人参皂苷compoundK在制药中的用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及人参皂苷compound K在制药中的用途，提供一种通过微生物转化技术获得的稀有人参皂苷compound K在制备预防和治疗骨质疏松及其他与Wnt/β-catenin信号通路相关的疾病的药物中的新用途。

背景技术：

现有技术公开了人参皂苷compound K(C-K，20-O-β-D-glucopyranosyl-20-(S)-protopanaxadiol)属二醇型人参皂苷，在天然的人参干燥根中不存在，仅在三七和人参果中微量存在(约0.03％)，属于稀有人参皂苷，其结构如下式所示，然而，研究显示，C-K是其它含量丰富的天然二醇型人参皂苷如Rb1、Rb2、Rc等在人肠道内的主要肠道菌代谢产物，其是真正吸收和发挥活性作用的实体，从而成为近几年人参皂苷研究的前沿。本申请的发明人在前期研究中建立了通过微生物转化技术获得人参皂苷C-K的专利技术(ZL200410018000.0)，并发现了其抗类风湿性关节炎的新生物活性(ZL200610116197.0)。但迄今为止，尚未见有关所述的C-K在Wnt/β-catenin信号通路中的作用以及在预防和治疗骨质疏松的研究和应用的报道。鉴于此，本申请的发明人拟提供人参皂苷compound K在制药中的新的用途，尤其涉及人参皂苷compound K在制备预防和治疗骨质疏松及其他与Wnt/β-catenin信号通路相关的疾病的药物中的新用途。

与本发明相关的现有技术有：

[1]Liu KK,Wang QT,Yang SM,et al.(2014).Ginsenoside compound K suppresses the abnormal activation of T lymphocytes in mice with collageninduced arthritis.Acta Pharmacologica Sinica,3,599–612.

[2]Li J,Zhong W,Wang WW,et al.(2014).Ginsenoside metabolite compound K promotes recovery of dextran sulfate sodium-Induced colitis and inhibits inflammatory responses by suppressing NF-kB activation.Plose One,9,2,e87810.

[3]Mathiyalagan R,Subramaniyam S,Kim YJ,et al.(2014).Ginsenoside compound K-bearing glycol chitosan conjugates:Synthesis,physicochemical characterization,and in vitro biological studies.Carbohyd Polym,112,359-66.

[4]Hu C,Song G,Zhang B,et al.(2012).Intestinal metabolite compound K of panaxoside inhibits the growth of gastric carcinoma by augmenting apoptosis via Bid-mediated mitochondrial pathway.J Cell Mol Med,16,96-106.。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供人参皂苷compound K在制药中的新的用途，尤其涉及人参皂苷compound K在制备预防和治疗骨质疏松及其他与Wnt/β-catenin信号通路相关的疾病的药物中的新用途。

本发明中，通过微生物转化技术获得式(Ⅰ)的稀有人参皂苷compound K，

本发明中，进行了体外实验，通过对MC3T3-E1细胞(成骨前体细胞)增殖的影响实验，结果显示，所述C-K对MC3T3-E1的增殖无显著性作用；通过对碱 性磷酸酶(ALP)和I型胶原蛋白(Collagen I)的影响实验，结果显示，C-K具有显著促进MC3T3-E1细胞对成骨分化标记物-碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原蛋白(Collagen I)的表达的能力，表明其具有诱导成骨细胞分化的作用；通过对Wnt信号的作用实验，结果显示，C-K对对Wnt10b和Wnt11的mRNA水平有明显的上调作用；通过对Wnt通路中下游信号的作用实验，结果表明，C-K对这些信号基因均具有显著上调作用，证明其对Wnt/β-catenin信号通路具有显著正向调节活性，具有促进成骨细胞分化的作用；本发明中进行了动物实验，实验结果显示，对炎症引起的骨质破坏，经C-K干预后，具有逆转骨质破坏、促进骨滑膜细胞增殖的作用，C-K对炎症引起的骨质破坏具有明显的保护作用。

