2是轻链CDR2。在一个实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第51位置或第55位置处。在一个优选的实施方案中，根据Kabat的轻链可变结构域编号法，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置处。已发现当用包含这样的官能团的半胱氨酸对helicar氨基酸序列进行衍生化，任何化合物可以用于含有helicar基序氨基酸序列的化合物中，所述官能团用于形成含有helicar基序氨基酸序列的化合物和抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基之间的共价二硫键。半胱氨酸残基(巯基官能团)的位置在helicar基序氨基酸序列中具有下述优点，即如果改变有效载荷，不必对抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基的合成及其位置进行再工程化。在所有方面的一个实施方案中，每条轻链CDR2确切地形成一个共价键。在所有方面的一个实施方案中，化合物选自结合部分、标记部分和生物活性部分。在所有方面的一个实施方案中，生物活性部分选自包括抗体、多肽、一种或多种CNS靶的天然配体、一种或多种CNS靶的天然配体的修饰形式、适体、抑制性核酸(即，小的抑制性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA的))、锁核酸(LNA)、核酶和小分子或任何前述的活性片段的组。在所有方面的一个实施方案中，化合物是核酸或核酸衍生物。在一个实施方案中，核酸是iRNA或LNA。在所有方面的一个实施方案中，化合物是多肽。在一个实施方案中，化合物是小分子(非多肽生物活性部分)。在一个实施方案中，生物活性部分是多肽。在一个实施方案中，多肽由5至500个氨基酸残基组成。在一个实施方案中，多肽包含10至450个氨基酸残基。在一个实施方案中，多肽包含15至400个氨基酸残基。在一个实施方案中，多肽包含18至350个氨基酸残基。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与含有helicar基序氨基酸序列的化合物特异性结合的第一结合特异性(抗helicar基序氨基酸序列结合特异性)和与(人)转铁蛋白受体特异性结合(抗(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗(h)TfR结合特异性)或与低密度脂蛋白受体相关蛋白8特异性结合(抗低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗LRP8结合特异性)的第二结合特异性。在一个实施方案中，双特异性抗体具有与含有helicar基序氨基酸序列的化合物特异性结合的两个结合特异性(两个抗helicar基序氨基酸序列结合特异性)和与(人)转铁蛋白受体特异性结合(两个抗(人)转铁蛋白受体结合特异性)或与低密度脂蛋白受体相关蛋白8特异性结合(抗低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的两个结合特异性。附图说明图1:在半抗原以及抗体中适当的位置处引入SH官能团允许该抗体和该半抗原之间形成共价键，从而产生缀合物。图2:SDS-PAGE自身荧光条带样式的示意图(在SDS-PAGE凝胶不进一步染色的情况下)：A：如果在还原或非还原条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间均不形成共价键，则可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自身荧光条带(self-fluorescentband)。B：如果在非还原条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间形成共价键，则可以在抗体和半抗原-荧光团缀合物的合并分子量处检测到一条自身荧光条带。在还原条件下，抗体和半抗原-荧光团缀合物(半抗原化的化合物)的缀合物中的二硫桥被切割，并且，可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自身荧光条带。图3:在氧化还原活性剂：氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)和还原剂(二硫赤藓糖醇，DTE)存在下结合半抗原的Cys突变的抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物(半抗原化的化合物)形成缀合物：在SDSPAGE分析中通过荧光信号检测到限定位置处的抗体复合和后续的共价连接。非还原性(上图)和还原性(下图)SDS-PAGE分析如实施例3中所述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可作为更大尺寸的蛋白质结合信号在适宜位置处检测到。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。左：荧光图像右：考马斯蓝染色系列1：具有52bC突变的抗洋地黄毒苷抗体系列2：在位置52b处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体(A)用3mMDTE和10mMGSSG共价偶联；(B)用0.3mMDTE和1mMGSSG共价偶联；(C)用0.03mMDTE和0.1mMGSSG共价偶联。图4:在仅氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)存在但还原剂不存在或二者均不存在的情况下，结合半抗原的Cys突变的抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物形成复合物：在SDSPAGE分析中通过荧光信号检测到限定位置处的抗体复合和后续的共价连接。非还原性(上图)和还原性(下图)SDS-PAGE分析如实施例4中所述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可作为更大尺寸的蛋白质结合信号在适宜位置处检测到。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。左：荧光图像右：考马斯蓝染色系列1：具有52bC突变的抗洋地黄毒苷抗体系列2：在位置52b处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体(A)无添加物(B)用1mMGSSG共价偶联；(C)用0.1mMGSSG共价偶联。图5:与非复合的抗原/半抗原相比采用共价缀合物和非共价复合物的体内血液PK研究结果；显示生物素-Cy5非共价复合物(图5A)和共价(SS桥接)缀合物(图6B)的Cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％，实心标记)，以及非复合的生物素-Ser-Cy5(星号)的相对剩余荧光强度；将时间点t＝0.08小时处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人IgG的相对剩余量(空心标记)；将t＝0.08小时处的IgG血清浓度(mg/ml)设定为100％。图6:确定小鼠血清中洋地黄毒苷化PYY多肽的量的蛋白质印迹。图7:半抗原化化合物与抗半抗原抗体的亲和力驱动复合的分析。在SDSPAGE分析中由荧光信号指引在限定位置处的抗体复合和后续的共价连接，所述SDSPAGE分析如实施例11中所述实施。左：采用非还原样品(凝胶左侧)和还原样品(凝胶右侧)的荧光图像。右：考马斯蓝染色。1：人源化抗洋地黄毒苷抗体+生物素-Cys-Cy52：人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC+生物素-Cys-Cy53：人源化抗生物素抗体+生物素-Cys-Cy54：人源化抗生物素抗体VH53C+生物素-Cys-Cy5白色箭头标示过量(未偶联的)生物素-Cys-Cy5，当使用抗洋地黄毒苷抗体VH52bC时，所述过量的生物素-Cys-Cy5是显著更高，因为在这种情况下缀合反应不是亲和力驱动的。图8:Dig-Cy5非共价复合物和共价(二硫化物桥接)缀合物的，以及非复合的Dig-Cy5的Cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％)；将时间点t＝0.08h处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人IgG的相对剩余量；将t＝0.08h处的IgG血清浓度(mg/ml)设定为100％。图9:体内样条件下由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫化物桥接)缀合物的生物素-Cy5以及非复合的生物素-Cy5的Cy5介导荧光的药物代谢动力学；实心菱形：生物素-Cy5；实心正方形：生物素-Cy5+抗生物素抗体(复合物)；三角形：Cy5-生物素-抗生物素抗体缀合物。图10:通过非还原性SDSPAGE和还原性SDSPAGE展示在结合生物素的抗体和生物素-Cys-Cy5之间共价复合物的形成；偶联反应在37℃于鼠血清中进行1小时。Cy5似乎仅在含有生物素-Cys-Cy5和Cys突变的抗体的样品中在非还原条件下与H链偶联；这些共价缀合物在还原时崩解(右侧泳道)；泳道1：分子量标记；泳道2-3非还原条件-泳道2：抗生物素抗体(无Cys突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；泳道3：抗生物素抗体-Cys+生物素-Cys-Cy5(缀合物)；泳道4-5还原条件-泳道5：抗生物素抗体(无Cys突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；泳道6：抗生物素抗体-Cys+生物素-Cys-Cy5(缀合物)。图11:由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫化物桥接)缀合物的生物素-Cy5以及非复合的生物素-Cy5的Cy5介导荧光的体内药物代谢动力学；实心菱形：生物素-Cy5，实心圆圈：在施用抗生物素抗体后24小时施用的生物素-Cy5(体内复合物形成)；实心正方形：在施用抗生物素抗体-Cys后24小时施用的生物素-Cys-Cy5(体内缀合物形成)。图12:抗体0155与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2的偶联的SDSPAGE凝胶，使用2.5摩尔过量的含有helicar基序氨基酸序列的化合物形成共价复合物0156；泳道1＝helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2；泳道2＝抗体0019；泳道3＝抗体0155。图13:抗体0157与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶联的SDSPAGE凝胶；泳道1＝helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(氧化的)；泳道2＝对照偶联(氧化的)；泳道3＝共价缀合物(氧化的)；泳道4＝分子量标记；泳道5＝共价缀合物(还原的)；泳道6＝对照偶联(还原的)；泳道7＝helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(还原的)。图14:抗体0155、SEQIDNO:28的缺失C-末端赖氨酸残基的含有helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的假单胞菌外毒素分子LR8M和它们的共价缀合物的SEC层析图。图15:关于非还原样品，通过SDS-CE,Caliper分析缀合效率。发明的详细说明I.定义出于本文目的，“受体人类框架”是这样的框架，其包含从如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人类框架可以包含其相同氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或者2或更少。在一些实施方案中，VL受体人类框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。术语“氨基酸”指天然存在(即，可以由核酸直接或以前体形式编码)的或非天然存在的一组羧基α-氨基酸。各个天然存在的氨基酸由组成自三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)的核酸编码。每种氨基酸由至少一个密码子编码。这被称为“遗传密码的简并性”。如本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。非天然存在氨基酸的例子包括，但不限于，Aad(α-氨基己二酸)、Abu(氨基丁酸)、Ach(α-氨基环己烷-羧酸)、Acp(α-氨基环戊烷-羧酸)、Acpc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Aic(2-氨基茚满-2-羧酸；也称为2-2-Aic)、1-1-Aic(1-氨基茚满-1-羧酸)、(2-氨基茚满-2-羧酸)、烯丙基甘氨酸(allylGly)、别异亮氨酸(allo-Ile)、Asu(α-氨基辛二酸、2-氨基辛二酸)、Bip(4-苯基-苯丙氨酸-羧酸)、BnHP((2S,4R)-4-羟脯氨酸)、Cha(β-环丙基丙氨酸)、Cit(瓜氨酸)、环己基甘氨酸(Chg)、环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、Dab(1,4-二氨基丁酸)、Dap(1,3-二氨基丙酸)、p(3,3-双苯基丙氨酸-羧酸)、3,3-双苯基丙氨酸、二-正丙基甘氨酸(Dpg)、2-呋喃基丙氨酸、高环己基丙氨酸(HoCha)、高瓜氨酸(HoCit)、高环亮氨酸、高亮氨酸(HoLeu)、高精氨酸(HoArg)、高丝氨酸(HoSer)、羟脯氨酸、Lys(Ac)、(1)Nal(1-萘基丙氨酸)、(2)Nal(2-萘基丙氨酸)、4-MeO-Apc(1-氨基-4-(4-甲氧苯基)-环己烷-1-羧酸)、正亮氨酸(Nle)、Nva(正缬氨酸)、Omathine、3-Pal(α-氨基-3-吡啶基丙氨酸-羧酸)、4-Pal(α-氨基-4-吡啶基丙氨酸-羧酸)、3,4,5,F3-Phe(3,4,5-三氟苯丙氨酸)、2,3,4,5,6,F5-Phe(2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸)、Pqa(4-氧代-6-(1-哌嗪基)-3(4H)-喹唑啉-乙酸(CAS889958-08-1))、吡啶基丙氨酸、喹啉基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、噻唑基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、Tic(α-氨基-1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸)、Tic(OH)、Tle(叔丁基甘氨酸)和Tyr(Me)。术语“氨基酸序列变体”指具有某种程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体将与天然序列多肽拥有至少约70％序列同一性。在一个实施方案中，变体与天然序列多肽具有约80％或更大序列同一性。在一个实施方案中，变体与天然序列多肽具有约90％或更大序列同一性。在一个实施方案中，变体与天然序列多肽具有约95％或更大序列同一性。在一个实施方案中，变体与天然序列多肽具有约98％或更大序列同一性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内部的某些位置处拥有置换、缺失和/或插入。氨基酸由常规名称、单字母代码和三字母代码命名。术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。术语“抗体片段”指除完整抗体之外包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。术语“生物素”，简写为“BI”，指5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素也被称为维生素H或辅酶R。术语“双特异性抗体”指具有两种不同(抗原/helicar)结合特异性的抗体。在一个实施方案中，如本文所报告的双特异性抗体特异于两种不同的抗原，即，含有helicar基序氨基酸序列的化合物和不含有helicar基序氨基酸序列的抗原。术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。如本文所使用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于，放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。术语“洋地黄毒苷”，简写为“DIG”，指3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-三羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢-环戊[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS编号1672-46-4)。洋地黄毒苷(DIG)是一种仅专有地发现于植物洋地黄(Digitalispurpurea)、东方毛地黄(Digitalisorientalis)和狭叶毛地黄(Digitalislanata)(毛地黄)的花和叶中的类固醇(Polya,G.,Biochemicaltargetsofplantbioactivecompounds,CRCPress,NewYork(2003)第847页)。术语“效应子功能”指归因于抗体Fc区的那些生物学活性，这些活性随抗体类别变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；以及B细胞活化。术语，活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”，指的是，以必要的剂量并持续必要的时间段的、有效地实现期望的治疗结果或预防结果的量。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和残余“Fc”片段，该片段的名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基末端处附加了几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab'-SH在本文中是指这样的Fab'，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生，所述成对的Fab'片段在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构造中每个可变结构域的3个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，这6个高变区向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含特异于抗原的3个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然以比整个结合位点更低的亲和力进行。本文中的术语“Fc区”用来定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest),第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU索引。术语“荧光素”，简写为“FLUO”，指6-羟-9-(2-羧苯基)-(3H)-呫吨-3-酮，备选地2-(6-羟-3-氧代-(3H)-呫吨-9-基)-苯甲酸。荧光素又称作二酚酞、C.I.45350、溶剂黄94，D&C黄第7号、angiofluor、日本黄201、或皂黄。术语“框架”，简写为“FR”，指除高变区(HVR)残基之外的重链及轻链可变结构域氨基酸残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。术语“游离半胱氨酸氨基酸”指这样的半胱氨酸氨基酸残基，其已经被工程化入亲本抗体中，具有巯基官能团(SH)并且不配对为分子内二硫桥。然而，游离半胱氨酸氨基酸可以配对为分子内二硫桥，例如与谷胱甘肽配对。术语“全长抗体”指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链。天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N-末端至C-末端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-末端至C-末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。“全长抗体”是包含VL结构域和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。全长抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，所述效应子功能指归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；以及下调细胞表面受体如B细胞受体和BCR。术语“半抗原”指仅当附接至大载体(如，蛋白质)时才可以激发免疫应答的小分子。示例性半抗原是苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸、醌、组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、肼苯哒嗪、氟烷、铟-DTPA、荧光素、生物素、洋地黄毒苷、茶碱和二硝基酚。在一个实施方案中，半抗原是生物素或洋地黄毒苷或茶碱或碳硼烷或溴脱氧尿苷。术语“helicar基序氨基酸序列”指具有SEQIDNO:01的氨基酸序列的氨基酸序列，或者是由具有SEQIDNO:04的可变重链结构域和SEQIDNO:05的轻链可变结构域的抗helicar抗体特异性结合的其变体。术语“与。。。缀合的helicar基序氨基酸序列”或“含有helicar基序氨基酸序列的化合物”指与其他部分(如，多肽或标记物)共价连接的helicar基序氨基酸序列。可以使用活化的helicar基序氨基酸序列衍生物作为用于形成这类缀合物的原料。在一个实施方案中，接头包含a)一个或多个(在一个实施方案中3至6个)亚甲基-羧基-甲基(-CH2-C(O)-)，和/或b)1至10个(在一个实施方案中1至5个)氨基酸残基(在一个实施方案中，所述氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐，β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸或赖氨酸)，和/或c)一种或多种(在一个实施方案中一种或两种)具有结构式NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH的化合物，其中n是2或3并且x是1至10，在一个实施方案中x是1至7。末尾单元(至少部分地)产生式-NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-的接头(部分)。这类化合物的一个例子例如是12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(产生TEG(三乙二醇)接头)。在一个实施方案中，接头还包含马来酰亚胺基。接头具有稳定及增溶作用，原因在于它含有电荷或/和可以形成氢桥。此外，它可以在空间上协助抗helicar抗体与含有helicar基序氨基酸序列的化合物的结合。在一个实施方案中，接头位于helicar基序氨基酸序列的氨基酸的侧链处(例如经由氨基或巯基与赖氨酸或半胱氨酸侧链缀合)。在一个实施方案中，接头位于helicar氨基酸序列的氨基末端处或羧基末端处。接头在缀合的化合物(＝有效载荷)上的位置一般选择在不影响有效载荷的生物学活性的区域处。因此，接头的附接位置取决于有效载荷的性质和负责生物学活性的有关结构元件。可以在体外测定法中测试helicar基序氨基酸序列附接的有效载荷的生物学活性。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。在核酸含量方面，子代与亲本细胞可以不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括这样的突变体子代，所述突变体子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的或衍生自利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且通常2个可变结构域中的基本上全部，其中HVR中的全部或基本上全部(例如，CDR)与非人抗体中的那些对应，并且FR中的全部或基本上全部与人抗体中的那些对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如，非人抗体)指已经历过人源化的抗体。如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的HVR包括(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242)；(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类(如，猴))、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B848(2007)79-87。“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，组成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然发生的突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对照，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生将要根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。术语“单特异性抗体”指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个具有相同的结合特异性，即，与相同的抗原或helicar基序氨基酸序列结合。“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。术语“包装说明书”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包含的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。“亲本抗体”是包含这样的氨基酸序列的抗体，来自该氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被替换为一个或多个半胱氨酸残基。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。相对于抗体的其他天然形式、野生型形式或修饰形式，亲本抗体可以具有预先存在的氨基酸序列修饰(如，添加、缺失和/或置换)。亲本抗体与helicar基序氨基酸序列特异性结合。亲本抗体还可以额外地针对感兴趣的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。针对非多肽抗原的抗体也在考虑之内。术语“有效载荷”指其活性期望被递送(入)至细胞中和/或定位于细胞处的任何分子或分子组合。有效载荷包括但不限于标记物、多肽毒素(例如，假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、酶、生长因子、转录因子、药物、放射性核素、配体、抗体、脂质体、纳米粒子、病毒粒子、细胞因子等。“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯类如白消安、英丙舒凡和泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；环乙亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲类如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、刺孢霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、佐柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢药如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2\-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和多西紫杉醇Rh6ne-PoulencRorer,Antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-II；35拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。该定义中还包括发挥对肿瘤调节或抑制激素作用的抗激素药如抗雌激素药，例如包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素药如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。“抗血管生成剂”指一定程度地阻断或干扰血管形成的化合物。抗血管生成剂可以例如是与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管生成因子是与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。术语“细胞因子”是用于一个细胞群体所释放的蛋白质的通用术语，所述蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和常规的多肽激素。细胞因子当中包括生长激素如人生长激素、N-甲硫酰人生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和-P；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-p；血小生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-a和TGF-p；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-a、-P和-y；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-II、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-P；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文中所使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等同物。术语“fMLP”指由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应子部分是fMLP或其衍生物。术语“前体药物”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比，所述前体或衍生物对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性并且能够被酶促活化或转化成更具活性的母体形式。参见，例如，Wilman,\ProdrugsinCancerChemotherapy\BiochemicalSocietyTransactions,第14卷,615thMeetingBelfast(1986)第375-382页和Stella等人,\Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery\,DirectedDrugDelivery,Borchardt等人,(编著),第247-267页,HumanaPress(1985)。可以作为效应子部分使用的前体药物包括，但不限于，含有磷酸酯的前体药物、含有硫代磷酸酯的前体药物、含有硫酸酯的前体药物、含有肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含有b-内酰胺的前体药物，任选地含有置换的苯氧乙酰胺的前体药物或任选地含有置换的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前体药物，这些前体药物可以被转化成更具活性细胞毒性的游离药物。可以衍生成用于本发明中的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于本文所述的那些化疗剂。术语“细胞毒部分”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于，放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及本文公开的多种抗肿瘤剂或抗癌剂。相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为：对齐序列并根据需要引入空位以实现最大百分比的序列同一性并且不将任何保守置换考虑为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的，可以按本领域技术范围内的多种方式实现比对，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的序列的整个长度范围内的最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局，WashingtonD.C.,20559，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可以从Genentech公司,SouthSanFrancisco,California公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当被编译成在UNIX操作系统(包括数字UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且不变动。在ALIGN-2被用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、同或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(这可以备选地描述为与、同或针对给定氨基酸序列B具有或包含某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别声明，否则本文所用的所有％氨基酸序列同一性值如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这样的形式，以允许其中所含的活性成分的生物学活性有效，并且不含有对将被施用该制剂的对象造成不可接受毒性的额外组分。“可药用载体”指药物制剂中除活性成分之外对对象无毒的成分。可药用载体包括，但不限于，缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。“多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生或合成产生。小于约20个氨基酸残基的多肽可以称作“肽”，而由两条或更多条多肽组成或包含超过100个氨基酸残基的一条多肽的分子可以称作“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，如糖基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由在其中表达多肽的细胞添加并且可以随细胞类型变动。多肽在本文中根据它们的氨基酸主链结构或编码它们的核酸限定。附加物(如，糖基团)通常不予指定，但仍然可以存在。所有多肽序列根据普遍接受的惯例书写，因而α-N-末端氨基酸残基在左侧并且α-C-末端氨基酸残基在右侧。如本文所使用的，术语“N-末端”指多肽中氨基酸的游离α-氨基，并且术语“C-末端”指多肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。N-末端以某个基团终止的多肽指在N-末端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。N-末端以某个基团终止的氨基酸指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。除非通过“D”前缀另外指明(例如，D-Ala或N-Me-D-Ile)或者以小写字母样式书写(例如a、i、1(D形式的Ala、Ile、Leu))，否则本说明书和所附权利要求书中描述的多肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学是天然构型或“L”构型。Cahn-Ingold-Prelog“R”和“S”命名用来规定在多肽的N-末端处某些酰基取代基中的手性中心的立体化学。命名“R,S”意在指示两种对映异构形式的外消旋混合物。这种命名法遵循Cahn,R.S.等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.5(1966)385-415中描述的命名法。术语“单链Fv”，简写为“scFv”，指包含抗体VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头允许scFv形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见Plueckthun收录于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。术语“茶碱”，简写为“THEO”，指1,3-二甲基-7H-嘌呤-2,6-二酮。茶碱又称作二甲基黄嘌呤。术语“治疗”(和其语法变型如“治疗”或“治疗”)指意欲改变正在治疗的个体的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学进程期间进行。想要的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，降低病情进展速率，改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。术语“×价”，例如“单价”或“二价”或“三价”或“四价”，指抗体分子中存在指定数目的结合位点，即“×”个。就这一点而论，术语“二价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。如本文所报告的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。在一个实施方案中，如本文所报告的双特异性抗体是二价、三价或四价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是四价的。在某些方面和实施方案中，如本文所报告的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。即，这些抗体可以是双特异性的，甚至在存在多于两个结合位点的情况下(即该抗体是三价或多价的)也是如此。术语双特异性抗体包括，例如，多价单链抗体、双抗体和三抗体(triabodies)，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，其中通过一个或多个肽接头与其他抗原结合位点(例如，单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)2)连接。抗体可以是来自单一物种的全长抗体或经嵌合化或人源化。对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要该蛋白质具有针对两种不同抗原的结合位点即可。即，在第一结合位点特异于helicar基序氨基酸序列的情况下，第二结合位点特异于非helicar基序氨基酸序列抗原，并且反之亦然。术语“可变区”指抗体重链或轻链的参与抗体结合其抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域文库。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628。术语“载体”指能够增殖与之连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞的基因组中的载体，其中已经向所述细胞中引入所述载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。II.如本文所报告的缀合物在一个方面，本发明基于如下研究结果：可以通过以下方式获得包括含有helicar基序氨基酸序列的化合物和与helicar基序氨基酸序列特异性结合的抗helicar基序氨基酸序列抗体的共价缀合物，所述方式在helicar基序氨基酸序列中恰当安置的官能团和抗体可变结构域中(尤其是抗体CDR2中)的官能团之间形成共价键，其中根据Kabat的可变结构域编号法确定CDR2。在一个实施方案中，含有helicar基序氨基酸序列的化合物是包含helicar基序氨基酸序列、接头和有效载荷的缀合物。在某些实施方案中，官能团可以含有电子缺陷的双键或巯基。在一个实施方案中，官能团是马来酰亚胺或半胱氨酸。由于可以使用如本文所报告的缀合物作为人类中的治疗剂，本文还提供与helicar基序氨基酸序列特异性结合的上述抗体的人源化变体。含有helicar基序氨基酸序列的化合物和抗helicar基序氨基酸序列抗体的共价缀合物可以向含有helicar基序氨基酸序列的化合物赋予良好的生物物理特性和改进的PK特性。另外，在使用双特异性抗体的情况下，该缀合物可以用于将含有helicar基序氨基酸序列的化合物靶向至细胞，所述细胞展示被双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原。这类缀合物由一种抗helicar基序氨基酸序列结合特异性和一种另外的(非helicar基序氨基酸序列)抗原结合特异性组成。抗体对含有helicar基序氨基酸序列的多肽的化学计量比取决于双特异性抗体的样式并且可以是1:1、1:2、2:1、2:2、2:4和4:2(抗体:含有helicar基序氨基酸序列的多肽)。期望的是含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的生物学活性化合物保留良好的生物学活性，尽管与helicar基序氨基酸序列缀合以及与抗体缀合。还期望的是(在双特异性靶向模块的情况下)，在共价缀合的含有helicar基序的化合物存在下，双特异性抗体的细胞表面靶结合位点保留其结合特异性和亲和力。在helicar基序氨基酸序列中的反应基团可以是任何反应基团，如，举例来说，马来酰亚胺，例如N-乙基马来酰亚胺(NEM)、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他反应性缀合搭档(参见，例如，Haugland,2003,MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,MolecularProbes，Inc.；Brinkley,1992,BioconjugateChem.3:2；Garman,1997,Non-RadioactiveLabeling:APracticalApproach,AcademicPress,London；Means(1990)BioconjugateChem.1:2；Hermanson,G.收录于BioconjugateTechniques(1996)AcademicPress,SanDiego,第40-55页和第643-671页)。抗体上的反应基团限于可以选择性(即，位置特异性)生成的那些。因此，它限于氨基酸残基半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的侧链基团。为了在抗helicar基序氨基酸序列抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间形成共价缀合物，两者都必须通过引入反应基团而被修饰。一旦抗helicar基序氨基酸序列抗体结合helicar基序氨基酸序列，则使得两个反应基团紧邻，从而允许共价键形成。在一个实施方案中，该修饰是在每种化合物中引入巯基功能性。在一个实施方案中，该巯基化合物是半胱氨酸残基。待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应当靠近结合区以利用helicar基序氨基酸序列定位效应用于定向偶联，和(ii)突变位置和偶联位置必须以不影响helicar基序氨基酸序列结合本身的方式安置。关于找到合适位置的这些要求事实上是彼此‘矛盾’的，因为要求(i)由接近于结合位点的位置最佳满足，然而，要求(ii)由远离结合位点的位置最安全地实现。尽管有这些实际上排他性的要求，但是能够鉴定到可以在不影响helicar基序氨基酸序列定位的情况下突变并且仍然同时允许定向共价偶联的位置。根据根据轻链可变结构域的Kabat编号法，一个位置位于位置VL55处。根据轻链可变结构域的Kabat编号法，一个位置位于位置VL51处。这些位置适用于helicar基序氨基酸序列抗体，并且因此不需要每次都从头开始制备新的共价缀合物。仅helicar基序氨基酸序列要被引入/缀合至有效载荷。如本文所报告的修饰的抗体保留其亲本(即，野生型)抗体对应物的helicar基序氨基酸序列结合能力。因此，工程化抗体能够与helicar基序氨基酸序列结合，在一个实施方案中，工程化抗体能够与helicar基序氨基酸序列特异性结合。术语“结合特异性”或“与……结合的抗体”指包含结合特异性的分子或抗体可以与其他分子以特异性方式形成复合物。这种结合可以在体外测定法中(如，在等离子体共振测定法(BIAcore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)中)检测到。复合物形成的亲和力由术语ka(化合物缔合以形成复合物的速率常数)、kD(解离常数，复合物的解离)和KD(kD/ka)定义。结合或特异性结合意指约10-7M或更小、在一个实施方案中约10-8M至约10-13M、在一个实施方案中约10-9M至约10-13M的结合亲和力(KD)。因此，与helicar基序氨基酸序列结合以形成如本文所报告的复合物的抗体以约10-8mol/l或更小、在一个实施方案中约10-8mol/l至约10-13mol/l的结合亲和力(KD)与helicar基序氨基酸序列特异性结合。已经发现，当抗体与helciar基序氨基酸序列结合时，在半胱氨酸修饰的抗helicar基序氨基酸序列抗体和半胱氨酸修饰的含有helicar基序氨基酸序列的化合物(其在helicar基序氨基酸序列中携带半胱氨酸残基)之间的共价键形成将发生，而不需要添加还原剂和/或氧化剂如果形成的键是二硫键。因此，当形成非共价复合物时，两种化合物之间的二硫桥自发地形成。因此，一种用于形成如本文所报告的共价复合物的方法仅需要混合这两种化合物。形成二硫键的唯一先决条件是两种化合物相对于彼此的正确取向。如本文所报告的工程化抗体可以位点特异性地和有效地与包含反应基团的helicar基序氨基酸序列共价缀合(偶联)。将位置VL55或VL51处(根据Kabat编号方案)的氨基酸残基分别替换为半胱氨酸残基，产生了具有列出于SEQIDNO:06和SEQIDNO:07的重链可变区序列的抗helicar基序氨基酸序列抗体衍生物。如本文所报告的一个方面是抗helicar基序氨基酸序列抗体，其是人源化抗体。在一个实施方案中，抗helicar基序氨基酸序列抗体包含，从具有SEQIDNO:04的氨基酸序列的重链可变结构域衍生的人源化重链可变结构域，和，从具有SEQIDNO:05的氨基酸序列的轻链可变结构域衍生的人源化轻链可变结构域。如本文所报告的一个方面是抗helicar基序氨基酸序列抗体，其是人源化抗体。在一个实施方案中，抗helicar基序氨基酸序列抗体包含，从具有SEQIDNO:04的氨基酸序列的重链可变结构域衍生的人源化重链可变结构域，和，从具有SEQIDNO:06的氨基酸序列的轻链可变结构域衍生的人源化轻链可变结构域。如本文所报告的一个方面是抗helicar基序氨基酸序列抗体，其是人源化抗体。在一个实施方案中，抗helicar基序氨基酸序列抗体包含，从具有SEQIDNO:04的氨基酸序列的重链可变结构域衍生的人源化重链可变结构域，和，从具有SEQIDNO:07的氨基酸序列的轻链可变结构域衍生的人源化轻链可变结构域。如本文所报告的一个方面是抗helicar基序氨基酸序列抗体，其包含，如SEQIDNO:04的可变结构域中的CDR(对于重链)，以及，如SEQIDNO:05或SEQIDNO:06或SEQIDNO:07的可变结构域的任一项中的CDR(对于轻链可变结构域)，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。如本文所报告的一个方面是抗helicar基序氨基酸序列抗体，其包含，如SEQIDNO:04的可变结构域中的高变环(对于重链)，以及，如SEQIDNO:05或SEQIDNO:06或SEQIDNO:07的可变结构域的任一项中的高变环(对于轻链可变结构域)，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。例如，PYY被修饰为包含helicar基序氨基酸序列并通过抗helicar基序氨基酸序列抗体复合，以获得抗体的药物代谢动力学性质的优点并避免PYY的固有不稳定性。PYY3-36肽的结构研究(Nygaard,R.等人,Biochem.45(2006)8350-8357；SEQIDNO:26)揭示了关于中心氨基酸的螺旋基序(helicar样基序氨基酸序列)。由于N-末端的异亮氨酸和修饰的C-末端已被描述为对于所述肽的功能活性是必需的，因此对中心螺旋进行修饰以便反映helicar基序氨基酸序列中的氨基酸。通过将小过量的肽施加至抗体溶液中，在体外获得完整的IgG1抗helicar基序氨基酸序列抗体0019和修饰的PYY肽PYY_helicar。形成复合物0052。复合物的化学计量通过SEC-Malls分析实验确定为一个二价抗体上复合1.6个肽。测试抗体0019、PYY(3-36)野生型、PYY_helicar和复合物0052对Y2受体家族的作用。如所证明的(Hoffmann,E.等人,J.Cont.Rel.171(2013)48-56.)，由抗体复合的肽具有延长的体内半寿期。此外，令人惊讶的是，与非复合的肽相比，复合物对NPY2R受体表现出稍好的亲和力；抗体使多肽稳定，并使肽以其固定的生物学活性构象呈现。为了增加抗helicar基序氨基酸序列抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间的复合物的体外和体内稳定性，已使用结合时的二硫桥形成。第一步是特异性识别步骤(高亲和力相互作用)，即，含有helicar基序氨基酸序列的化合物-抗helicar基序氨基酸序列抗体复合物的形成。这之后是第二步，通过二硫桥的自发改组(shuffling)以形成稳定性改善的共价复合物。由于12聚体肽(helicar基序氨基酸序列)是相对刚性的实体(至少当由特异性抗helicar基序氨基酸序列抗体复合时)，已经发现，关于二硫桥必须使用结构上特定的设计。由于复合物形成和随后实现的共价偶联是在两个重组产生的实体之间，用于形成共价二硫键的所引入的人工半胱氨酸残基并不一定作为游离半胱氨酸残基产生，而是以还原形式表达，即，与游离半胱氨酸或同型半胱氨酸氨基酸缀合。在抗helicar基序氨基酸序列抗体可变结构域的氨基酸序列中，引入人工游离半胱氨酸残基的位置是至关重要的。抗体可变结构域氨基酸序列中的非暴露半胱氨酸具有更大的概率表达为游离半胱氨酸(非缀合的)，而暴露的半胱氨酸残基靠近结合口袋可能破坏12聚体肽(helicar基序氨基酸序列)的结合，这归因于由该半胱氨酸与另外的部分(如游离半胱氨酸)缀合所导致的空间位阻。为了鉴定具有最小的空间位阻风险和亲和力强烈降低风险的适当位置，已测试用于在helicar基序氨基酸序列中引入人工半胱氨酸残基的不同位置。已在12聚体(helicar基序氨基酸序列)的C-末端处引入半胱氨酸残基以使得互补位的主要部分不变。已合成这些肽并将它们融合至荧光基序。野生型:AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)半胱氨酸变体1:AHLENEVARCKK(SEQIDNO:02)->AHLENEVARCKK(5-Fluo)-OH半胱氨酸变体2:AHLENEVARLCK(SEQIDNO:03)->AHLENEVARLCK(5-Fluo)-OHxTFA在抗体上，已完成结构设计，以允许两种经设计的肽均形成二硫桥，所述肽各自包含不同3D环境中的半胱氨酸。12聚体螺旋肽AHLENEVARLKK(helicar基序氨基酸序列)被建模入VH和VH结构域。在该肽的C-末端处，残基L10和K11被鉴定为可能的位置，并且，在轻链可变结构域中，根据Kabat的轻链编号法的位置N55和G51被鉴定。将二价抗体0155(N55C)与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2偶联。在SDSpage(变性条件，参见图12)上，仅在抗体0155上看见荧光；在还原条件下，仅有小肽是可见的。含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗helicar基序氨基酸序列抗体的共价缀合是成功的。抗体0157(G51C)与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶联没有得到预期的共价复合物。在预期的泳道中没有看到荧光，但是在此实验中本来应该是阴性的参考上看到了荧光(参见图13)。含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗helicar基序氨基酸序列抗体0157的共价缀合未成功。不受该理论束缚，假设在这种情况下，抗体半胱氨酸化在结合口袋中太深了，以至于不允许含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物有效地结合并在适当位置中递送亲核巯基以进攻C51。当考虑与重组产生的含有helicar基序氨基酸序列的多肽形成共价复合物时，基于helicar的方法变得特别有吸引力。由于含有VL-N55C突变的抗体0155与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQIDNO:02)的缀合与备选方案(VL上的G51C与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2(AHLENEVARCKK；SEQIDNO:03))相比已表现得好得多，因此进一步研究了0155与含有helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的多肽的缀合。多肽所含有的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQIDNO:02)融合至N-末端。将抗体0155与SEQIDNO:28的、缺失C-末端赖氨酸残基的、含有helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的假单胞菌外毒素分子LR8M共价缀合。SEC层析图示于图14。对于非还原样品，通过SDS-CE,Caliper分析缀合效率(参见图15)。