本发明提供了人参皂苷compound K在制药中新的的用途，进一步，可用于制备预防和治疗骨质疏松的药物，及其他与Wnt/β-catenin信号通路相关的疾病的药物。

附图说明

图1显示了C-K对MC3T3-E1(成骨前体细胞)的增殖无显著性作用。

图2显示了C-K对碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原蛋白(Collagen I)的影响。

图3显示了C-K对Wnt信号的作用。

图4显示了C-K对Wnt通路中下游信号的作用。

图5显示了C-K对炎症引起的骨质破坏能逆转骨质破坏、促进骨滑膜细胞增殖作用。

具体实施方式

实施例1：C-K对MC3T3-E1细胞增殖的影响

取96孔细胞培养板，每孔接种MC3T3-E1细胞(成骨前体细胞)1×10⁴/孔，贴壁后加入含有不同浓度人参皂苷C-K(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0uM)的MEM-α培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔2-3天换液，培养4天和7天，MTT法检测细胞凋亡情况，酶标仪上选择以490nm为检测波测定光密度 值(OD值)，计算细胞的存活率，结果显示，C-K对MC3T3-E1的增殖无显著性作用。

实施例2：C-K对碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原蛋白(Collagen I)的影响

取24孔细胞培养板，每孔接种MC3T3-E1细胞(成骨前体细胞)1×10⁷/孔，贴壁后加入含有不同浓度人参皂苷C-K的条件培养基(含有50uM维生素C及10mMβ甘油磷酸钠)，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔2-3天换液，培养4天和7天，吸去培养基，生理盐水洗涤3次，每孔加入200ul裂解液(1％Triton X-100，0.1％SDS)裂解细胞，10000rpm离心10min，取上清液待测，按照ALP检测试剂盒检测ALP含量，以BCA试剂盒检测蛋白含量，计算每克蛋白中ALP活力单位；

以相同方法培养4天后，吸去培养基，细胞以PBS洗涤3次，每孔加入0.5ml Trizol提取总RNA，逆转录试剂盒制备cDNA(PrimeScript RT Master Mix)，RT-qPCR法检测ALP及Coln I mRNA转录水平(GAPDH为内参，PrimeScript RT reagent Kit)；

结果显示，C-K具有显著促进MC3T3-E1细胞对成骨分化标记物-碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原蛋白(Collagen I)的表达的能力，表明其具有诱导成骨细胞分化的作用。

实施例3：C-K对Wnt信号的作用

同样以药物处理4天的细胞提取总RNA，并运用PT-qPCR方法检测各种亚型Wnt基因的mRNA转录水平(GAPDH为内参)，结果显示，C-K对Wnt10b和Wnt11的mRNA水平有明显的上调作用。

实施例4：C-K对Wnt通路中下游信号的作用

同样以药物处理4天的细胞提取总RNA，对Wnt信号通路中成骨细胞分化的关键信号分子Lrp5、β-catenin和Runx2的mRNA水平进行了分析，结果表明，C-K对这些信号基因均具有显著上调作用，证明其对Wnt/β-catenin信号通路 具有显著正向调节活性，具有促进成骨细胞分化的作用。

实施例5：C-K对炎症引起的骨质破坏有明显的保护作用

将II型胶原溶解在0.1mol/L的醋酸溶液中，浓度为2mg/ml，1：1滴入冷的不完全弗氏佐剂中，雄性SD大鼠背部5点皮内注射免疫，每点0.1ml，7天后同样方法免疫1次，首次免疫后开始给药，人参皂苷C-K10mg/kg，po，Enbrel9mg/kg，sc，对照组，生理盐水，po，8天后停止给药，29天结束实验，取足踝关节作病理检查；实验结果显示：经C-K治疗后，显示了其逆转骨质破坏、促进骨滑膜细胞增殖的作用。