总之，抗helicar基序氨基酸序列单克隆抗体可以通过高亲和力识别12聚体helicar基序氨基酸序列用于复合肽、具有肽接头的小分子和重组蛋白。具有折叠为螺旋的倾向的肽可被修饰以模仿原始12聚体helicar基序氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)并且此后可与抗helicar基序氨基酸序列单克隆抗体复合。除高亲和力复合之外，用含有半胱氨酸的SEQIDNO:01半胱氨酸变体和在CDR中含有半胱氨酸的经修饰的抗helicar基序氨基酸序列抗体经由形成稳定二硫键能够实现共价缀合。由不同的系统表达的重组蛋白可以随后体外缀合，无需特别的反应条件，而是通过自发的二硫桥改组。抗体亲和力在某些实施方案中，如本文所报告的抗helicar基序氨基酸序列抗体本身或如本文所报告的复合物中的抗helicar基序氨基酸序列抗体具有≤1μM、≤100nM、≤约10nM(例如约10-6M或更小，例如从约10-6M至约10-13M，例如，从约10-8M至约10-10M)的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量Kd，所述测定法用感兴趣抗体的Fab形式和其抗原如以下测定法所述那样进行。通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的(125I)-标记抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立用于测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml抗Fab捕获抗体(CappelLabs)包被过夜并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温下(大约23℃)封闭2至5小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣Fab的连续稀释物(例如，与Presta,L.G.等人,CancerRes.57(1997)4593-4599中评估抗VEGF抗体Fab-12一致)混合。随后将感兴趣Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温下孵育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定法中。根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，使用或(BIAcore公司,Piscataway,NJ)在25℃采用固定抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)，测量Kd。简而言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE公司)。抗原用pH4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速注射以达到大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型评估软件，版本3.2)，通过同时拟合缔合和解离传感图，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。如果通过以上的表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流阀(stop-flow)的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在pH7.2的PBS中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。抗体片段在某些实施方案中，本文提供的或如本文所报告的缀合物中的抗helicar基序氨基酸序列抗体是抗helicar基序氨基酸序列抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun,A.,收录于；ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),Springer-Verlag,NewYork(1994),第269-315页；还参见WO93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见US5,869,046。双抗体(Diabodies)是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP0404097；WO93/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；以及Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗体(Triabodies)和四抗体(tetrabodies)同样描述于Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(20039129-134)。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或者全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis公司,Waltham,MA；参见，例如，US6,248,516)。可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。嵌合抗体和人源化抗体在某些实施方案中，本文提供的抗helicar基序氨基酸序列抗体或如本文所报告的缀合物中的抗helicar基序氨基酸序列抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在US4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如，猴)的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类切换”抗体，其中类或亚类已被改变而不同于亲本抗体的类或亚类。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。人源化抗体和制造它们的方法综述于，例如Almagro，J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633，并且还描述于，例如Riechmann,I.等人,Nature332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua,W.F.等人,Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn,J.等人,Methods36(2005)61-68以及Klimka,A.等人,Br.J.Cancer83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方法)。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见，例如，Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从轻链可变区或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列衍生的框架区(参见，例如，Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及从筛选FR文库衍生的框架区(参见，例如，Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996922611-22618))。文库衍生的抗体可以通过针对具有期望的一种或多种活性的抗体筛选组合文库来分离本发明的抗helicar基序氨基酸序列抗体或如本文所报告的缀合物中的抗helicar基序氨基酸序列抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和针对拥有期望的结合特性的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于，例如，Hoogenboom,H.R.等人,MethodsinMolecularBiology178(2001)1-37，并且还描述于，例如，McCafferty,J.等人,Nature348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,MethodsinMolecularBiology248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；以及Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods284(2004)119-132。在某些噬菌体展示方法中，VH基因库和VL基因库分别由聚合酶链式反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以针对结合抗原的噬菌体筛选所述噬菌体文库，如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆幼稚库以便在不作任何免疫的情况下提供针对广泛的非自身抗原还有自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths,A.D.等人,EMBOJ.12(1993)725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排，合成地产生幼稚文库，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：US5,750,373，US2005/0079574，US2005/0119455，US2005/0266000，US2007/0117126，US2007/0160598，US2007/0237764，US2007/0292936，以及US2009/0002360。将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。抗体形式上文概述的抗helicar基序氨基酸序列抗体和抗helicar基序氨基酸序列抗体片段可以按多种方式组合以产生不同的抗体形式。例如，一个或多个scFv抗体片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的C-末端融合。scFv抗体片段尤其可以与每个重链C-末端或与每个轻链C-末端融合。例如，一个或多个抗体Fab片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的C-末端融合。抗体Fab片段尤其可以与每个重链C-末端或与每个轻链C-末端融合。例如，一个scFv和一个抗体Fab片段可以与抗体Fc区的N-末端融合。例如，一个scFv或抗体Fab片段可以与抗体Fc区的N-末端融合并且一个scFv或抗体Fab片段可以与抗体Fc区的相应另一条链的C-末端融合。多特异性抗体已经开发了类型广泛的重组抗体形式，例如，由例如IgG抗体形式与单链结构域融合的四价双特异性抗体(参见，例如，Coloma,M.J.等人,NatureBiotech15(1997)159-163；WO01/077342；以及Morrison,S.L.,NatureBiotech25(2007)1233-1234)。另外，已经开发了其中不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的几种其他形式，如双抗体、三抗体或四抗体、微型抗体、能够结合两种或更多种抗原的几种单链形式(scFv、双scFv)(Holliger,P.等人,NatureBiotech23(2005)1126-1136；Fischer,N.,O.,Pathobiology74(2007)3-14；Shen,J.等人,JournalofImmunologicalMethods318(2007)65-74；Wu,C.等人,NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。所有这类形式均使用接头以使抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如，scFv)融合或以使例如两个Fab片段或scFv融合(Fischer,N.和O.,Pathobiology74(2007)3-14)。应当牢记，人们可能希望通过维持与天然存在的抗体的高程度相似性而保留效应子功能，如，举例来说，补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，它们通过Fc受体结合介导。在WO2007/024715中报告了作为工程化多价和多特异性结合蛋白的双重可变结构域免疫球蛋白。在US6,897,044中报告了一种用于制备生物学上有活性的抗体二聚体的方法。在US7,129,330中报告了具有至少四个可变结构域的多价FV抗体构建体，所述可变结构域经由肽接头彼此连接。在US2005/0079170中报告了二聚的和多聚的结合抗原的结构。在US6,511,663中报告了包含三个或四个Fab片段(它们通过连接结构彼此共价结合)的三价或四价单特异性抗原结合蛋白，所述蛋白质不是天然免疫球蛋白。在WO2006/020258中报告了可以在原核细胞和真核细胞中高效表达并且可用于治疗方法和诊断方法中的四价双特异性抗体。在US2005/0163782中报告了一种这样一种方法，所述方法从包含两种类型的多肽二聚体的混合物中，区别于不经由至少一个链间二硫键连接的二聚体，分离或偏好地合成经由至少一个链间二硫键连接的二聚体。在US5,959,083中报告了双特异性四价受体。在WO2001/077342中报告了具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体。在WO97/001580中报告了多特异性和多价的结合抗原的多肽。WO92/004053报告了同型缀合物，典型地从与相同抗原决定簇结合并且通过合成性交联共价连接的IgG类单克隆抗体制备。在WO91/06305中，其中分泌寡聚物(一般为IgG类)，所述寡聚物具有缔合在一起以形成四价或六价IgG分子的两个或更多个免疫球蛋白单体。在US6,350,860中报告了源自绵羊的抗体和工程化抗体构建体，它们可以用于治疗其中干扰素γ活性致病的疾病。在US2005/0100543中报告了可靶向构建体，它们是双特异性抗体的多价载体，即，可靶向构建体的每个分子可以充当两个或更多个双特异性抗体的载体。在WO95/009917中报告了遗传工程化的双特异性四价抗体。在WO2007/109254中报告了由稳定化scFv组成或包含稳定化scFv的稳定化结合分子。在某些实施方案中，本文提供的抗helicar基序氨基酸序列抗体或如本文所报告的缀合物中的抗helicar基序氨基酸序列抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对helicar基序氨基酸序列并且另一种特异性针对任何其他(非helicar基序氨基酸序列)抗原。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。用于产生多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540，WO93/08829，以及Traunecker,A.等人,EMBOJ.10(1991)3655-3659)和“隆突进入孔穴(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应，用于产生抗体Fc异二聚体分子(WO2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan,M.等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体(diabody)”技术，用于产生双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如描述于，例如，Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)。在一个实施方案中，通过“隆突进入孔穴(knob-into-hole)”技术改变双特异性抗体的重链的CH3结构域，该技术以几个例子详述于，例如，WO96/027011，WO98/050431，RidgwayJ.B.等人,ProteinEng.9(1996)617–621，Merchant,A.M.等人,NatBiotechnol16(1998)677-681。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域中的一个可以是“隆突”，而另一个是“孔穴”。二硫桥的引入使异二聚体稳定(Merchant,A.M,等人,NatureBiotech16(1998)677-681，Atwell,S.等人J.Mol.Biol.270(1997)26–35)并增加产量。在所有方面的一个实施方案中，双特异性抗体特征在于-一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处会合，其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于a)改变一条重链的CH3结构域，从而在一条重链的CH3结构域的初始界面内(该初始界面与双特异性抗体内另一条重链的CH3结构域的初始界面会合)，将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生突出，所述突出可放置于另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴中和b)改变另一条重链的CH3结构域，从而在第二CH3结构域的初始界面内(该初始界面与双特异性抗体内第一CH3结构域的初始界面会合)将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内产生空穴，在所述空穴内可放置第一CH3结构域的界面内的突出。因此，在一个实施方案中，如本文所报告的双特异性抗体特征在于-全长抗体的第一重链的CH3结构域和全长抗体的第二重链的CH3结构域各自在包含改变的界面处会合，所述改变位于抗体CH3结构域之间的初始界面中，其中i)在第一重链的CH3结构域中将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，因而在一条重链的CH3结构域的界面内产生突出，所述突出可放置于另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴中并且其中ii)在第二重链的CH3结构域中将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二CH3结构域的界面内产生空穴，在所述空穴内可放置第一CH3结构域的界面内的突出。在一个实施方案中，具有更大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成的组。在一个实施方案中，具有更小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成的组。在一个实施方案中，两个CH3结构域均通过以下方式进一步改变：引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域的相应位置中的氨基酸，使得两个CH3结构域之间的二硫桥可以形成。在一个实施方案中，双特异性抗体包含位于“隆突链”的CH3结构域中的T366W突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变。也可以使用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M,等人,NatureBiotech16(1998)677-681)，例如，通过向“隆突链”的CH3结构域引入Y349C突变并向“孔穴链”的CH3结构域引入E356C突变或S354C突变(根据Kabat等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的EU索引编号法)。在一个实施方案中，双特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一者中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一个实施方案中，双特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3结构域中的额外Y349C突变和另一个CH3结构域中的额外E356C或S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat的EU索引编号法；(Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest),第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)))。可以备选地或额外地使用如EP1870459A1所描述的其他的隆突进入孔穴技术。因此，关于双特异性抗体的另一个例子是在“隆突链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔穴链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变(根据Kabat的EU索引编号法；(Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest),第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)))。在一个实施方案中，双特异性抗体包含位于“隆突链”的CH3结构域中的T366W突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变以及额外地位于“隆突链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变。在一个实施方案中，双特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3结构域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者双特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3结构域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变以及额外地位于“隆突链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变。CH3结构域中的这类隆突突变和孔穴突变典型地用于SEQIDNO:08、SEQIDNO:09、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11(人IgG1亚类同种异型(高加索人种和非洲裔美国人或突变体L234A/L235A和L234A/L235A/P329G))、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14(人IgG4亚类或突变体S228P、L235E和S228P/L235E/P329G)的人重链恒定区中(根据Kabat等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的EU索引编号法)。在一个实施方案中，双特异性抗体包含SEQIDNO:08、SEQIDNO:09、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、或SEQIDNO:14的人重链恒定区，还包含CH3结构域中的这类“隆突”突变和“孔穴”突变(例如，在两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3结构域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变)(根据Kabat等人,免疫相关的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的EU索引编号法)。在一个实施方案中，双特异性抗体包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的人轻链恒定区。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopusantibody)”(参见，例如US2006/0025576)。本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab(DualActingFab)”或“DAF”，其包含与helicar基序氨基酸序列以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如，参见US2008/0069820)。本文中的抗体或片段也包括在WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792和WO2010/145793中描述的多特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体的第一结合特异性针对helicar基序氨基酸序列并且第二结合特异性针对非helicar基序氨基酸序列的抗原。在一个实施方案中，非helicar基序氨基酸序列的抗原选自白细胞标记物：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD22、CD23、CD27及其配体、CD28及其配体B7.1、B7.2、B7.3、CD29及其配体、CD30及其配体、CD40及其配体gp39、CD44、CD45和同工型、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR；组织相容性抗原：MHCI类或II类、LewisY抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb；整合素：VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3和LFA-1、Mac-1和pl50,95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6和αV627；选择素：L-选择素、P-选择素和E-选择素及其反受体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2和LFA-3；白细胞介素：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15；白细胞介素受体选自由IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R和IL-15R组成的组；趋化因子选自由PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ和IL-8组成的组；生长因子选自由TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGF家族、PDGF家族、内皮素、纤维化蛋白(FSF-1)、人层粘连蛋白和胃泌素释放肽(GRP)、PLGF、HGH、HGHR组成的组；生长因子受体选自由TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R、GCSF-R和其他造血受体组成的组；干扰素受体选自由IFNCαR、IFNβR和IFNλR组成的组；Ig及其受体选自由IgE、FcγRI和FcγRII组成的组；肿瘤抗原选自由her2-neu、黏蛋白、CEA和内皮唾液酸蛋白(endosialin)组成的组；变应原选自由屋尘螨抗原、lolp1(草)抗原和漆酚组成的组；病毒多肽选自由CMV糖蛋白B、H和gCIII、HIV-1包膜糖蛋白、RSV包膜糖蛋白、HSV包膜糖蛋白、HPV包膜糖蛋白、肝炎家族表面抗原(Hepatitisfamilysurfaceantigen)组成的组；毒素选自由假单胞菌(pseudomonas)内毒素和骨桥蛋白(osteopontin)/尿桥蛋白(uropontin)、蛇毒、蜘蛛毒和蜂毒、芋螺毒素组成的组；血液因子选自由补体C3b、补体C4a、补体C4b-9、Rh因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘脂相关生长抑制剂组成的组；并且，酶选自由胆固醇酯转移多肽、膜结合型基质金属蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)组成的组。抗体变体在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善抗helicar基序氨基酸序列抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适当的修饰或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列中缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列内的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体，只要所述最终构建体拥有期望的特征，例如，结合抗原。a)置换变体、插入变体和缺失变体在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的感兴趣位点包括HVR和FR。可以将氨基酸置换引入感兴趣抗体中并且针对期望的活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。表1.氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守性置换将需要这些分类之一的成员交换为另一个分类。一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，为进一步研究所选择的产生的一个或多个变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性方面具有改变(例如，改善)(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)，和/或，将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以便利地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如，本文所述的那些技术)。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并针对特定的生物学活性(例如，结合亲和力)进行筛选。可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如，以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基)(参见，例如，Chowdhury,P.S.,MethodsMol.Biol.207(2008)179-196)和/或SDR(a-CDR)中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。通过构建次级文库并从中重新选择所实现的亲和力成熟已描述于，例如，Hoogenboom,H.R.等人，收录于MethodsinMolecularBiology178(2002)1-37。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。随后创建次级文库。然后，筛选该文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中，若干个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。可以具体鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。尤其经常靶向重链CDR3和轻链CDR3。在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部发生，只要这类改变不实质地降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中做出不实质地降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守置换)。这类改变可以是在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变，或者含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变法”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，残基或靶残基组(例如，带电荷残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定并且被替换为中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为用于置换的候选者而被确定靶向或排除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端的融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括将抗体的N-末端或C-末端与酶(例如，针对ADEPT)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。b)糖基化变体在某些实施方案中，改变本文提供的或包含于如本文所报告的缀合物中的抗体以增加或减少抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创建或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常通过N-连接附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH15(1997)26-32。低聚糖可以包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双天线状低聚糖结构的“茎”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的低聚糖进行修饰以产生具有某些改善的特性的抗体变体。在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的所有糖结构(例如，复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部Asn297处岩藻糖的平均量，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约297位置处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于297位置的上游或下游大约±3个氨基酸附近，即，294和300位置之间，这归因于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US2004/0093621。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；和WO2004/056312，特别是在实施例3处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO2003/085107)。还可以提供具有双分低聚糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子描述于，例如，WO2003/011878；美国专利号6,602,684；和US2005/0123546。还提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于，例如，WO1997/30087；WO1998/58964；和WO1999/22764。c)Fc区变体在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为这样的应用的期望的候选物，在所述应用中，抗体在体内的半寿期是重要的，而某些效应子功能(如，补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)表达Fc(仅RIII)，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology公司MountainView,CA)和非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内(例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656公开的动物模型中)评估感兴趣分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半寿期的测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769))。效应子功能降低的抗体包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括将残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。描述了与FcR结合改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在某些实施方案中，抗体变体包含具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的置换)的Fc区。在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，其导致改变的(即，改善的或削弱的)C1q结合和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，例如，描述于美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184。在US2005/0014934中描述了半寿期增加和与新生Fc受体(FcRn)的结合改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821；以及WO94/29351。d)半胱氨酸工程化抗体变体在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程化抗体，例如，“巯基单抗(thioMAb)”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，被置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，反应性巯基由此被安置在抗体的可及位点处并且可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如在美国专利号7,521,541中所述产生。e)抗体衍生物在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并且易于获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三氧杂环己烷(poly-1,3,6-trioxane)、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑确定，包括，但不限于，待改善的抗体特定性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗，等等。在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至这样的温度，在该温度下，邻近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死。含有helicar基序氨基酸序列的化合物如本文所报告的缀合物中的helicar基序氨基酸序列可以缀合至治疗剂(药物)、细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像或放疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽、或者另一种碳水化合物或亲脂性剂。这样的缀合物命名为含有helicar基序的化合物。缀合可以直接进行或经由间插的接头进行。a)治疗剂缀合物的治疗剂(药物)可以是具有细胞毒作用或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团。药物部分包括：(i)可以充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂的化疗剂；(ii)可以以酶促方式发挥作用的蛋白毒素；和(iii)放射性同位素。示例性治疗剂包括，但不限于，美坦生类、澳瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀、单端孢霉烯族化合物、CC1065、刺孢霉素和其他烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。蛋白毒素包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链(Vitetta等人(1987)Science,238:1098)、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物(WO93/21232)。治疗性放射性同位素包括32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb和Lu的放射性同位素。放射性同位素或其他标记物可以按已知方式掺入(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57；\MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy\Chatal,CRCPress1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至复合物的示例性螯合剂(WO94/11026)。b)标记物含有helicar基序氨基酸序列的化合物可以是含有附加标记物部分的含有helicar基序氨基酸序列的化合物。能够使用可以与helicar基序氨基酸序列共价连接的任何标记物部分(参见，例如，Singh等人(2002)Anal.Biochem.304:147-15；HarlowE.和Lane,D.(1999)UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.；LundbladR.L.(1991)ChemicalReagentsforProteinModification,第2版.CRCPress,BocaRaton,Fla.)。标记物可以发挥以下作用：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以调整第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，以产生FRET(荧光共振能量转移)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率，例如，电泳迁移率或细胞通透性，或(iv)提供捕获部分，例如，以调节离子络合。如本文所报告的包含helicar基序氨基酸序列并含有标记物的缀合物可以用于诊断测定法中，例如，用于检测特定细胞、组织或血清中感兴趣抗原的表达。对于诊断性应用，将使用其中第一结合特异性与靶结合并且第二结合特异性与含有helicar基序氨基酸序列的标记物结合的双特异性抗体。helicar基序氨基酸序列通常将用可检测部分标记。许多标记物是可用的，它们通常可以划分成以下类别：(a)放射性同位素(放射性核素)，如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。放射性同位素标记的缀合物在受体靶向的成像实验中是有用的。使用在CurrentProtocolsinImmunology,(1991)第1卷和第2卷,Coligen等人,编著Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,Pubs中描述的技术，helicar基序氨基酸序列可以用结合、螯合或以其他方式络合放射性同位素金属的配体试剂标记。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,Tex.)。放射性核素可以通过用如本文所报告的复合物复合进行靶向(Wu等人,NatureBiotechnology23(9)(2005)1137-1146)。采用放射性核素标记复合物的受体靶成像法可以通过对复合物或相应的治疗性抗体在肿瘤组织中的进行性积累进行检测和定量而提供途径活化的标记(Albert等人(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。适合作为成像实验用标记物的金属-螯合物复合物(US2010/0111856；US5,342,606；US5,428,155；US5,316,757；US5,480,990；US5,462,725；US5,428,139；US5,385,893；US5,739,294；US5,750,660；US5,834,456；Hnatowich等人,J.Immunol.Methods65(1983)147-157；Meares等人,Anal.Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh等人,BioconjugateChem.1(1990)59-65；Meares等人,J.Cancer(1990),Suppl.10:21-26；Izard等人,BioconjugateChem.3(1992)346-350；Nikula等人,Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90；Camera等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等人,J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110；Verel等人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera等人,J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等人,CancerRes.50(1990)4221-4226；Verel等人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee等人,CancerRes.61(2001)4474-4482；Mitchell等人,J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi等人BioconjugateChem.10(1999)103-111；Miederer等人,J.Nucl.Med.45(2004)129-137；DeNardo等人,ClinicalCancerResearch4(1998)2483-90；Blend等人,CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals18(2003)355-363；Nikula等人J.Nucl.Med.40(1999)166-76；Kobayashi等人,J.Nucl.Med.39(1998)829-36；Mardirossian等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74；Roselli等人,CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。(b)荧光标记物，如稀土螯合物(铕螯合物)，荧光素型，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；得克萨斯红；及其类似物。荧光标记物可以使用例如在上文的CurrentProtocolsinImmunology中公开的技术与helicar基序氨基酸序列缀合。荧光染料和荧光标记物试剂包括商业上可购自Invitrogen/MolecularProbes(Eugene,Oregon,USA)和PierceBiotechnology公司(Rockford,Ill.)的那些。检测标记物如荧光染料和化学发光染料(Briggs等人\SynthesisofFunctionalisedFluorescentDyesandTheirCouplingtoAminesandAminoAcids,\J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测信号，并且通常适用于标记，特别具有以下特性：(i)标记的缀合物应当在低背景的同时产生极高信号，从而可以在无细胞和基于细胞的测定法中灵敏地检测到少量缀合物；和(ii)标记的缀合物应当是光稳定的，从而可以观察、监测并记录荧光信号，而没有明显的光漂白。对于涉及标记的缀合物与膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物应当(iii)具有良好的水溶性以实现有效的缀合物浓度和检测灵敏度并且(iv)对活细胞无毒，从而不破坏细胞的正常代谢过程或造成过早细胞死亡。(c)多种酶-底物标记物是可获得或公开的(参见，例如，US4,275,149)。酶通常催化生色底物的化学改变，其中可以使用多种技术测量所述化学改变。例如，酶可以催化底物中可以按分光光度形式测量的颜色变化。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物因化学反应被电子激发并且可以随后发射可测量(例如，使用化学发光计)的光或馈赠能量至荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于酶与多肽缀合的技术描述于O'Sullivan等人\MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay\,收录于MethodsinEnzym.(由J.Langone和ITVanVunakis编著),AcademicPress,NewYork,73(1981)147-166。酶-底物组合的例子(US4,275,149；US4,318,980)包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(HRP)和作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。如本文所报告的标记的缀合物可以用于任何已知的测定方法中，如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法、以及免疫沉淀测定法(Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques(1987)第147-158页,CRCPress公司)。如本文所报告的标记的缀合物由生物医学成像和分子成像的多种方法和技术用作成像性生物标记和探针，如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计算机断层扫描)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层扫描)；(iv)PET(正电子发射断层扫描)Tinianow,J.等人NuclearMedicineandBiology,37(3)(2010)289-297；Chen等人,BioconjugateChem.15(2004)41-49；US2010/0111856；(v)生物发光法；(vi)荧光法；和(vii)超声法。免疫闪烁照相术是一种成像方法，其中将放射性物质标记的缀合物施用至动物或人患者并且拍摄身体内缀合物存在的部位的画面(US6,528,624)。成像性生物标记物可以客观地测量并且作为正常生物学过程、发病过程或对治疗性干预的药理学反应的指示物进行评价。生物标记物可以具有几个类型：0型标记物是疾病的自然历史标记物并且与已知的临床指标纵向相关，例如，类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评估；I型标记物根据作用机制捕获干预的效果，即便该机制可能与临床结局不相关；II型标记物充当替代终点，其中生物标记物的变化或来自生物标记物的信号预测出使靶向反应“生效”的临床益处，如通过CT测量的类风湿性关节炎中的骨侵蚀。成像性生物标记物因而可以提供关于以下方面的药效动力学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达、(ii)治疗剂与靶蛋白的结合(即选择性)、和(iii)清除率和半寿期药物代谢动力学数据。相对于基于实验室的生物标记物而言，体内成像性生物标记物的优点包括：非侵入性治疗、可定量、全身评估、重复给药和评估(即多个时间点)和从临床前(小动物)至临床(人类)结果的潜在可转换效果。对于一些应用，生物成像法取代了临床前研究中的动物实验或使其数量最小化。肽标记方法是公知的。参见Haugland(2003)MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,MolecularProbes公司；Brinkley(1992)BioconjugateChem.3:2；Garman,(1997)Non-RadioactiveLabeling:APracticalApproach,AcademicPress,London；Means(1990)BioconjugateChem.1:2；Glazer等人ChemicalModificationofProteins.LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology(T.S.Work和E.Work编著)AmericanElsevierPublishingCo.,NewYork；Lundblad,R.L.和Noyes,C.M.(1984)ChemicalReagentsforProteinModification,第I卷和第II卷,CRCPress,NewYork；Pfleiderer,G.(1985)\ChemicalModificationofProteins\,ModernMethodsinProteinChemistry,H.Tschesche编著,WalterDeGruyter,BerlinandNewYork；以及Wong(1991)ChemistryofProteinConjugationandCross-linking,CRCPress,BocaRaton,Fla.)；DeLeon-Rodriguez等人,Chem.Eur.J.10(2004)1149-1155；Lewis等人,BioconjugateChem.12(2001)320-324；Li等人,BioconjugateChem.13(2002)110-115；Mier等人BioconjugateChem.16(2005)240-237。抗体缀合物在如本文所报告的缀合物中的抗体还可以缀合(如果它本身不是所述分子之一)至治疗剂(药物)、细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像或放疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽、或者另一种碳水化合物或亲脂性剂。免疫缀合物本发明还提供免疫缀合物，所述缀合物包含如本文所报告的抗体或如本文所报告的与一种或多种细胞毒性剂(如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素)缀合的缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(参见US5,208,020、US5,416,064和EP0425235B1)；澳瑞司他汀，如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US5,635,483、US5,780,588和US7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(参见US5,712,374、US5,714,586、US5,739,116、US5,767,285、US5,770,701、US5,770,710、US5,773,001和US5,877,296；Hinman,L.M.等人,CancerRes.53(1993)3336-3342；以及Lode,H.N.等人,CancerRes.58(1998)2925-2928)；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz,F.等人,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters12(2002)1529-1532；King,H.D.等人,J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物；以及CC1065。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体或如本文所报告的复合物，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体或如本文所报告的与放射性原子缀合以形成放射缀合物的复合物。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，MRI)，如碘-123(再次的)、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可以使用多种双官能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari,R.V.等人,CancerRes.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。免疫缀合物或ADC在本文中明确考虑，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括，但不限于，可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自PierceBiotechnology公司,Rockford,IL.,U.S.A)。接头术语“接头”指可用于将抗体或helicar基序氨基酸序列与其他化合物诸如可检测的标记物或药物缀合(连接)的双官能或多官能部分。可以使用具有与其他化合物和与helicar基序氨基酸序列结合的反应功能性的接头便利地制备helicar基序氨基酸序列缀合物。在一个实施方案中，接头具有反应位点，所述反应位点具有与helicar基序氨基酸序列或抗体或其他化合物上存在的亲核基团反应的亲电基团。例如半胱氨酸巯基与接头上的亲电基团反应并且与接头形成共价键。有用的亲电基团包括，但不限于，另一个巯基、马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团(参见例如在Klussman等人，BioconjugateChemistry15(4)(2004)765-773的第766页处的缀合方法)。巯基反应性官能团的例子包括，但不限于，巯基、马来酰亚胺、α-卤代乙酰基、活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。接头可以包含将抗原(helicar基序氨基酸序列)与有效负载连接的氨基酸残基。氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括天然存在的那些以及非天然存在的氨基酸类似物，如，举例来说，瓜氨酸或β-氨基酸，如，举例来说，β-丙氨酸，或ω-氨基酸如4-氨基-丁酸。在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，所述反应性官能团具有与helicar基序氨基酸序列或抗体(抗helicar基序氨基酸序列抗体)上存在的亲电基团反应的亲核基团。有用的亲电基团包括，但不限于，醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与helicar基序氨基酸序列或抗体上的亲电基团反应并与抗原(helicar基序氨基酸序列)或抗体形成共价键。接头上有用的亲核基团包括，但不限于，酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。抗原(helicar基序氨基酸序列)上的亲电基团为附接至接头提供了便利位点。典型地，肽类接头可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可以例如根据肽化学领域公知的液相合成方法制备(E.Schroder和K.Lubke\ThePeptides\,第1卷(1965)76-136,AcademicPress)。在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解度或反应性的基团替换。例如，带电取代基如磺酸盐(SO3-)或铵或聚合物如PEG，可以增加试剂的水溶解度并且促进接头试剂与抗原(helicar基序氨基酸序列)或药物部分的偶联反应，或根据所用的合成途经，促进偶联反应。明确构思了如本文所报告的包含药物或标记物的缀合物，但是不限于用以下接头试剂制备的复合物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，并且包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们从PierceBiotechnology公司可商业获得。双马来酰亚胺试剂允许例如巯基以依次或同时的方式与含巯基的药物部分、标记物或接头中间体附接。除马来酰亚胺之外，与例如巯基反应的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。示例性接头包括具有马来酰亚胺伸张物和对氨基苄基氨甲酰基(PAB)自毁性间隔物的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂和具有马来酰亚胺伸张物单元和对氨基苄基自毁性间隔物的phe-lys(Mtr)二肽接头试剂。半胱氨酸巯基是亲核的，并且，通过硫化物交换，能够与接头试剂和含有helicar基序的化合物上的亲电基团反应以形成共价键，包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基；和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物。含有helicar基序的化合物上的亲核基团包括，但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼基。III.核酸可以通过本领域已知的多种方法来制备编码如本文报告的抗体或如包含于如本文所报告的缀合物中的化合物或化合物的部分的氨基酸序列的DNA。这些方法包括，但不限于，通过定点(或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和盒诱变早先制备的编码所述多肽的DNA来制备。重组抗体的变体也可以通过限制性片段操作或通过采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR来构建。诱变引物编码一个或多个半胱氨酸密码子替换。标准诱变技术可以用来产生编码此类经修饰工程化抗体的DNA。一般指导可以在Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989；和Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork,N.Y.,1993中找到。IV.表达和纯化可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如US4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗体的分离核酸。这类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供一个或多个包含这类核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这类核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生如本文所报告的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。为了重组产生如本文所报告的抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这类核酸可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US5,648,237、US5,789,199和US5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,收录于：MethodsinMolecularBiology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人,J.GenVirol.36(1977)59-74中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤(MMT060562)；如在例如Mather,J.P.等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的TRI细胞；MRC5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.,MethodsinMolecularBiology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),第255-268页。V.用于诊断和检测的方法和组合物在某些实施方案中，如本文所报告的任一种抗体、尤其双特异性抗体和缀合物，可用于检测生物样品中一个或多个靶分子的存在。如本文所使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在一个实施方案中，生物样品包括细胞或组织。在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的如本文所报告的抗体或缀合物。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文所报告的抗体或缀合物在允许该抗体或缀合物与靶结合的条件下接触，并且检测该抗体或缀合物与靶之间是否形成复合物。这类方法可以是体外或体内方法。在某些实施方案中，提供标记的抗体或缀合物。标记物包括，但不限于，直接检测的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及间接检测(例如，借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如，酶或配体。示例性标记物包括，但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/亲和素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。VI.药物制剂通过以下方式制备如本文所报告的抗体或缀合物的药物制剂：将具有所需纯度的这类抗体或缀合物与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体在所用的剂量和浓度上对接受者通常是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂(如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(如聚(乙烯吡咯烷酮))；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他糖(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(如EDTA)；糖(如蔗糖、甘露糖醇(mannitol)、海藻糖或山梨糖醇(sorbitol))；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20BaxterInternational公司)。在US专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。在US6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括在US6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-醋酸盐缓冲剂。本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地含有这些有效成分，它们具有不会对彼此产生不利影响的互补活性。这类有效成分以对于预期目的有效的量适宜地存在于组合中。有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或者通过界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳状液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.(编著)(1980)。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体或缀合物的固态疏水性聚合物半透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。要用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以例如通过借助无菌滤膜过滤容易地实现。VII.治疗方法和组合物本文中报告的任何抗体或缀合物可以用于治疗方法中。在一个方面，提供用作药物的如本文所报告的抗体或缀合物。在其他方面，提供用于治疗疾病的如本文所报告的抗体或缀合物。在某些实施方案中，提供如用于治疗方法中的本文所报告的抗体或缀合物。在某些实施方案中，本发明提供如本文所报告的抗体或缀合物，其用于治疗个体的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文所报告的抗体或缀合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文所述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供如本文所报告的抗体或缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文所述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的如本文所报告的抗体或缀合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如下文所述的至少一种额外的治疗剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供了包含如本文所报告的任何抗体或缀合物的药物制剂，例如，用于上述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含如本文所报告的任何抗体或缀合物，以及可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含如本文所报告的任何抗体或缀合物和至少一种额外的治疗剂，例如，如下文所述。如本文所报告的抗体和缀合物可以在治疗中单独使用或与其他活性剂组合使用。例如，如本文所报告的抗体或缀合物可以与至少一种额外的治疗剂共施用。上文所示的这类联合治疗涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后进行。如本文所报告的抗体和缀合物也可以与放射疗法组合使用。如本文所报告的抗体或缀合物(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果希望局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、推注施用和脉冲输注。如本文所报告的抗体或缀合物将以符合良好的医学实践的方式配制、给药和施用。关于这一点，考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、递送药剂的部位、施用方法、施用计划和执业医师已知的其他因素。该抗体或缀合物不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药剂的有效量取决于在该制剂中存在的抗体或缀合物的量、疾病类型或疗法、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量并且采用如本文所述的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。为了预防或治疗疾病，如本文所报告的抗体或缀合物的适宜剂量(当单独使用或与一种或多种其他的额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体或缀合物的类型、疾病的严重性和过程、抗体或缀合物是否出于预防或治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床史和对缀合物的反应、以及主治医师的判断。将抗体或缀合物适当地按一次或经过一系列治疗施用给患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)抗体或缀合物可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。一个典型的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提到的因素。对于在几天或更长时间范围内重复施用，取决于病情，治疗通常将持续直至期望的疾病症状抑制作用出现。抗体或缀合物的一个示例性剂量的范围将是约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，从而患者接受约2个至约20个剂量的缀合物，或例如约6个剂量的抗体)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。应当理解，可以使用本发明的免疫缀合物代替或附加至如本文所报告的抗体或缀合物来实施上述制剂或治疗方法中的任何一种。VIII.制品在本发明的另一个方面，提供一种制品，所述制品含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的物质。该制品包括容器和在该容器上或与之相关的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一个活性剂是如本文所报告的抗体或复合物。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的病症。另外，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含如本文所报告的抗体或复合物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或以其他方式治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品还可以包含指示组合物可以用于治疗特定病症的包装说明书。备选地或额外地，该制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点来看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。应当理解，前述制品中的任何一种可以包含本发明的免疫缀合物以代替或附加至如本文所报告的抗体或缀合物。IX.具体实施方案1.缀合物，其包括，含有helicar基序氨基酸序列的化合物，以及，与所述helicar基序氨基酸序列特异性结合的抗体，其特征在于所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物和抗helicar抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。2.缀合物，其包括，含有helicar基序氨基酸序列的化合物，以及，与所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的helicar基序氨基酸序列特异性结合的抗体(抗helicar基序氨基酸序列抗体)，其特征在于所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物和所述抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。3.根据项目1至2中任一项的缀合物，其特征在于，所述CDR2是轻链CDR2。4.根据项目1至3中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列具有氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)或者是一个氨基酸残基被改变为半胱氨酸的其变体。5.根据项目1至4中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列具有氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)，其中三个C-末端氨基酸残基中的一个氨基酸残基被改变为半胱氨酸。6.根据项目1至5中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列具有氨基酸序列AHLENEVARCKK(SEQIDNO:02)或AHLENEVARLCK(SEQIDNO:03)。7.根据项目1至6中任一项的缀合物，其特征在于，所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物包括helicar基序氨基酸序列、任选地接头和有效载荷。8.根据项目1至7中任一项的缀合物，其特征在于，所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物是包含helicar基序氨基酸序列的多肽，所述helicar基序氨基酸序列融合至多肽的末端之一或在多肽序列内融合。9.根据项目1至8中任一项的缀合物，其特征在于，所述共价键在所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物和所述抗体的CDR2中的氨基酸残基之间。10.根据项目1至9中的任一项的缀合物，其特征在于，所述共价键在所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的官能团和所述抗体的CDR2中的氨基酸残基之间。11.根据项目1至10中任一项的缀合物，其特征在于，所述官能团在所述helicar基序氨基酸序列中。12.根据项目1至11中任一项的缀合物，其特征在于，所述共价键在抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基和含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的官能团之间。13.根据项目12的缀合物，其特征在于，根据Kabat的轻链可变结构域编号，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置或第51位置处。14.根据项目12至13中任一项的缀合物，其特征在于，根据Kabat的轻链可变结构域编号，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置处。15.根据项目1至14中任一项的缀合物，其特征在于，所述共价键是二硫键。16.根据项目15的缀合物，其特征在于，所述二硫键在helicar基序氨基酸序列中的半胱氨酸残基和抗helicar抗体的轻链的CDR2中的半胱氨酸残基之间。17.根据项目1至16中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列具有SEQIDNO:02的氨基酸序列。18.根据项目1至17中任一项的缀合物，其特征在于，所述抗体是双特异性抗体，其包括针对非helicar抗原的第一结合特异性和针对helicar基序氨基酸序列的第二结合特异性。19.根据项目18的缀合物，其特征在于，所述(非helicar)抗原是细胞表面抗原.20.根据项目19的缀合物，其特征在于，所述细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。21.根据项目18至20中任一项的缀合物，其特征在于，所述双特异性抗体是这样的全长抗体，在其一个或两个重链C-末端已直接或经由肽接头融合有scFv或dsscFv或scFab或dsscFab或它们的组合。22.根据项目18至21中任一项的缀合物，其特征在于，所述双特异性抗体是全长抗体。23.根据项目18至22中任一项的缀合物，其特征在于，所述双特异性抗体的一条重链包含孔穴突变并且相应的另一条链包含隆突突变。24.根据项目7至23中任一项的缀合物，其特征在于，所述有效载荷选自结合部分、标记部分和生物活性部分。25.根据项目1至24中任一项的缀合物，其特征在于，所述抗体是全长抗体。26.根据项目1至25中任一项的缀合物，其特征在于，所述抗体是人源化抗体或人抗体。27.根据项目1至26中任一项的缀合物，其特征在于，所述抗体的恒定区是IgG1亚类或IgG4亚类。28.根据项目1至27中任一项的缀合物，其特征在于，所述抗体具有IgG1亚类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，其在第234和235位置处具有丙氨酸并且在第329位置处具有甘氨酸。29.根据项目1至27中任一项的缀合物，其特征在于，所述抗体具有IgG4类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，其具有在第228位置处的脯氨酸、在第235位置处的谷氨酸和在第329位置处的甘氨酸。30.根据项目1至24中任一项的缀合物，其特征在于，在该实施方案中所述抗体是抗体片段。31.根据项目30的缀合物，其特征在于，所述片段是Fab或(Fab)2。32.根据项目1至31中任一项的缀合物，其特征在于，所述缀合物确切地包含一个共价键每条轻链CDR2。33.根据项目1至32中任一项的缀合物，其特征在于，所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物包含这样的反应基团，所述反应基团可以与抗体的CDR2中的半胱氨酸残基的巯基形成共价键。34.根据项目1至33中任一项的缀合物，其特征在于，所述反应基团是巯基、或马来酰亚胺、或卤代乙酰基。35.根据项目1至34中任一项的缀合物，其特征在于，所述共价键是二硫键。36.根据项目35的缀合物，其特征在于，所述二硫键在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。37.根据项目1至36中任一项的缀合物，其特征在于，所述缀合物包含治疗部分或可检测部分。38.根据项目37的缀合物，其特征在于，将所述治疗部分或可检测部分共价缀合至helicar基序氨基酸序列或者将所述helicar基序氨基酸序列并入所述治疗部分或可检测部分。39.根据项目1至38中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列缀合至由5至500个氨基酸残基组成的多肽。40.根据项目39的缀合物，其特征在于，所述多肽包含10至450个氨基酸残基。41.根据项目39至40中任一项的缀合物，其特征在于，所述多肽包含12至450个氨基酸残基。42.根据项目39至41中任一项的缀合物，其特征在于，所述多肽包含15至400个氨基酸残基。43.根据项目1至42中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列缀合至可检测标记物。44.根据项目1至43中任一项的缀合物，其特征在于，所述helicar基序氨基酸序列经由接头缀合至多肽，或缀合至可检测标记物，或缀合至有效载荷。45.根据项目44的缀合物，其特征在于，所述接头是非肽接头。46.根据项目44的缀合物，其特征在于，所述接头是肽接头。47.抗helicar抗体，所述抗体在轻链中具有CDR2中的半胱氨酸残基，其中CDR根据Kabat来确定。48.根据项目47的抗helicar抗体，其特征在于，根据Kabat的轻链可变结构域编号，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置或第51位置处。49.根据项目47至48中任一项的抗helicar抗体，其特征在于，根据Kabat的轻链可变结构域编号，抗体的轻链CDR2中的半胱氨酸残基在第55位置处。50.根据项目47至49中任一项的抗helicar抗体，其特征在于，所述抗体确切地在一个重链可变结构域中第55位置处或第51位置处具有半胱氨酸残基。51.根据项目47至50中任一项的抗helicar抗体，其特征在于，所述抗体是人源化抗体或人抗体。52.根据项目47至51中任一项的抗helicar抗体，其特征在于，所述抗体是全长抗体、或Fab、或scFv、或与Fc区缀合的scFv。53.根据项目47至52中任一项的抗helicar抗体，其特征在于，半胱氨酸与孤立的半胱氨酸残基或孤立的同型半胱氨酸残基形成二硫键。54.免疫缀合物，其包含根据项目1至46中任一项的缀合物，以及细胞毒性剂。55.药物制剂，其包含根据项目1至46中任一项的缀合物，以及可药用载体。56.用作药物的根据项目1至46中任一项的缀合物。57.用于治疗癌症的根据项目1至46中任一项的缀合物。58.用于治疗糖尿病的根据项目1至46中任一项的缀合物。59.用于治疗肥胖症的根据项目1至46中任一项的缀合物。60.用于治疗炎性疾病的根据项目1至46中任一项的缀合物。61.用于治疗代谢性疾病的根据项目1至46中任一项的缀合物。62.用于治疗病毒性疾病的根据项目1至46中任一项的缀合物。63.根据项目1至46中任一项的缀合物在制造药物中的用途。64.根据项目1至46中任一项的缀合物作为诊断剂的用途。65.包含治疗性多肽的根据项目1至46中任一项的缀合物增加所述治疗性多肽的稳定性的用途。66.包含治疗性多肽的根据项目1至46中任一项的缀合物增加所述治疗性多肽的活性的用途。67.包含治疗性多肽的根据项目1至46中任一项的缀合物增加所述治疗性多肽的体内半寿期的用途。68.根据项目1至46中任一项的缀合物在治疗疾病中的用途。69.治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据项目1至46中任一项的缀合物。70.治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据项目1至46中任一项的缀合物。71.根据项目68至70中任一项的方法，其特征在于，所述疾病是癌症。72.根据项目68至70中任一项的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病。73.根据项目68至70中任一项的方法，其特征在于，所述疾病是肥胖症。74.产生根据项目1至46中任一项的缀合物的方法，所述方法包括组合包含第一反应基团的抗helicar抗体和具有第二反应基团的含有helicar基序氨基酸序列的化合物，其中携带第一反应基团的氨基酸残基的α碳原子与融合接头的含有helicar基序氨基酸序列的化合物的原子相距约10至11埃。75.产生根据项目1至46中任一项的缀合物的方法，所述方法包括以下步骤-在溶液中将特异性结合至helicar基序氨基酸序列并且在CDR2中的一个氨基酸残基处包含反应基团的抗helicar抗体与包含反应基团的含有helicar基序氨基酸序列的化合物组合，其中含有helicar基序氨基酸序列的化合物包含有效载荷，如由5至500个氨基酸组成的肽或可检测标记物，和-从溶液中回收缀合物。76.用于产生抗helicar抗体的方法，所述抗helicar抗体用于形成根据项目1至46中任一项的缀合物，所述方法包括以下步骤-培养包含编码抗helicar抗体的核酸的细胞，和-从细胞或培养基中回收抗helicar抗体，其中在所述抗helicar抗体中，将轻链CDR2中的残基突变成半胱氨酸，所述半胱氨酸在所述抗helicar抗体和所述含有helicar基序氨基酸序列的化合物的非共价复合物的X射线结构中，在抗体CDR2中的氨基酸残基的α-碳原子和含有helicar基序氨基酸序列的化合物原子的原子之间(将要在这两者之间形成共价键)具有10至11埃的距离。77.用于鉴定抗helicar抗体CDR2中位置的方法，其中所述位置可以突变成半胱氨酸，用于在抗体CDR2中的残基和结合的含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间形成共价键，所述方法包括以下步骤-提供抗helicar抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物的非共价复合物的晶体结构，和-在抗helicar抗体的CDR2中和在含有helicar基序氨基酸序列的化合物中鉴定这样的氨基酸残基，所述氨基酸残基在抗体CDR2中的氨基酸残基的α-碳原子和含有helicar基序氨基酸序列的化合物中的原子之间具有10至11埃距离，其中，鉴定的位置是抗体CDR2中这样的位置，所述位置可以突变成半胱氨酸，用于在抗体CDR2中的残基和结合的含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间形成共价键。78.用于靶向递送含有helicar基序氨基酸序列的化合物至靶细胞的双特异性抗helicar抗体，其中所述双特异性抗体包含与含有helicar基序氨基酸序列的化合物特异性结合的第一结合位点和与靶细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性。本文引用的所有参考文献的公开内容在此通过引用并入本文。提供以下实施例、附图和序列，以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。应当理解，可以在所阐述的方法中作出修改而不脱离本发明的精神。实施例对于如在下面的实施例中使用的抗半抗原抗体和半抗原化化合物的氨基酸序列、合成和纯化，请参见WO2014/006124。实施例1重组人源化抗生物素抗体与生物素标记的化合物(半抗原化化合物)的结合为了确定人源化过程和后续引入半胱氨酸突变是否产生保留完整结合活性的衍生物，进行以下实验。使用OctetQK仪(Fortebio公司)，通过生物双层干涉测量(BLI)技术分析重组抗生物素抗体衍生物的结合特性。该系统是完善的用于研究分子相互作用的系统。BLi技术基于测量从生物传感器尖端和内参的表面反射的白光的干涉图案。分子与生物传感器尖端的结合导致可以测量的干涉图案偏移。为了分析上文描述的人源化过程是否削弱抗生物素抗体与生物素结合的能力，将嵌合形式和人源化形式的抗体的特性就它们与生物素化蛋白质结合的能力直接比较。通过在抗huIgGFc抗体捕获(AHC)生物传感器上(Fortebio公司)捕获抗生物素抗体进行结合研究。首先，在20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中浓度为0.5mg/ml的抗体溶液中孵育生物传感器1分钟。此后，将生物传感器在pH7.4的1×PBS中孵育1分钟以达到稳定基线。通过在20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中含有浓度为0.06mg/ml的生物素化蛋白质的溶液中孵育抗体包被的生物传感器5分钟来测量结合。在pH7.4的1×PBS中监测解离5分钟。直接比较嵌合抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体的所得结合曲线。与嵌合抗体相比，人源化形式的抗体显示相等或甚至更好的生物素化抗原结合。在Kabat位置VH53处具有Cys突变的人源化抗体也是如此。生物素化的蛋白质显示与生物传感器的残余非特异性结合，生物传感器用不结合生物素的赫赛汀(Herceptin)包被时，这种结合减少。因此，抗生物素抗体的功能保留在其人源化变体中(其由如SEQIDNO:19和20、SEQIDNO:21和22中所述的序列限定)。表面等离子体共振在T200仪器(GEHealthcareBiosciencesAB,Sweden)上在25℃进行表面等离子体共振测量。通过使用GEHealthcare供应的标准胺偶联试剂盒(BR-1000-50)在pH5.0在CM3芯片(GEHealthcare,BR-1005-36)上偶联来自人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39，GEHealthcareBiosciencesAB,Sweden)的约4300共振单位(RU)捕获系统(10μg/ml抗人捕获物(IgGFc)。用于胺偶联的运行缓冲液是HBS-N(10mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl,GEHealthcare,BR-1006-70)。用于以下结合研究的运行和稀释缓冲液是pH7.4的PBS-T(包含0.05％Tween20的10mM磷酸盐缓冲盐水)。通过以流速5μL/分钟注射2nM溶液60秒捕获人源化抗生物素抗体。将生物素化的siRNA用PBS-T稀释为0.14-100nM的浓度(1:3稀释系列)。通过以流速30μl/分钟注射每个浓度180秒，解离时间600秒，测量结合。通过用3MMgCl2溶液以流速5μL/分钟洗涤30秒使表面再生。使用BIA评价软件(GEHealthcareBiosciencesAB,Sweden)评价数据。通过扣减从抗人IgGFc表面获得的响应，校正主体折射率差异。还扣减空白注射(＝双参考)。为了计算KD和动力学参数，使用Langmuir1:1模型。通过表面等离子体共振(SPR)对人源化抗生物素抗体SEQIDNO:19和20和人源化抗生物素抗体VH53CSEQIDNO:21和22实施动力学结合分析。通过与CM3传感器芯片结合的抗人IgGFc抗体捕获2nM浓度的抗生物素抗体。在浓度0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、100和300nM处记录生物素化siRNA(Mw：13868Da)的结合。一式两份实施测量。人源化抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体VH53C的所计算的KD分别是0.633nM和0.654nM。实施例2产生半抗原化化合物与抗半抗原抗体的非共价复合物一般方法：抗半抗原抗体与半抗原化化合物(＝与有效载荷缀合的半抗原)的复合物的产生应当导致确定的复合物并且应当确保这些复合物中的化合物(＝有效载荷)保留其活性。为了产生半抗原化化合物与相应的抗半抗原抗体的复合物，将半抗原化化合物溶解于H2O中至终浓度为1mg/ml。将抗体在20mM组氨酸缓冲液，140mMNaCl，pH＝6.0中浓缩至终浓度为1mg/ml(4.85μM)。通过上下抽吸将半抗原化的有效载荷和抗体按2:1摩尔比(化合物对抗体)混合并在室温下孵育15分钟。备选地，将半抗原化化合物溶解于100％DMF中至终浓度为10mg/ml。将抗体在50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2中浓缩至终浓度为10mg/ml。通过上下抽吸将半抗原化化合物和抗体按2.5:1摩尔比(化合物对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的复合物——非共价洋地黄毒苷-Cy5复合物的示例性方法使用人源化和鼠抗洋地黄毒苷抗体或双特异性抗洋地黄毒苷抗体衍生物作为抗体组分。为了产生洋地黄毒苷化Cy5与抗洋地黄毒苷抗体的复合物，将Cy5-洋地黄毒苷缀合物溶解于PBS中至终浓度为0.5mg/ml。抗体以缓冲液中1mg/ml(约5μM)的浓度使用，所述缓冲液由20mM组氨酸和140mMNaCl，pH6组成。将洋地黄毒苷化Cy5和抗体按2:1摩尔比(洋地黄毒苷化Cy5对抗体)混合。这个过程产生组合确定的复合物的均一制备物。可以通过在尺寸排阻柱上确定抗体缔合的荧光团的荧光(650/667nm)监测复合反应。这些实验的结果显示，复合仅在抗体含有洋地黄毒苷结合特异性时发生。无洋地黄毒苷结合特异性的抗体不结合洋地黄毒苷-Cy5缀合物。可以对二价抗洋地黄毒苷抗体观察到增加的信号直至洋地黄毒苷-Cy5缀合物对抗体的比率为2:1。此后，组合物依赖性荧光信号达到平台。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的复合物——生物素-Cy5/嵌合抗生物素抗体(人IgG亚类)复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化(cysteinylated)接头的生物素衍生化-Cy5(生物素-Cys-Cy5)的复合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗体以缓冲液中10.1mg/ml(约69μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。如实施例3a中所述，通过SDS-PAGE分析所产生的缀合物。如实施例3a中所述实施荧光的检测。用于形成生物素化荧光染料和抗生物素抗体缀合物——生物素-Ser-Cy5/人源化抗生物素抗体的示例性方法：为了产生在接头内部含有丝氨酸残基的生物素衍生化-Cy5(生物素-Ser-Cy5)的复合物，将0.61mg生物素-Ser-Cy5溶解于20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中至浓度为10mg/ml。18.5mg人源化抗生物素抗体以缓冲液中10mg/ml(约69μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将生物素-Ser-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(生物素-Ser-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。随后使用Superdex20016/60高载量制备级柱(GEHealthcare)以流速1.5ml/分钟并且以20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0作为流动相，对样品进行尺寸排阻层析。收集峰级分并通过SDS-PAGE分析纯度。通过以下方式计算染料对抗体比：(1)在波长280nm(蛋白质)和650nm(Cy5)处测量样品的吸光度；(2)使用以下公式：标记的蛋白质的A650/ε(Cy5)*蛋白质浓度(M)＝摩尔染料/摩尔蛋白质，其中ε(Cy5)＝250000M-1cm-1，复合物的A650＝47.0并且蛋白质浓度是86.67μM。所得的染料对抗体分子的比值是2.17，这表明所有抗体互补位均以生物素-Cy5分子饱和。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——洋地黄毒苷-PYY(3-36)/抗洋地黄毒苷抗体复合物的示例性方法为了产生洋地黄毒苷化多肽与抗洋地黄毒苷抗体的非共价复合物，将鼠杂交瘤衍生的抗体(来自10mMKPO4，70mMNaCl；pH7.5的冻干物)溶解于12ml水中并针对包含20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0的溶液透析以在11ml缓冲液中产生300mg(2×10-6mol)(c＝27.3mg/ml)。将洋地黄毒苷-PYY(3-36)缀合物(11.57mg，4×10-6mol，2当量)在1小时内以4个2.85mg部分添加并且在室温下孵育另一个小时。在复合反应完成后，在20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中，以流速2.5ml/分钟，经由Superdex20026/60GL柱(320ml)，通过尺寸排阻层析纯化复合物。洗脱的复合物收集于4ml级分中，汇集并经0.2μm滤器除菌以产生浓度为14.3mg/ml的234mg复合物。以相似方式，为了产生人源化抗洋地黄毒苷抗体的复合物，将该抗体在20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中调节至浓度为10.6mg/ml(0.93ml中9.81mg，6.5×10-8mol)。将0.57mg＝1.97×10-7mol＝3.03当量的洋地黄毒苷化多肽(DIG-PYY)作为冻干物添加至抗体溶液。将多肽和抗体在室温下孵育1.5小时。在20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中，以流速0.5ml/分钟，经由Superose610/300GL柱，通过尺寸排阻层析移除过量的多肽。洗脱的复合物收集于0.5ml级分中、汇集并经0.2μm滤器除菌以产生浓度为1.86mg/ml的4.7mg复合物。.经由尺寸排阻层析中单峰的出现，将所产生的半抗原化多肽-抗半抗原抗体复合物确定为单体IgG样分子。将所产生的复合物确定为单体IgG样分子，每个抗体分子携带两个洋地黄毒苷-PYY衍生物。通过尺寸排阻层析证实这些肽复合物的确定组成，所述尺寸排阻层析还表明不存在蛋白质聚集物。通过SEC-MALS(尺寸排阻层析-多角度光散射法)进一步证实这些双特异性肽复合物的确定组成(和2:1的多肽与蛋白质之比)。对于SEC-MALS分析，以pH7.4的1×PBS作为流动相，以0.25-0.5ml/分钟的流速将100-500μg相应样品施加至Superdex20010/300GL尺寸排阻柱上。用WyattMiniDawnTREOS/QELS检测器检测光散射，用WyattOptilabrEX-检测器测量折射率。使用软件ASTRA(版本5.3.4.14)分析所得数据。SECMALLS分析的结果提供关于复合物质量、半径和尺寸的信息。这些数据随后与相应的非复合抗体的那些数据比较。这些实验的结果表明，洋地黄毒苷化-PYY暴露于抗洋地黄毒苷抗体产生了复合物，该复合物含有两个洋地黄毒苷-PYY衍生物/一个抗体分子。因此，洋地黄毒苷化PYY可以在确定的位点(结合区)并以确定的化学计量与抗洋地黄毒苷抗体复合。通过表面等离子体共振研究表征复合物提供了额外证据：复合反应生成确定和完全复合的分子。抗洋地黄毒苷抗体可以与SPR芯片结合，这导致信号增加。随后，加入洋地黄毒苷-PYY缀合物导致信号进一步增加直至所有结合位点被完全占据。在这些情况下，加入更多的洋地黄毒苷-PYY不会进一步增加信号。这表明复合反应是特异性的并且信号不由洋地黄毒苷化多肽的非特异性粘附引起。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot/嵌合抗生物素抗体复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素化PYY-多肽的非共价复合物，将0.19mgAc-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。抗体以缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由尺寸排阻层析中单峰的出现，将所产生的复合物确定为单体IgG样分子(95％单体)。通过SDS-PAGE和随后的蛋白质印迹分析法进一步分析所产生的复合物。将10μg复合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。将样品施加至4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，后者在200V和120mA下运行35分钟。将聚丙烯酰胺凝胶中分离的分子转移至PVDF膜(0.2μm孔径，Invitrogen)，在25V和160mA下持续40分钟。在室温下，将膜在1×PBST(1×PBS+0.1％Tween20)中的1％(w/v)脱脂乳中封闭1小时。将膜在1×PBST中洗涤3次持续5分钟并随后与按1:2000稀释使用的链霉亲和素-POD缀合物(2900U/mL，Roche)孵育。使用Lumi-Light蛋白质印迹底物(Roche)，实施与膜上生物素结合的链霉亲和素-POD的检测。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot)/嵌合抗生物素抗体复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素化PYY-多肽的非共价复合物，将0.16mgAc-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。抗体以缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由尺寸排阻层析，将所产生的复合物确定为63％单体IgG样分子和37％二聚体可溶性聚集物。通过SDS-PAGE和随后的蛋白质印迹分析法进一步分析所产生的复合物。将10μg复合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。将样品施加至4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，后者在200V和120mA下运行35分钟。将聚丙烯酰胺凝胶中分离的分子转移至PVDF膜(0.2μm孔径，Invitrogen)，在25V和160mA下持续40分钟。在室温下，将膜在1×PBST(1×PBS+0.1％Tween20)中的1％(w/v)脱脂乳中封闭1小时。将膜在1×PBST中洗涤3次持续5分钟并随后与按1:2000稀释使用的链霉亲和素-POD缀合物(2900U/mL，Roche)孵育。使用Lumi-Light蛋白质印迹底物(Roche)，实施与膜上生物素结合的链霉亲和素-POD的检测。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)/嵌合抗荧光素抗体复合物的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的荧光素缀合-PYY-多肽的非共价复合物，将0.33mgAc-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。抗体以缓冲液中9.99mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由尺寸排阻层析，将所产生的复合物确定为76％单体IgG样分子和24％二聚体可溶性聚集物。通过SDS-PAGE进一步分析所产生的复合物并随后检测聚丙烯酰胺凝胶中荧光素相关的荧光。将8μg复合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。使用LumiImagerF1装置(Roche)在645nm的激发波长处记录荧光素相关的荧光。实施例3在氧化还原剂存在下产生半抗原化染料或多肽与抗半抗原抗体VH52bC/VH53C的确定的共价缀合物用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法抗半抗原抗体和含有半胱氨酸接头的半抗原化荧光染料的共价缀合物的产生导致确定的缀合物，其中二硫桥在抗半抗原抗体CDR2中的VH52bC和半抗原和荧光染料之间的接头中的半胱氨酸之间的一个特定位置形成。在氧化还原试剂存在下实施缀合反应。将Dig-Cys-Ahx-Cy5溶解于20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中。通过逐滴加入10％(v/v)乙酸促进溶解。将终浓度调节至0.4mg/ml。使20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中的抗洋地黄毒苷抗体VH52bC达到10mg/ml的浓度。将抗洋地黄毒苷抗体作为对照使用并且按照与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC相同的方式处理。将4.7nmol每种抗体与2.5摩尔当量的Dig-Cys-Ahx-Cy5混合。通过每15分钟以4部分(每部分2.9nmol)加入11.7nmol这种物质实现这一点。在这些加入之间，将样品在25℃下孵育，同时温和振摇。在加入最后部分之后，将0.64nmol每种抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5复合物转移至含有以下氧化还原试剂的缓冲液中：3mMDTE(二硫赤藓糖醇)+10mMGSSG(氧化型谷胱甘肽)、0.3mMDTE+1mMGSSG和0.03mMDTE+0.1mMGSSG。所有样品均在这些条件下孵育15分钟。在孵育后，样品被分成两半(每一半0.34nmol)并被制备用于SDS凝胶电泳。为此，加入4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)。对于每份样品，还通过加入10×NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)制备还原形式。将所有样品在70℃下孵育5分钟，然后在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上用1×MOPS缓冲液(Invitrogen)电泳。用LumiImagerF1装置(Roche)在645nm的激发波长处检测凝胶中的Cy5相关荧光。在检测荧光后，凝胶用SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)染色。凝胶示于图3。当使用无CDR2中半胱氨酸的抗洋地黄毒苷抗体时(泳道2A-C)，显示抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的位点特异性二硫键形成(图8，在上部的凝胶，泳道1A-C)，其具有低的背景荧光信号。对照反应中的背景信号可以由Dig-Cys-Ahx-Cy5与半胱氨酸(其通常参与抗体链间二硫键的形成)的偶联来解释。增加量的氧化还原试剂显著减少连接抗体重链和轻链的二硫键，主要产生3/4抗体(-1×LC)、HC-二聚体(-2×LC)和1/2抗体(1×HC+1×LC)。在凝胶底部，可以检测到未与抗体共价连接的Dig-Cys-Ahx-Cy5的荧光。图8底部的凝胶显示，当还原样品时，在抗体重链和轻链附近不能检测到Cy5相关的荧光，这表明共价键的确由二硫桥形成。每块凝胶的考马斯染料染色显示每条泳道中的蛋白质的总量相等。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Cy5/抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法将Dig-Cys-Cy5溶解于8.3mMHCl，10％(v/v)DMF中至终浓度为3.25mg/ml。使20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中的抗洋地黄毒苷抗体VH52bC抗体达到15mg/ml的浓度。将抗洋地黄毒苷抗体作为对照使用并且按照与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC相同的方式处理。在1mMGSH(还原的谷胱甘肽)和5mMGSSG(还原的谷胱甘肽)存在下，将13.3nmol每种抗体与2摩尔当量的Dig-Cys-Cy5在10mg/ml的最终抗体浓度下混合。通过每5分钟以2部分加入26.6nmol这种物质实现这一点。在这些加入之间，将样品在室温下孵育，同时温和搅拌。在加入最后部分之后，将样品在室温下孵育1小时。通过SDS-PAGE评价偶联反应的效率并随后记录Cy5相关的荧光信号。5、10和20μg的各样品被制备用于SDS-PAGE。为此，加入4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)。将所有样品在70℃下孵育5分钟，然后在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上用1×MOPS缓冲液(Invitrogen)电泳。用LumiImagerF1装置(Roche)在645nm的激发波长处检测凝胶中的Cy5相关荧光。在检测荧光后，凝胶用SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)染色。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)/人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的洋地黄毒苷衍生化-PYY-多肽的缀合物，将1.4mgPEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗体以缓冲液中10mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由5mMTris-HCl，1mMEDTA，1mMGSH，5mMGSSG，pH8.2组成。将PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)和抗体以2:1摩尔比(PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以100rpm搅拌。通过质谱法分析所产生的缀合物。43％的所检测到的种类被鉴定为与2个多肽分子偶联的抗体，46％是与1个多肽分子偶联的抗体，并且，11％被鉴定为未偶联的抗体。实施例4在氧化还原剂不存在下产生半抗原化染料和多肽与抗半抗原抗体VH52bC/VH53C的确定的共价缀合物为了产生共价性抗半抗原抗体/半抗原化多肽或半抗原化染料二硫键连接的缀合物，需要(i)经由含有合适反应基团(如，举例来说，半胱氨酸、马来酰亚胺)的接头将半抗原(例如，洋地黄毒苷、荧光素、生物素或茶碱)与多肽或染料如此偶联，从而允许多肽暴露在抗体表面上并因此保留其活性，和(ii)产生半抗原化多肽与具有半胱氨酸突变的抗半抗原抗体(＝抗体VH52bC/VH53C)的共价性位点特异性缀合物，其中多肽的生物学活性被保留，以及(iii)在还原剂不存在的情况下实施反应以避免还原抗体链间二硫桥。一般方法：产生抗半抗原抗体与半抗原化化合物的缀合物应当产生具有确定化学计量的缀合物并应当确保这些缀合物中的化合物保留其活性。为了产生半抗原化化合物与相应的抗半抗原抗体的缀合物，将半抗原化化合物溶解于100％DMF中至终浓度为10mg/ml。使抗半抗原抗体VH52bC/VH53C在50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH＝8.2中达到10mg/ml的浓度。通过上下抽吸将半抗原化化合物和抗半抗原抗体VH52bC/VH53C按2.5:1摩尔比(化合物对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由含有半胱氨酸的接头与半抗原缀合的多肽在下文中称作半抗原-Cys-多肽或多肽-Cys-半抗原。该多肽可以具有游离N-末端或加帽的N-末端，例如具有乙酰基(Ac-多肽-Cys-半抗原)或PEG-残基(PEG-多肽-Cys-半抗原)。经由含有半胱氨酸的接头与半抗原缀合的荧光染料在下文中称作染料-Cys-半抗原或半抗原-Cys-染料。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法样品完全如实施例3a中所述那样制备，不同之处在于将抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5复合物转移至含有或不含氧化还原化合物0.1mMGSSG(氧化的谷胱甘肽)或1mMGSSG的缓冲液。所得的荧光扫描的和考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶示于图4。所有三种条件均显示位点特异性二硫键形成的相似特异性(图4，顶部凝胶，泳道1A-C),具有低水平的背景反应(图4，泳道2A-C)。这证实二硫键的形成可以在不需要还原剂的情况下实现。这显著地稳定抗体/减少抗体分解，因为与实施例3相比，仅检测到残余量的3/4抗体(-1×LC)、HC-二聚体(-2×LC)和1/2抗体(1×HC+1×LC)。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Cy5/抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法样品完全如实施例3b中所述那样制备，不同之处在于13.3nmol的抗体在氧化还原试剂不存在的情况下与2摩尔当量的Dig-Cys-Cy5在10mg/ml的最终抗体浓度下混合。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——生物素-Cys-Cy5/嵌合抗生物素抗体VH53C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-Cy5的缀合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9.7mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。如实施例3a中所述，通过SDS-PAGE分析所产生的缀合物。如实施例3a中所述实施荧光的检测。用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——生物素-Cys-Cy5/人源化抗生物素抗体VH53C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-Cy5的缀合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg人源化抗生物素抗体VH53C以缓冲液中7.4mg/ml(约51μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。如实施例3a中所述，通过SDS-PAGE分析所产生的缀合物。如实施例3a中所述实施荧光的检测。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)/人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的洋地黄毒苷衍生化-PYY-多肽的缀合物，将2.4mgAc-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)溶解于20％乙酸酯中至浓度为5mg/ml。10mg人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC(68.4nmol)以缓冲液中19.5mg/ml(约133μM)的浓度使用，所述缓冲液由20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0组成。将Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)和抗体以2:1摩尔比(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以100rpm搅拌。通过质谱法分析所产生的缀合物。7.4％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，40％是与1个肽分子偶联的抗体，并且，52％被鉴定为未偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)/嵌合抗生物素抗体VH53C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.19mgAc-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg嵌合抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9.7mg/ml(约67μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。87.7％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，12.3％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)/嵌合抗生物素抗体VH53C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.16mgAc-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg嵌合抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9.9mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。100％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)/人源化抗生物素抗体VH53C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.06mgAc-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。0.8mg人源化抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9mg/ml(约62μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。62.2％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，33.9％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体，并且，3.9％被鉴定为未偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)/人源化抗生物素抗体VH53C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.08mgAc-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。0.8mg人源化抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9mg/ml(约62μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。71.4％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，26％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体，并且，2.5％被鉴定为未偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Fluo)/抗荧光素抗体VH52bC的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.33mgAc-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗荧光素抗体VH52bC以缓冲液中9.3mg/ml(约63μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。95％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，5％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体。用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Fluo)/抗荧光素抗体VH28C的示例性方法为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.33mgAc-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗荧光素抗体VH28C以缓冲液中9.5mg/ml(约63μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。100％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体。实施例5产生共价性茶碱-抗茶碱抗体复合物为了评价利用茶碱和结合茶碱的抗体作为半抗原识别系统的共价性抗体复合物的形成，总体上应用已经对洋地黄毒苷-Cys-Cy5或生物素-Cys-Cy5描述的合成和纯化技术，产生茶碱-Cys-Cy5作为荧光有效载荷，不同之处在于已经将半抗原交换为茶碱。为了展示共价二硫化物的形成，产生了结合茶碱的抗体，所述抗体在重链可变区的位置54或55处含有设计的Cys(抗茶碱抗体-Cys)。这些抗体衍生物与茶碱-Cys-Cy5复合并且随后在如实施例4中所述的非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。在非还原条件下，二硫化物连接的抗茶碱抗体复合的Cy5按照与实施例4中所述相同的方式，通过凝胶内部其H链相关的荧光检测。由于按照与使用洋地黄毒苷、荧光素或生物素作为半抗原时观察到的二硫化物相同的方式进行简单的加载反应，已经形成共价复合物。如预期的那样，在还原后，这些复合物解离，即，仅当二硫化物还原时才从H链释放有效载荷。实施例6在体内样条件下产生共价半抗原-抗体复合物，以及关于体内定向二硫化物的证据为了评价体内样条件下共价半抗原-抗体复合物的形成，将抗生物素抗体-Cys在鼠血清中与生物素-Cys-Cy5在37℃下孵育60分钟。随后，通过蛋白A从鼠血清捕获抗体。此后，将捕获的抗体在如实施例4中所述的非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。二硫化物连接的抗体复合的Cy5按照与实施例4中所述相同的方式，通过凝胶内部其H链相关的荧光检测。图10表明抗体之间的共价复合物在37℃下在血清中(即，在类似于体内条件的条件下)形成。如预期的那样，在还原后，这些复合物解离，即，仅当二硫化物还原时才从H链释放有效载荷(图10)。一旦半抗原定位，则抗体和有效载荷之间的定向二硫键可以形成，甚至在血清存在下也是如此，这样的观察结果出乎意料，因为血清含有高量的蛋白质、肽和其他化合物(它们可以干扰二硫化物形成反应)。一旦半抗原定位，则抗体和有效载荷之间的定向二硫键可以在37℃下在血清中形成，这样的观察结果还打开了在预靶向设定中应用这种PK-调节系统的可能性：分别施加抗体和半抗原-有效载荷，然后体内装配抗体复合物并随后形成二硫化物。为了进一步评价体内‘预靶向’的潜在应用，通过如实施例10中所述的动物眼的非侵入式光学成像技术在预靶向条件下确定生物素-Cy5的药物代谢动力学。在这些实验中，通过动物眼光学成像(其显示毛细管中的Cy5的荧光)，以非侵入方式确定Cy5的存在。将我们在注射生物素-Cy5后10分钟于小鼠眼中检测到的Cy5介导的荧光值设定为100％值，并且相对该值表示在后续时间点测量的荧光值。在这个实验中，在注射生物素-Cy5并开始眼成像之前24小时施加1mg抗体(抗生物素抗体或抗生物素抗体-Cys(＝抗生物素抗体的Cys-突变体))。对照组不预先注射抗生物素抗体。这些实验的结果示于图11：向未接受预先注射的抗体的动物注入的生物素-Cy5以低血清半寿期和低暴露水平消除(菱形)。向预先24小时注射抗生物素抗体(无Cys突变)的动物注入的生物素-Cy5的血清水平和半寿期大大增加。这显示该抗体捕获循环中的其抗原(带有效载荷)，并延长抗原(并同样延长缀合的有效载荷中的抗原)的血清半寿期。向预先24小时注射抗生物素抗体-Cys(即，含有如本文所报告用于共价偶联有效载荷的Cys突变的抗体)的动物注入的生物素-Cys-Cy5的相对血清水平和半寿期甚至进一步增加。在这些样品中，相对Cy5水平不仅高于非复合的化合物的那些水平，还高于复合(但是非二硫键结合)的Cy5的水平。因此，半抗原复合的二硫键连接的有效载荷(其在预靶向条件下在体内形成)在循环中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效载荷更高的暴露水平。实施例7在缀合物中和在与抗半抗原抗体的复合物中的多肽保留功能性我们先前已经显示，作为非共价半抗原-多肽缀合物的部分和在与抗半抗原抗体的复合物中的多肽保留功能性(WO2011/003557、WO2011/003780和PCT/EP2011/074273)。为了证明共价二硫化物偶联时偶联的肽同样保留功能性，比较了抗洋地黄毒苷抗体复合的多肽和它们与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的二硫化物缀合物的生物学活性。PYY衍生肽的治疗所需的官能团与其同族受体NPY2结合并干扰其同族受体NPY2的信号传导。经由NPY2受体的信号传导参与和/或调节代谢过程。为了分别评价多肽Dig-PYY与抗洋地黄毒苷抗体的复合或SS-缀合或者多肽Dig-Cys-PYY与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的缀合是否影响其活性，我们在表达NPY2受体的HEK293细胞中评价其抑制毛喉素刺激的cAMP积累的能力(cAMP测定法)。下表2显示cAMP-测定法的结果，其中进行所述cAMP-测定法以评估PYY(3-36)、其Y2受体特异性修饰类似物moPYY、其复合抗体的Dig-变体和其二硫化物缀合的Dig-Cys-衍生物的生物学活性。表2.对于cAMP激动剂测定法，使用以下材料：384孔平板；TropixcAMP-筛选试剂盒；cAMPELISA系统(AppliedBiosystems，目录号T1505；CS20000)；毛喉素(Calbiochem目录号344270)；细胞：HEK293/hNPY2R；生长培养基：Dulbecco的改良eagle培养基(Dulbecco’smodifiedeaglemedium)(D-MEM，Gibco)；10％胎牛血清(FBS，Gibco)，热灭活；1％青霉素/链霉素(青霉素10000单位/mL：链霉素10000mg/mL，Gibco)；500μg/mLG418(遗传霉素(Geneticin)，Gibco目录号11811-031)；以及铺板培养基：DMEM/F12w/o酚红(Gibco)；10％FBS(Gibco，目录号10082-147)，热灭活；1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15140-122)；500μg/mLG418(遗传霉素，Gibco，目录号11811-031)。为进行测定法，在第1天，弃去培养基，并将单层细胞用10mLPBS/瓶(T225)洗涤。用PBS倾析后，将5mLVERSENE(Gibco，目录号1504006)用来移除细胞(在37℃下，5分钟)。温和地拍打培养瓶并汇集细胞悬液。将每只培养瓶用10mL铺板培养基冲洗并以1000rpm离心5分钟。汇集悬液并计数。对于HEK293/hNPY2R，将悬液以密度2.0×105细胞/mL重悬于铺板培养基中。使用多点分液器，将50微升细胞(HEK293/hNPY2R–10,000个细胞/孔)转移至384孔平板中。平板在37℃孵育过夜。在第2天，检查细胞是否到75-85％汇合度。使培养基和试剂达到室温。在制备稀释物之前，使二甲基亚砜(DMSO，Sigma，目录号D2650)中的刺激性化合物储液加温至32℃持续5-10分钟。在含有0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Calbiochem，目录号410957)和0.5mg/mLBSA的DMEM/F12中制备稀释液。刺激培养基中的DMSO终浓度是1.1％，毛喉素浓度为5μM。在纸巾上温和翻转细胞平板拍去细胞培养基。每孔放置50μl刺激培养基(每个浓度一式四份进行)。将平板在室温下孵育30分钟，并且在显微镜下关于毒性检查细胞。在30分钟处理后，弃去刺激培养基并添加50μL/孔测定裂解缓冲液(在Tropix试剂盒中提供)。将平板在37℃孵育45分钟。将20μL裂解物从刺激平板转移至来自Tropix试剂盒的预包被抗体平板(384孔)。添加10μLAP缀合物和20μL抗cAMP抗体。将平板在室温下孵育1小时，同时振摇。随后用洗涤缓冲液洗涤平板5次，每次洗涤70μL/孔。将平板拍干。添加30μL/孔CSPD/Sapphire-IIRTU底物/增强溶液并在室温下孵育45分钟(振摇)。在光度计(VICTOR-V)中测量信号持续1秒/孔。这些测定法的结果(表2)表明，修饰的肽衍生物moPYY比野生型PYY具有可忽略的较低活性。对于野生型PYY，cAMP测定法的IC50值是0.09nM，并且，对于修饰的类似物，是0.14nM。共价二硫化物缀合导致生物学活性轻微降低。对于缀合物，IC50值是5-36nM。令人惊讶地，共价二硫化物缀合物的活性比非共价复合物高2倍，IC50值为10.91nM。实施例8较之生物素化Cy5与人源化抗生物素抗体VH53C的共价缀合物，生物素化Cy5与人源化抗生物素抗体的复合物的血清稳定性所述的肽修饰技术的目的是改善肽的治疗适用性。肽的治疗性应用的主要瓶颈是目前有限的体内稳定性和/或短的血清半寿期和快速清除率。在体内测定荧光团的抗体缀合物的PK参数并且与非共价抗体-荧光团复合物的PK进行比较。因此，(i)将抗生物素抗体VH53C共价缀合至生物素化荧光团Biot-Cys-Cy5，(ii)产生抗生物素抗体与生物素化荧光团Biot-Cy5的非共价复合物，(iii)将共价缀合的和非共价复合的化合物施加至动物，和(iv)通过测定Cy5的荧光(A650)测量化合物在这些动物中随时间的血清浓度，并且通过特异性检测人源化抗体的ELISA方法测量相应抗体在这些动物中随时间的血清浓度。实验方法为了分析对小荧光底物的抗体复合的PK参数的影响，对每种物质而言，将13nmol在20mM组氨酸/140mMNaCl，pH6.0中的Cy5-生物素/人源化抗生物素抗体VH53C-缀合物或相应的与抗体非共价复合的化合物或单独的荧光化合物施加至6只雌性小鼠(品系NRMI)。对于第一组中的小鼠1、2和3，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、4小时和48小时，并且，对于第二组中的小鼠1、2和3，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、24小时和72小时。在室温1小时后通过离心(9300×g，3分钟，4℃)获得至少50μl血清样品。血清样品贮存在-80℃。为了确定化合物在给定时间点在血清中的量，利用Cy5的荧光特性：在室温下使用CaryEclipse荧光分光光度计(Varian)在120μl石英比色皿中测量血清样品中的Cy5相关荧光。激发波长是640nm，在667nm处测量发射。将血清样品稀释于1×PBS中以达到适宜的发射强度范围。作为相应样品，使用1×PBS中相同稀释的未处理小鼠的血清作为空白探针并且它不显示任何荧光信号。图5显示使用共价缀合物、非共价复合物和非复合的半抗原-Cy5时分析的结果。数据显示为对注射后5分钟的(峰)血清水平归一化的Cy5-介导荧光的相对(％)水平。对于分子量相当小的化合物，非复合的生物素-Ser-Cy5从血清快速消失。注射后1小时，在血清中施加且5分钟后可检测的荧光中仅6％仍然可检出。在更晚的时间点，注射后2小时、4小时和24小时，Cy5介导的信号不可检出。在抗体复合的化合物中，注射后4小时，在血清中仍然可检出大约50％的所施加的荧光(5分钟水平设定成100％)。还可以在更晚的时间点检出Cy5-介导的荧光水平，注射后2小时可检出5分钟值的大约22％，并且注射后48小时可检出大约12％并且72小时后仍可检出8％。抗体缀合的化合物显示出比抗体复合的化合物显著更长的体内半寿期。注射后4小时，在血清中仍然可检出大约58％的所施加的荧光(5分钟水平设定成100％)(比抗体复合的化合物高1.16倍)。在24小时后，血清中检出35％(1.6倍)的Cy5-介导荧光，在48小时后检出31％(2.6倍)的Cy5-介导荧光，并且，在72小时后检出26％(3.3倍)的Cy5-介导荧光。实验首个24个小时中复合化合物和缀合化合物的荧光的可比性下降可以解释对于复合物和缀合物而言相似的早期分布。在24小时后，抗体缀合的化合物的体内稳定性是差异的原因。为了确定血清中人IgG抗体在给定时间点的量，利用以下测定原理：在用抗人κ链单克隆IgG抗体包被的固相(微量滴定板，NUNC-ImmunoTM)上捕获血清样品中的人IgG1抗体。血清样品按1:105和1:106稀释并将100μl这些稀释物加入到孔中。在孵育后，将孔每次用300μlPBS/0.05％Tween20洗涤3次。通过首先加入100μl浓度为0.25μg/ml的抗人CH1结构域IgG(其在C-末端被洋地黄毒苷化)，实施人IgG抗体的检测。在每次用300μl1×PBS/0.05％Tween20洗涤3次后，加入100μl浓度为25mU/ml的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗洋地黄毒苷抗体Fab片段。最后，每孔加入100μl在环境温度下孵育30分钟后，在商用微量滴定板ELISA读数仪(例如TecanSunrise)中于405nm和492nm[405/492]处测量消光(OD)。图5显示在用抗体-生物素-Cy5-复合物和缀合物处理的小鼠中Bio-Cy5血清水平以及人IgG的血清水平。数据显示为对注射后5分钟的(峰)血清水平归一化的人IgG相对(％)水平。抗体-半抗原-复合物和缀合物的相对人IgG血清水平都与针对抗体-半抗原缀合物测量的相对荧光一致。因此，生物素-Cys-Cy5化合物显示出类似于与之缀合的抗体的体内稳定性，这意味抗体-半抗原缀合物在体内保持完整。显然，对于抗体-半抗原复合物来说并非如此，所述抗体-半抗原复合物的Cy5-介导的相对荧光比人IgG相对血清水平下降得更快。这意味复合物在体内随时间推移释放有效载荷。总之，当被抗半抗原抗体结合时，半抗原化化合物的体内稳定性显著增加。然而，抗体-半抗原复合物在体内不是完全稳定的，因为半抗原-Cy5血清水平的下降比抗体血清水平的下降更快。对于抗体-半抗原-Cy5缀合物来说并非如此，所述抗体-半抗原-Cy5缀合物显示出与正常IgG抗体相似的体内特征。Dig-肽血清动力学(非共价复合物和共价缀合物的比较)为了分析对洋地黄毒苷化多肽的抗体复合和抗体缀合的PK参数的影响，对于每种物质，将20mM组氨酸/140mMNaClpH6.0中的32.1nmol的多肽或相应的与抗体非共价复合的多肽施加至2只雌性小鼠(品系NRMI)。施用MAK-DIG-PYY的小鼠具有23g和25g体重，并且，施用DIG-PYY的小鼠具有28g和26g体重。对于小鼠1，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时，2小时和24小时，并且，对于小鼠2，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、4小时、24小时。在室温1小时后通过离心(9300×g，3分钟，4℃)获得至少40μl血清样品。血清样品贮存在-80℃。与Dig-Cy5的检测相比，在给定时间点在血清中的洋地黄毒苷化肽的量难以确定，因为无检测血清样品中多肽的直接手段可用。因此，建立了用于检测血清中的洋地黄毒苷化肽的蛋白质印迹相关测定法。在第一步骤中，在还原性SDS-PAGE上分离血清样品。因为样品制备包括使血清暴露于高浓度的SDS和还原剂，复合的Dig-多肽缀合物可以变为从(完全变性/解折叠的)抗洋地黄毒苷抗体释放，而共价缀合物保持结合。为了介导多肽从非共价抗体复合物释放并通过SDS-PAGE分离单个组分，将2μl各血清样品稀释于18μl20mM组氨酸/140mMNaClpH6.0中，在95℃与6.7μl4×LDS样品缓冲液和3μl10×样品还原剂(NuPAGE，Invitrogen)混合5分钟。作为对照，使用2μl未处理的相同品系小鼠的血清。将样品施加至4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，其中，使用1×MES(Invitrogen)作为运行缓冲液，在200V/120mA运行所述凝胶20分钟。随后，使用XCellSureMini-Cell系统(Invitrogen)在25V/130mA运行40分钟，将分离的多肽印迹到PVDF膜(0.22μm孔径，Invitrogen)上。在室温下，将膜在1×PBS+1％Tween20(PBST)中的1％脱脂乳中封闭1小时。随后在膜上用抗洋地黄毒苷抗体检测洋地黄毒苷化多肽。为此，将抗洋地黄毒苷抗体以10ml1％脱脂乳/PBST中的浓度13μg/ml施加至膜上，在室温下持续2小时。膜在1×PBST中洗涤3×5分钟。在10ml1％脱脂乳/PBST中，以1:25稀释度应用来自LumiLightPLUS蛋白质印迹试剂盒(Roche)的与POD偶联的抗小鼠IgGFab片段，在室温下持续1小时。膜用1×PBST洗涤3×5分钟。通过在4mlLumiLight蛋白质印迹底物中在室温下孵育该膜5分钟，实施检测。用LumiImagerF1(Roche)检测化学发光，曝光时间20分钟。这些分析的结果示于图6A和图6B。在不同时间点、在鼠血清中的洋地黄毒苷多肽的存在/量已被确定。已接受抗体复合的肽的小鼠(图6左侧)在最早时间点显示强信号(施用后5分钟)。如对照印迹上的大小和位置所示，这些信号是明确可分配的(clearlyassignable)。在用抗体复合多肽处理的小鼠的血清中，多肽相关的信号在早期时间点最强并随时间降低。然而，在所有时间点以及甚至施用后24小时仍然可检出多肽，信号良好。在接受非复合的多肽的小鼠中，甚至在最早时间点几乎没有任何可与小多肽相关的信号可检出。图6在右侧显示在正常曝光条件下，印迹上见不到游离多肽。印迹的对比度增强显示在施用后5分钟存在一些多肽，然而仅以痕量存在。在更晚的时间点，不可检出确定的多肽条带。可以看出，非复合的多肽在小鼠的血清中具有非常短的半寿期。接受相同但处于抗体复合形式的多肽的小鼠显示这些多肽在血清中以增加的时段存在。注射后24小时，在这些小鼠的血清中可以测定出多肽。实施例9共价连接的洋地黄毒苷-抗体复合物和结合洋地黄毒苷的IgG的血清半寿期为了分析共价复合相对于非共价连接的半抗原复合物是否进一步改善PK特性，体内确定抗洋地黄毒苷抗体-洋地黄毒苷-Cy5复合物以及共价连接的[抗洋地黄毒苷抗体-Cys]-[洋地黄毒苷-Cys-Cy5]缀合物的PK参数。因此，利用其荧光(A650)测定洋地黄毒苷-Cy5，并且通过特异性检测人源化抗体的ELISA方法测定相应的抗体。将洋地黄毒苷-Cy5作为半抗原偶联肽的低分子量‘替代物’使用，因为其荧光特性允许在血清中容易和精确的检测。按照与针对生物素-Cy5或生物素-Cys-Cy5所描述的相同的方式(参见实施例8)，将洋地黄毒苷-Cy5或抗体复合的或另外地抗体-Cys-连接的洋地黄毒苷-Cy5静脉内注射至雌性NRMI小鼠中，随后，在0.08小时、2小时、4小时和24小时采集血液。将注射后5分钟(t＝0.08小时)针对两只小鼠/在两只小鼠中检测的Cy5-介导的荧光值设定为100％值并且将后续时间点处测量的荧光值相对它来表示。这些实验的结果显示，对于洋地黄毒苷-Cy5，在注射后2小时可检出少于10％的所施加的荧光(5分钟值)。在更晚的时间点，分别在注射后4小时和24小时，不可检出Cy5-介导的信号(参见图8)。与非复合的化合物形成对照，抗体复合的化合物以高得多的水平并且在更晚时间点可检出(图8)。这表明抗体复合显著地增加小化合物洋地黄毒苷-Cy5的血清半寿期。另外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效载荷显示更大的PK延长。洋地黄毒苷-Cy5水平和抗体水平的直接比较表明随时间有效载荷从抗体丢失，Cy5水平比抗体水平下降更快。与之相反，共价连接的洋地黄毒苷-缀合物显示几乎相同的Cy5和IgG血清半寿期(图8)。这表示二硫化物连接的有效载荷保持与抗体稳定连接，而非共价复合物随时间解离。实施例10共价连接的半抗原-抗体复合物和仅通过半抗原结合位点附接的复合物的血清半寿期和暴露水平为了分析共价复合是否改善非共价连接的半抗原复合物的PK-特性，体内确定抗生物素抗体与生物素-Cy5的复合物的PK以及共价连接的缀合物[抗生物素-抗体-Cys]-[生物素-Cys-Cy5]的PK。通过动物眼光学成像(其显示毛细管中的Cy5的荧光)，以非侵入方式确定Cy5的存在。将我们在注射后10分钟于小鼠眼中检测到的Cy5介导的荧光值设定为100％值，并且相对该值表示在后续时间点测量的荧光值。这些实验的结果示于图9：非复合的生物素-Cy5本身具有低的血清半寿期和低的暴露水平。未共价连接的抗体复合化合物以高得多的水平可检出并具有延长的半寿期。另外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效载荷显示更大的PK延长和更高的血清水平。这表明，半抗原复合的二硫化物连接的有效载荷在循环中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效载荷更高的暴露水平。实施例11肽与结合不同半抗原的抗体复合和共价缀合应用结合半抗原的模块以偶联半抗原化化合物(＝有效载荷)至靶向载体是借此可以实现半抗原介导的递送的一种技术可能性。可以将该概念扩展至捕获化合物并使它们与靶向模块连接的其他半抗原或其他实体。例如，对于多肽递送或稳定化，可以应用结合洋地黄毒苷或其他半抗原的单特异性或双特异性抗体以稳定治疗性多肽及优化其PK。作为捕获多肽的模块应用的先决条件是(i)化合物与半抗原的偶联不会严重干扰多肽活性和(ii)抗体与半抗原化化合物的有效结合/复合的可能性。半抗原定向的结合是半抗原化染料或多肽与抗半抗原的半胱氨酸化抗体有效共价偶联的先决条件。为了显示亲和力驱动的半抗原化化合物与抗半抗原抗体的复合是有效形成二硫键的先决条件，将生物素-Cys-Cy5与人源化抗洋地黄毒苷抗体和人源化抗洋地黄毒苷抗体VH53C孵育。实施生物素-Cys-Cy5与人源化抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体VH53C的孵育作为对照反应。将0.13mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。0.7mg每种抗体以缓冲液中6.7mg/ml(约46μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过SDS-PAGE进一步分析所产生的复合物/缀合物并随后检测聚丙烯酰胺凝胶中的Cy5相关荧光。将15μg复合物/缀合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。使用LumiImagerF1装置(Roche)在645nm的激发波长处记录Cy5相关荧光。当使用CDR2中无半胱氨酸的人源化抗生物素抗体时(图36，泳道3)，非还原样品显示人源化抗生物素抗体VH53C的共价性位点特异性二硫键形成(图36，泳道4)，其具有非常低的背景荧光信号。当使用人源化抗洋地黄毒苷抗体时(图36，泳道1)，生物素-Cys-Cy5也共价偶联至人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC(图36，泳道2)，其具有低的背景信号，但是效率显著较低。这可以从凝胶底部检测到的过量生物素-Cys-Cy5推断出来(箭头)。在人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的情况下，可以检测到比人源化抗生物素抗体VH53C(泳道4)显著更多的未偶联的生物素-Cys-Cy5(泳道2)。当还原样品时，在抗体重链和轻链附近不能检测到Cy5相关荧光，这表明共价键的确由二硫桥形成。每块凝胶的考马斯染色显示每条泳道中的蛋白质的总量相等。实施例12半抗原定向的结合是半抗原化染料或多肽与抗半抗原的半胱氨酸化抗体有效共价偶联的先决条件为显示半抗原化化合物与抗半抗原抗体的亲和力驱动的复合是有效形成二硫键的先决条件，将非半抗原化的肽Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)(Biosynthan1763.1,SEQIDNO:23)与人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC和人源化抗洋地黄毒苷抗体孵育。将1.4mgAc-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。2mg每种抗体以缓冲液中11-13mg/ml(约75-89μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.2组成。将Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)和抗体以2.1:1摩尔比(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)对抗体)混合。肽以3部分添加，同时用搅拌棒以500rpm搅拌溶液。在每次添加之间，将样品在200rpm下孵育5分钟。在添加最后部分后，将样品在室温和200rpm下孵育1小时。通过尺寸排阻层析,对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC缀合物，所产生的复合物/缀合物确定为97％单体IgG样分子和3％二聚体可溶性聚集物，并且对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体复合物确定为100％单体。另外，通过质谱法分析所产生的复合物/缀合物。对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC缀合物，17％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，51％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体，并且，32％被鉴定为无偶联肽的抗体。对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体复合物，100％的抗体未偶联。实施例13对于形成正确折叠的具有用于共价偶联有效载荷的半胱氨酸突变的结合半抗原的功能抗体所需要的二硫化物样式用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的模块可以由‘标准’抗体(如，IgG)组成，所述‘标准’抗体含有允许共价附接半抗原化化合物/有效载荷的额外半胱氨酸。如本文所报告的方法在折叠的结构域内部引入所需要的功能性(半胱氨酸)，其结构和序列为抗体功能性提供基础。在抗体结构域内部以及之间正确形成限定的二硫键对于形成并维持正确的结构和功能性来说是必需的。为了维持正确的二硫化物样式，在VH结构域中引入的额外半胱氨酸必须未被占据并且必须不干扰相邻的半胱氨酸或与之反应。VH52bC/VH53C位置位于VH结构域内部(并相当接近于其他半胱氨酸)的事实加剧了在生物合成重链期间可能形成不正确的二硫化物的风险。另一个潜在问题是VH结构域和VL结构域在分泌途径内部装配成一个Fv片段。分泌途径涉及氧化还原改组条件和二硫化物形成酶和二硫化物改组酶。因此，通过添加VH52bC/VH53C突变引入不正确二硫键的可能性还可能‘扩散’至轻链的二硫键。这进一步增强获得/产生不正确折叠的无功能分子的风险。因此相当令人惊讶的是，尽管有这些风险，仍可以表达并获得大量含有VH52bC/VH53C突变的均一的功能抗体衍生物，并且其能够共价连接至半抗原化化合物/有效载荷。实施例14具有用于共价偶联的半胱氨酸突变的抗半抗原二硫化物稳定化的单链Fv片段的组成和产生用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的模块可以由‘标准’抗体(如，IgG)组成。备选地，它们可以是修饰的实体如重组Fv或Fab片段或其衍生物。经常应用单链Fv片段作为全长抗体的备选物，特别是在其中需要小模块尺寸或其中需要额外的结合模块以产生双特异性或多特异性抗体衍生物的应用中。已经产生的抗半抗原Fv衍生实体的一个例子是结合并共价连接洋地黄毒苷化化合物/有效载荷的二硫化物稳定化的单链Fv。通过经由富含Gly和Ser的柔性接头彼此连接抗洋地黄毒苷抗体VH结构域和VL结构域，产生具有Dig-结合特异性的二硫化物稳定化的单链Fv。这些VH结构域和VL结构域在VH的位置44和VL的位置100(根据Kabat等人的位置)额外携带半胱氨酸突变。这些额外的半胱氨酸在VH和VL之间形成稳定的分子间二硫键。这稳定了scFv，如先前所述(例如Reiter,Y.等人,NatureBiotechnology14(1996)1239-1245)。除此之外，还分别在根据Kabat编号法的位置52b或53处将另一个半胱氨酸引入VH中，以向Fv片段添加共价连接功能性。然而，向二硫化物稳定化的Fv片段中引入这类突变远比将它们安置在全长抗体中更有挑战性。单链Fv片段比全长IgG或Fab片段内在地更不稳定，因为它们缺少恒定结构域作为稳定和强制异源二聚化的实体。可以通过向Fv中安置额外的半胱氨酸突变如VH44-VL100二硫化物赋予稳定性。然而，这种稳定化原理仅当二硫化物在正确位置处在正确的半胱氨酸之间形成时才起作用。因此，除了确定的域内二硫化物(一个在VH中，并且，一个在VL中)之外，需要形成一个单一确定的正确域间二硫化物。非匹配性半胱氨酸之间的二硫化物连接将产生错误折叠的不稳定和无功能的实体。考虑到二硫化物稳定化的Fv片段含有6个半胱氨酸，则理论上可以形成21个不同的二硫化物连接可以形成——但是仅正确组合的3个确定的二硫化物将形成有功能的稳定化的dsscFv。当向VH结构域中添加另一个游离半胱氨酸时，这种困难加剧。所期望的稳定化的dsscFv含有两个确定的域内二硫化物(VH和VL中各一个)、一个确定的域间二硫化物(在VH和VL之间)和此外一个用于半抗原化化合物/有效载荷偶联的游离半胱氨酸(在VH中位置52b/53处)。考虑到具有用于共价偶联的额外半胱氨酸突变的二硫化物稳定化的Fv片段含有7个半胱氨酸，理论上许多不同的二硫化物连接可以形成，但是仅所述3个确定二硫化物的正确组合(其具有在VH52b/VH53处的确切的游离半胱氨酸位置)才将产生有功能的稳定化的能够共价偶联的dsscFv。一个额外的挑战是以下事实：额外的游离半胱氨酸(VH52b/VH53)位于紧靠VH44半胱氨酸的位置，所述VH44半胱氨酸不是天然存在的半胱氨酸，而是引入用于二硫化物稳定化的突变。VH44C对于形成正确的域间二硫化物来说是必需的，并且，不受该理论束缚，这种二硫化物很可能在VH和VL独立折叠和装配后形成。VH44C和VH52bC/VH53C的邻近加剧了域内二硫化物不以正确方式形成的风险。但是已经发现可以产生有功能的二硫化物稳定化的单链Fv模块，所述单链Fv模块结合洋地黄毒苷并同时能够共价连接至洋地黄毒苷化有效载荷。编码具有VH52bC突变Fv抗体衍生物的这种结合Dig的dsscFv的轻链可变区和经修饰的重链可变区的序列在SEQIDNO:25(VH)下列出并且在SEQIDNO:24下列出了相应的VL。在实施例15(下文)中描述了成功产生这类dsscFv作为用于产生双特异性抗体衍生物的模块。实施例15用于靶向递送共价偶联的化合物/有效载荷的双特异性抗半抗原抗体衍生物的组成、表达和纯化产生这些双特异性抗体，它们含有用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的抗体模块。这些抗体额外地含有能够靶向其他抗原的结合模块。这类双特异性抗体的应用包括将半抗原化化合物/有效载荷特异性靶向至携带靶抗原的细胞或组织。产生的这类分子的一个例子是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有结合区(其识别肿瘤相关糖抗原LeY)并同时具有二硫化物稳定化的Fv(其结合并共价连接洋地黄毒苷化化合物/有效载荷)。因此，二硫化物稳定化的单链Fv通过富含Gly和Ser的柔性连接肽连接至LeY抗体的CH3结构域的C-末端，产生具有两个LeY结合臂和额外地两个结合洋地黄毒苷的实体的四价分子。结合洋地黄毒苷的实体携带先前已经描述的VH44-VL100二硫键(例如Reiter,Y.等人,NatureBiotechnology14(1996)1239-1245)。结合洋地黄毒苷的实体额外地含有用于共价偶联的VH52bC突变。在SEQIDNO:17和SEQIDNO:18下列出编码这种LeY-Dig抗体衍生物的轻链和经修饰的重链的序列。这些双特异性分子由分子生物学技术产生，通过从培养的细胞分泌来表达，随后按照与上文描述的相同方式从培养上清液纯化。因此，可以产生含有靶向模块以及用于共价偶联半抗原化化合物/有效载荷的模块的双特异性抗体并纯化至均匀。实施例16含有Helicar基序氨基酸序列的肽YY肽YY是一种短(36个氨基酸)肽，由回肠和结肠中的细胞响应于摄食而释放。在人类中，其看起来降低食欲。循环PYY的最常见的形式是PYY3-36，其与Y受体家族中的Y2受体(Y2R)结合。PYY发现于胃肠道的粘膜中(尤其是在回肠和结肠中)的L细胞中。此外，少量的PYY(约1-10％)发现于食道、胃、十二指肠和空肠中。在循环中，PYY浓度在食物摄入后升高并且在禁食期间降低。PYY通过NPY受体发挥其作用；它抑制胃运动并增加结肠中的水和电解质吸收。PYY和PYY模拟物已被用来解决肥胖症。PYY被修饰以包含helicar基序氨基酸序列并由抗helicar基序氨基酸序列抗体复合以获得抗体的药物代谢动力学性质的优点并避免PYY的固有不稳定性。非共价复合物形成PYY3-36肽的结构研究(Nygaard,R.等人,Biochem.45(2006)83508357；SEQIDNO:26)揭示了关于中心氨基酸的螺旋基序(helicar样基序氨基酸序列)。由于N-末端的异亮氨酸和修饰的C-末端已被描述为对于所述肽的功能活性是必需的，因此对中心螺旋进行修饰以便反映helicar基序氨基酸序列中的氨基酸。通过转染两种质粒，在HEK293细胞中产生完整的IgG1抗helicar基序氨基酸序列抗体，所述两种质粒分别含有在载体中插入的重链和轻链的可变区，所述载体含有人IgG1恒定结构域和人λ恒定结构域。使用蛋白A层析，通过标准方法纯化抗helicar基序氨基酸序列抗体(0019)。质谱实验证实了抗体0019的身份。通过将小过量的肽施加至抗体溶液中，在体外获得抗体0019和经修饰的PYY肽PYY_helicar之间的复合物。形成复合物0052。复合物的化学计量通过SEC-MALLS分析实验确定为一个二价抗体上复合1.6个肽。测试抗体0019、PYY(3-36)野生型、PYY_helicar和复合物0052对Y2受体家族的作用。如所证明的(Hoffmann,E.等人,J.Cont.Rel.171(2013)48-56.)，由抗体复合的肽具有延长的体内半寿期。此外，令人惊讶的是，与非复合的肽相比，复合物对NPY2R受体表现出稍好的亲和力；抗体使多肽稳定，并使肽以其固定的生物学活性构象呈现。共价复合物形成(共价二硫键)为了增加抗helicar基序氨基酸序列抗体和含有helicar基序氨基酸序列的化合物之间的复合物的体外和体内稳定性，已使用结合时的二硫键形成。第一步是特异性识别步骤(高亲和力相互作用)，即，含有helicar基序氨基酸序列的化合物-抗helicar基序氨基酸序列抗体复合物的形成。这之后是第二步，通过二硫桥的自发改组以形成稳定性改善的共价复合物。由于12聚体肽(helicar基序氨基酸序列)是相对刚性的实体(至少当由特异性抗helicar基序氨基酸序列抗体复合时)，已经发现，关于二硫桥必须使用结构上特定的设计。由于复合物形成和随后实现的共价偶联是在两个重组产生的实体之间，用于形成共价二硫键的所引入的人工半胱氨酸残基并不一定作为游离半胱氨酸残基产生，而是以还原形式表达，即，与游离半胱氨酸或同型半胱氨酸氨基酸缀合。在抗helicar基序氨基酸序列抗体可变结构域的氨基酸序列中，引入人工游离半胱氨酸残基的位置是至关重要的。抗体可变结构域氨基酸序列中的非暴露半胱氨酸具有更大的概率表达为游离半胱氨酸(未缀合)，而靠近结合口袋的暴露的半胱氨酸残基可破坏12聚体肽(helicar基序氨基酸序列)的结合，这归因于由半胱氨酸与另外的部分(如游离半胱氨酸)缀合所导致的空间位阻。a)具有含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物的复合物为了鉴定具有最小的空间位阻风险和亲和力强烈降低风险的适当位置，已测试用于在helicar基序氨基酸序列中引入人工半胱氨酸残基的不同位置。已在12聚体(helicar基序氨基酸序列)的C-末端处引入半胱氨酸残基以使得互补位的主要部分不变。已合成这些肽并将它们融合至荧光基序。野生型:AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)半胱氨酸变体1:AHLENEVARCKK(SEQIDNO:02)->AHLENEVARCKK(5-Fluo)-OH半胱氨酸变体2:AHLENEVARLCK(SEQIDNO:03)->AHLENEVARLCK(5-Fluo)-OHxTFA在抗体上，已完成结构设计，以允许两种经设计的肽均形成二硫键，所述肽各自包含不同3D环境中的半胱氨酸。12聚体螺旋肽AHLENEVARLKK(helicar基序氨基酸序列)被建模入VH和VH结构域。在该肽的C-末端处，残基L10和K11被鉴定为可能的位置，并且，在轻链可变结构域中，根据Kabat的轻链编号的位置N55和G51被鉴定。抗helicar基序氨基酸序列抗体(0019)的重链可变结构域具有氨基酸序列：抗helicar基序氨基酸序列抗体(0019)的轻链可变结构域具有氨基酸序列：抗helicar基序氨基酸序列抗体(0155)的轻链可变结构域N55C变体具有氨基酸序列：抗helicar基序氨基酸序列抗体(0157)的轻链可变结构域N51C变体具有氨基酸序列：i)含有helicar基序氨基酸序列的化合物与抗体0155的共价缀合物在HEK293细胞中表达二价抗体0155，类似于没有游离半胱氨酸的其亲本分子Y2R(bck)-0019。使用用于抗体0019的相同方案纯化经修饰的抗体。质谱分析显示，去糖基化抗体的实验确定的质量为142,001Da。这超过计算的质量259Da。经还原的链具有48,167Da(完整重链，计算为48,168Da，Cys＝SH，C-末端＝-K)和22,720Da(完整轻链，N55C，计算为22,720Da，Cys＝SH)的实验确定的质量。链的序列在还原后得到了证实。使用100％DMF中的2.5摩尔过量的含有helicar基序氨基酸序列的化合物，将抗体0155与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2偶联，以形成共价复合物0156。在SDSpage(变性条件，参见图12)上，仅在抗体0155上看见荧光；在还原条件下，仅有小肽是可见的。结果：含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗helicar基序氨基酸序列抗体的共价缀合是成功的。总共约43％的抗helicar基序氨基酸序列抗体与两个helicar基序氨基酸序列共价缀合，约40％的抗helicar基序氨基酸序列抗体与一个helicar基序氨基酸序列共价缀合，并且，约17％的抗helicar基序氨基酸序列抗体未缀合。包含两个helicar基序氨基酸序列的缀合物被修改成约50％。关于定量没有考虑该种类。正如已经关于起始材料所确定的，不具有helicar基序氨基酸序列的抗体含有两个约128Da的修饰。与一个helicar基序氨基酸序列缀合的抗体仅具有一个约128Da的修饰。ii)含有helicar基序氨基酸序列的化合物与抗体0157的共价缀合物类似于抗体0155的是抗体0157，其主要表达为半胱氨酸化形式。质谱分析显示，去糖基化抗体的实验确定的质量是141,863Da。这超过计算的质量3Da。抗体主要作为单或双同型半胱氨酸化形式存在。经还原的链具有48,168Da(完整重链，计算为48,168Da，Cys＝SH，C-末端＝-K)和22,777Da(完整轻链，N51C，计算为22,777Da，Cys＝SH)的实验确定的质量。链的序列在还原后得到了证实。抗体0157与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶联没有得到预期的共价复合物。在预期的泳道中没有看到荧光，但是在此实验中本来应该是阴性的参考上看到了荧光(参见图13)。孵育抗体0157与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1。作为对照，孵育抗体0019与相同的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1。结果：含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗helicar基序氨基酸序列抗体的共价缀合未成功。不受该理论束缚，我们假设，在这种情况下，抗体半胱氨酸化在结合口袋中太深了，以至于不允许含有helicar基序氨基酸序列的荧光化合物有效地结合并在适当位置中递送亲核巯基以进攻C51。b)具有含有helicar基序氨基酸序列的重组多肽的复合物当考虑与重组产生的含有helicar基序氨基酸序列的多肽形成共价复合物时，基于helicar的方法变得特别有吸引力。由于含有VL-N55C突变的抗体0155与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQIDNO:02)的缀合与备选方案(VL上的G51C与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2(AHLENEVARCKK；SEQIDNO:03))相比已表现得好得多，因此进一步研究了0155与含有helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的多肽的缀合。多肽所含有的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQIDNO:02)融合至N-末端。缺失C-末端赖氨酸残基的、含有helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的假单胞菌外毒素分子LR8M(0236；SEQIDNO:28)已在大肠杆菌中产生，并且使用阴离子交换层析和SEC的组合进行纯化(参见，例如，WO2011/032022)。将抗体0155与SEQIDNO:28的、缺失C-末端赖氨酸残基的、含有helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的假单胞菌外毒素分子LR8M共价缀合。SEC层析图示于图14。对于非还原样品，通过SDS-CE,Caliper分析缀合效率(参见图15)。总共约4％的抗helicar基序氨基酸序列抗体与两个SEQIDNO:28的多肽共价缀合，约41％的抗helicar基序氨基酸序列抗体与一个SEQIDNO:28的多肽共价缀合，并且，约55％的抗helicar基序氨基酸序列抗体未缀合。总之，抗helicar基序氨基酸序列单克隆抗体可以通过高亲和力识别12聚体helicar基序氨基酸序列用于复合肽、具有肽接头的小分子和重组蛋白。具有折叠为螺旋的倾向的肽可被修饰以模仿原始12聚体helicar基序氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQIDNO:01)并且此后与抗helicar基序氨基酸序列单克隆抗体可复合。除高亲和力复合之外，用含有半胱氨酸的SEQIDNO:01的半胱氨酸变体和在CDR中含有半胱氨酸的经修饰的抗helicar基序氨基酸序列抗体经由形成稳定二硫键能够实现共价缀合。由不同的系统表达的重组蛋白可以随后体外缀合，而无需特别的反应条件，而是通过自发的二硫桥改组。